Summary
Her etablerer vi en rottemodell av lacrimal kjerteldysfunksjon for å gi grunnlag for studiet av vandig mangelfull tørr øye.
Abstract
Vandig mangelfull tørr øye (ADDE) er en type tørr øyesykdom som kan resultere i reduksjon av tårsekresjonsmengde og kvalitet. Langvarig unormal tåreproduksjon kan føre til forstyrrelse i det okulære overflatemiljøet, inkludert hornhinneskader og betennelser. I alvorlige tilfeller kan ADDE forårsake synstap eller til og med blindhet. For tiden er tørr øyebehandling begrenset til øyedråper eller fysioterapi, som kun kan lindre øye ubehag symptomer og kan ikke fundamentalt kurere tørrøysyndrom. For å gjenopprette funksjonen til lacrimal kjertelen i tørr øye, har vi laget en dyremodell av lacrimal kjertel dysfunksjon hos rotter indusert av skopolamin. Gjennom den omfattende evalueringen av lacrimal kjertelen, hornhinnen, konjunktivene og andre faktorer, tar vi sikte på å gi en full forståelse av de patologiske endringene i ADDE. Sammenlignet med den nåværende tørre øyemusmodellen, inneholder denne ADDE-dyremodellen en funksjonell evaluering av lacrimal kjertelen, noe som gir en bedre plattform for å studere lacrimal kjertel dysfunksjon i ADDE.
Introduction
I 2021 er omtrent 12% av mennesker betydelig påvirket av tørre øyne1, noe som gjør det til en av de vanligste kroniske øyesykdommene. Tørre øyne kan deles inn i to typer: vandig mangelfull tørre øyne (ADDE) og fordampende tørre øyne (EDE)2, avhengig av de forskjellige faktorene som påvirker sykdommen. ADDE deles videre inn i Sjögrens syndrom (SS) og ikke-SS, men flertallet av tørre øyepasienter er ikke-SS-pasienter i klinisk3. Kroniske symptomer på tørre øyne påvirker pasientens visuelle kvalitet alvorlig. For tiden innebærer konvensjonell behandling av DED påføring av kunstige tårer for å smøre den okulære overflaten og fysioterapi av øyelokkene. Imidlertid kan tørrøysyndrom ikke gi en fullstendig kur i mange tilfeller. Derfor er studier av patogenesen av tørr øyesykdom avgjørende for utviklingen av nye terapier og rusmidler. Dyremodeller av tørrøysyndrom gir grunnlag for videre forskning.
Det er mange måter å konstruere dyremodeller av tørrøysyndrom4, inkludert endring av tårsekresjonsnivåer ved å endre hormonnivåer. For eksempel kan fjerning av testikler av rotter redusere androgensekresjon, øke tårsekresjon og redusere konsentrasjonen av fri sekretorisk komponent (SC) og IgA i tårer 5,6. En annen metode er å indikere autoimmune reaksjoner i lacrimal kjertelen ved å fjerne øyeoverflaten nerver som styrer kjertelen. I tillegg kan direkte reduksjon av tåresekresjon oppnås ved kirurgisk fjerning av lacrimalkjertel 7. Endrede miljøforhold kan også akselerere tårefordampning. For eksempel kan dyrking av dyr i lav luftfuktighet og tørre ventilasjonsforhold etablere en modell av overdreven fordampende tørr øye8, som kan kombineres med andre metoder for å øke alvorlighetsgraden av tørre øyne. De viktigste stoffene som brukes til å indusere eksperimentelle modeller med tørre øyne er atropin og skopolamin9. Som parasympatiske hemmere kan begge indusere farmakologisk blokade av kolinerge (muskarinerge) reseptorer i tårekjertelen og hemme tåresekresjon. Sammenlignet med tørre øyne forårsaket av atropin muskelinjeksjon10, har skopolamin en sterkere hemmende effekt på sekresjonskjertler, lengre varighet av legemiddelvirkning og svakere effekter på hjerte-, tarm- og bronkialglatte muskler. Det er et av de mest modne stoffene for tørre øyedyrmodeller.
Ulike metoder kan brukes til å indusere tørre øyne med skopolamin, for eksempel subkutan injeksjon, legemiddelpumpe eller patchapplikasjon 4,11,12. For å redusere hyppigheten av legemiddeladministrasjon til eksperimentelle dyr, bruker mange forskere depotplaster til musens haler eller bruker legemiddelpumper. Begge disse metodene har imidlertid begrensninger. For eksempel må absorpsjonen av depotplastre ta hensyn til den individuelle absorpsjonen av mus, noe som kan føre til inkonsekvent legemiddeldosering. Selv om legemiddelpumper nøyaktig kan kontrollere doseringen av hver administrasjon, er de ikke alltid kompatible med stoffet som leveres eller konsentrasjonen som brukes. De må også plasseres kirurgisk - noe som er mer invasivt for dyret, og krever en bedøvelseshendelse, og det er potensial for postkirurgiske komplikasjoner som dehiscens. Subkutan injeksjon, selv om det er mer tungvint, kan sikre nøyaktig dosering for hver administrering og opprettholde konsistens i legemiddeladministrasjon blant forskjellige rotter. Samtidig har den lavere kostnader og er egnet for å gjennomføre et stort antall dyreforsøk.
Denne studien gjelder gjentatt subkutan injeksjon av skopolamin for å etablere en tørr øyerottemodell. Vi analyserer indikatorer for tørre øyne som hornhinnedefekter, tåresekresjonsnivåer og patologisk morfologi av hornhinnen, konjunktivene og lacrimal kjertelen. Ved å kombinere legemiddelkonsentrasjon, patologiske manifestasjoner og symptomer på tørre øyne, utdyper vi videre den tørre øyerottemodellen i detalj, og gir mer nøyaktige eksperimentelle data for studiet av tørr øyebehandling og patologiske mekanismer. Vi beskriver også modelleringsprosessen i detalj for fremtidige forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk utført etter denne protokollen utføres under godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Dyr forberedelse
- Forbered 12 sunne 6 uker gamle SPF Wistar hunnrotter som veier 160 g ± 20 g.
- Bruk en spaltelampe og oftalmoskop for å undersøke øyeforholdene til alle rotter, slik at det ikke er noen fremre segment- eller retinale sykdommer.
- Løft alle rotter i 1 uke med tilstrekkelig mat og vannkilder.
- Tilfeldig delt alle rotter inn i normal, skopolamin legemiddelkonsentrasjon 2,5 mg / ml, skopolamin legemiddelkonsentrasjon 5 mg / ml og skopolamin legemiddelkonsentrasjon 7,5 mg / ml grupper, med tre dyr i hver gruppe.
2. Forberedelse av løsning
- Klargjør skopolaminhydrobromid ved å oppløse det i 0,9 % natriumkloridoppløsning for å lage en oppløsning med konsentrasjoner på 7,5 mg/ml, 5 mg/ml og 2,5 mg/ml.
- Klargjør en 0,9 % natriumkloridoppløsning uten skopolaminhydrobromid som skal brukes som injeksjon for kontrollgruppen av rotter.
3. Forberedelse av utstyr og materiale
- Forbered et lite dyrmikroskop.
- Forbered materialer for forsøket, inkludert 1 ml engangssprøyte med nål (26 G); fluorescein natrium oftalmiske strimler; Schirmer tåre teststrimmel; absolutt etanol; 4% paraformaldehyd; Xylen; nøytral balsam; hematoksylin, eosin; og periodisk syre-Schiff farging kit.
4. Subkutan injeksjon
MERK: Denne prosedyren krever hjelp fra en annen person for å sikre rottene.
- Hold rottens kropp stødig og fang og strekk venstre (eller høyre) bakben.
MERK: En assistent kan hjelpe til med å holde dyret. - Rengjør injeksjonsstedet med alkohol.
- Sett inn 1 ml engangssprøyte med kanyle (26 G) nederst i hudfolden mellom tommel og finger.
- Aspirer sprøyten ved å trekke tilbake sprøytestempelet. Ethvert blod i sprøyten indikerer feil nålplassering; Fjern og plasser kanylen på nytt.
- Administrer 0,9 % natriumkloridoppløsning med eller uten skopolaminhydrobromid i en jevn, flytende bevegelse.
- Injiser alle rotter i henhold til forskjellige konsentrasjoner, med 0,5 ml injisert hver gang og fire ganger daglig (kl. 9:00, 12:00, 15:00 og 18:00) i en sammenhengende periode på 19 dager, vekslende mellom venstre og høyre lemmer.
MERK: Gruppene har følgende navn:
Gruppe uten skopolaminhydrobromid: 0 gruppe (kontroll)
Gruppe med skopolaminhydrobromid 2,5 mg/ml: 2,5 gruppe
Gruppe med skopolaminhydrobromid 5 mg/ml: 5 gruppe
Gruppe med skopolaminhydrobromid 7,5 mg/ml: 7,5 gruppe - Sett dyret tilbake i buret og overvåk pust og oppførsel i 5-10 minutter.
5. Tåresekresjonstest (Schirmer tåretest, STT)
- Lag en modifisert filterpapirstrimmel for rotter11. Klipp halvparten av filterpapirstrimmelen som brukes til mennesker langs midtlinjen (1 mm × 15 mm), og trim hodet på stripen for å gjøre det glatt.
MERK: Før du utfører tåresekresjonstesten, må du manuelt begrense rottens kropp for å forhindre bevegelse og sikre eksponering av rottens øyne. - Plasser filterpapirstrimmelen på den ytre 1/3 av rottens nedre øyelokks konjunktivalsekk.
- Ta testen i 5 min. Kontroller lukkingen av rottens øyne gjennom hele prosedyren.
- Etter måling, bruk pinsett til å klemme filterpapirstrimmelen inn i et mikrosentrifugerør og registrere tårevolumet ved å lage et merke på veggen av røret.
- Mål tåresekresjon på dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 og dag 19.
6. Fluoresceinfarging av hornhinnen
- Slipp 0,5 μL 0,5% fluoresceinnatriumoppløsning i den nedre konjunktivalsekken til hver rotte.
- Observer hornhinnen under blått lys i 3 minutter etter fluoresceininnånding.
- Registrer fluorescensfargingen av hver rottes hornhinne og observer om det er en hornhinnedefekt.
- Utfør hornhindefluoresceinfarging på dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 og dag 19.
7. Histologisk observasjon av konjunktivvev
- Etter å ha fullført modellutviklingen, bedøv rottene dypt med en intraperitoneal injeksjon på 0,4 ml / 100 g 10% vandig kloralhydrat for å lindre dyrets spenning. Deretter avlive rottene ved cervikal dislokasjon.
- Ta bulbar conjunctiva fra de samme områdene av hver rotte, med en størrelse på ca. 2 mm x 2 mm.
- Fest vevet umiddelbart i 4% paraformaldehyd i 24 timer og legg det inn i parafin13.
- Klipp 5 μm tykkelsesseksjoner og beis med hematoksylin og eosin (HE)14 og periodisk syre-Schiff (PAS) flekk (følg produsentens instruksjoner).
8. Histologisk observasjon av hornhinne og lacrimal kjertelvev
- Etter å ha fullført modellutviklingen, avlive rotta som beskrevet i trinn 7.1.
- Ta hornhinnen på høyre side av hver rotte og fest den umiddelbart i 4% paraformaldehydoppløsning.
- Klipp cephalic epidermis og subkutant vev langs linjen som forbinder øret og det ytre hjørnet av øyet, utvid snittet til begge sider og isoler den gulaktige ekstra orbitalkjertelen ytterligere.
- Fjern rottens pels grundig og skill den ekstraorbitale kjertelen med 0,9% natriumkloridoppløsning.
- Plasser de isolerte ekstraorbitale kjertlene i 4% paraformaldehydoppløsning i 24 timer og legg inn i paraffin.
- Klipp kontinuerlige seksjoner på ~ 5 μm tykkelse og flekk dem med HE for hornhinne og ekstraorbitale kjertelvevsprøver.
9. Statistisk analyse
- Bruk egnet programvare for statistisk analyse av dataene.
- Utføre enveis variansanalyse (ANOVA) for å analysere dataene og minst signifikant forskjell (LSD) test for sammenligning mellom grupper. Sett det statistiske signifikansnivået til α = 0,05, med P < 0,05 som indikerer statistisk signifikans.
MERK: SPSS 20-programvaren ble brukt til statistisk analyse av eksperimentelle data.
- Utføre enveis variansanalyse (ANOVA) for å analysere dataene og minst signifikant forskjell (LSD) test for sammenligning mellom grupper. Sett det statistiske signifikansnivået til α = 0,05, med P < 0,05 som indikerer statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schirmer Jeg tester, SIT I
Tårevolumet til rottene ble målt på dagene 0, 3, 5, 7, 11, 15 og 19 etter starten av forsøket. De eksperimentelle resultatene viste at tåresekresjonen av skopolamingruppen (2,5 gruppe, 5 gruppe, 7,5 gruppe), sammenlignet med kontrollgruppen (0 gruppe), var signifikant redusert, og forskjellen var statistisk signifikant (P < 0,01). Det var ingen statistisk signifikans mellom 2,5-gruppen, 5-gruppen og 7,5-gruppen (P > 0,05). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom de ulike gruppene når det gjaldt antall dager (P > 0,05) (figur 1, tabell 1).
Korneal fluoresceinfarging
Fluoresceinfarging av hornhinnen ble utført på dagene 0, 3, 5, 7, 11, 15 og 19 i forsøket. Resultatene viste at det ikke var noen hornhinnefluoresceinfarging i noen gruppe, noe som indikerer at ingen åpenbare hornhinneepiteldefekter ble dannet under det 20-dagers eksperimentet med forskjellige konsentrasjoner av skopolaminmedikamenter (figur 2).
Patologisk analyse av hornhinneepitel
Etter forsøket ble hornhinnevev fra hver rotte samlet for HE-farging for å observere morfologien til hornhinneepitelet og måle tykkelsen på hornhinneepitellaget. Hornhinneepitelet i kontrollgruppen var sammensatt av 4-6 lag ordnede anordnede epitelceller, blant hvilke basallaget besto av et enkelt lag av kolonneepitelceller arrangert pent og tett. Hornhinneepitelet i skopolamingruppene 2,5, 5 og 7 var signifikant tynnere enn kontrollgruppen, med flat og atrofisk cellemorfologi og uordnet cellestruktur. I gruppe 7.5 var det en løs intercellulær forbindelse og vakuolær struktur i basallaget (indikert med rød pil i figur 3). Sammenliknet med hornhinneepitelet i skopolamingruppene viste hornhinneepitelet i normalkontrollgruppen statistiske forskjeller i tykkelsen på hornhinneepitellaget (figur 4).
Patologisk analyse av lacrimal kjertel
Hovedkjertelen for tåresekresjon hos rotter er den ekstrorbitale lacrimal kjertelen15. Ved observasjon av lacrimal kjertelskiver ble endringer i morfologien til lacrimal kjertelepitelceller observert med økning av skopolaminkonsentrasjon, ledsaget av betennelse og vevsødem. Ingen slike endringer ble observert i kontrollgruppen. Patologiresultatene tyder på at inflammatoriske forandringer i tårekjertelen, celleødem og atrofi i kjertelepitelcellene kan brukes som indikatorer for funksjonell skade på tårekjertelen16 (tabell 2). Disse indikatorene kan brukes til å måle alvorlighetsgraden av tørre øyne i forhold til mengden tåresekresjon (figur 5).
Analyse av konjunktivfargeresultater
Strukturen av konjunktivene i kontrollgruppen er komplett, hovedsakelig sammensatt av overflatelaget og lamina propria. Overflatelaget er laminerte søyleepitelceller, glatte og komplette, med mikrovilli på celleoverflaten. Spredte begerceller var tilstede mellom epitelcellene, med stort cellevolum og slimete granulater i cellecytoplasma. Overflatelaget av konjunktivepitelet i de tre skopolaminmedikamentgruppene var signifikant tynnere, antall mikrovilli og begerceller ble redusert, cellearrangementstrukturen var ufullstendig, ledsaget av ødem og en liten mengde inflammatoriske celler som observert ved HE-farging (figur 6).
Ved å farge bindehinnen med PAS ble gjennomsnittlig antall begerceller per 40x mikroskopisk felt i tre uavhengige prøver av hver mus beregnet og uttrykt som gjennomsnitt ± SD (figur 7).
Figur 1: Statistikk over Schirmers testverdi i hver gruppe (mm) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fluoresceinnatriumfarging av hornhinnen hos rotter. I det 20-dagers eksperimentet med fluoresceinnatrium ble det ikke observert positive funn i hornhinnene hos alle rotter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Farging av hornhinneepitel og tykkelse. I gruppe 7.5 var det løs intercellulær forbindelse og vakuolær struktur i basallaget (indikert med rød pil) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Statistikk over hornhinneepiteltykkelse i hver gruppe. Sammenlignet med hornhinneepitelet av skopolamingrupper, viste hornhinneepitelet i den normale kontrollgruppen statistiske forskjeller i tykkelsen av hornhinneepitellaget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: HE-fargingsresultater av den ekstroorbitale lacrimalkjertelen hos rotter. (A) Gruppe 0: I synsfeltet viste lacrimal kjertler lobulær struktur og var sammensatt av kanaler og rørformede kjertler, uten åpenbare abnormiteter i kanalens morfologi, mens de rørformede kjertlene var sammensatt av kegleformede kjertelceller med rikelig slimete stoffer i cytoplasma, Ingen åpenbare ødem i bindevev, ingen åpenbare abnormiteter i interstitielle blodkar, og ingen åpenbar nekrose og inflammatorisk celleinfiltrasjon. (B) Gruppe 2.5: I synsfeltet observeres sporadisk atrofi av lacrimal kjertelepitelceller, med redusert volum, uregelmessig formede dilaterte kjertelhulrom og redusert mucinøs substans i hulrommet (indikert med den røde pilen). Det er også sporadisk infiltrasjon av frie lymfocytter i stroma (indikert med blå pil), men ingen åpenbare abnormiteter i kanalmorfologien eller tegn på ødem observeres. (C) Gruppe 5: I synsfeltet ble lakrimale epitelceller tidvis atrofiert og redusert i størrelse, kjertelhulen ble forstørret, slimhinnen i hulrommet ble redusert (rød pil), og fri lymfocyttinfiltrasjon ble tidvis observert i stroma (blå pil), og det ble ikke observert åpenbare avvik i kanalmorfologi eller bindevevsødem mellom lakrimale kjertellobuler. (D) Gruppe 7.5: Ødem kan ses i synsfeltet; avstanden mellom lacrimal kjertlene er utvidet, og arrangementet er uregelmessig (grønn pil), epitelceller i lacrimal kjertlene er ofte atrofiert, volumet blir mindre, og formen er uregelmessig (gul pil), noen ganger blir kjertelhulen forstørret, slimete materiale i hulrommet reduseres (rød pil), noen ganger er den frie lymfocytten infiltrert (blå pil), uten tilsynelatende abnormiteter i kanalmorfologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: HE-farging av rottekonjunktiv. Sammenliknet med kontrollgruppens konjunktivepitel viste alle tre gruppene skopolaminmedisinert konjunktivepitel varierende grad av strukturell skade. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: PAS-farging av bindehinnen. (A) Normale kontrollrotter. (B) skopolamingruppe rotter. (C) Begercelletetthet i hver gruppe (20x). Svart søyle = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Schirmer I-test, SIT(middelverdi, enhet [mm]) | |||||||
| Gruppe | 0 dager | 3 dager | 5 dager | 7 dager | 11 dager | 15 dager | 19 dager |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabell 1 Schirmertest av rotter i de fire gruppene ved ulike tidspunkter (mm). Etter medisinering reduserte sekresjonen av tårer hos rotter betydelig.
| Nummer | Nekrose | Betennelse | Ødem | Epitelial atrofi |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 GRP -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 GRP -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 GRP -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 GRP -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 GRP -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 GRP -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 GRP -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 GRP -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 GRP -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabell 2: Patologisk vevsskår hos rotte lacrimal kjertel. Skåringskriterier: 0: Under normale forhold, med tanke på faktorer som dyrs alder, kjønn og belastning, anses vevet som normalt;
1: De observerte endringene har nettopp overskredet normalområdet; 2: Lesjoner kan observeres, men de er ennå ikke alvorlige; 3: Lesjoner er tydelige og fortsetter å forverres; 4: Lesjonene er ekstremt alvorlige og har påvirket hele vevet16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vandig mangelfull tørr øye (ADDE) er en viktig type tørr øye, som står for ca 1/3 av den totale tørre øyepopulasjonen17, og hovedårsaken til ADDE er lacrimal kjertel patologisk skade og betennelse13. For denne typen tørre øyne er de vanligste kliniske behandlingsmetodene kunstige tårer for å lindre symptomer eller aktuell bruk av steroider eller ciklosporin18, mens det er få behandlingsalternativer for skade på lacrimal kjertelen. Derfor er det svært viktig å utforske virkningen av rekonstruksjon av lacrimal kjertelfunksjon på tørre øyne og etablere en dyremodell av lacrimal kjertel dysfunksjon. Vi brukte en metode for gjentatt bruk av medisiner for å undertrykke sekresjonen av lacrimal kjertelen hos rotter og opprettet en kronisk lacrimal kjertel dysfunksjon tørr øye dyremodell.
Vi valgte rotter for å konstruere denne tørre øyemodellen, som har flere fordeler sammenlignet med andre dyremodeller19. For eksempel har kaniner en større kroppsstørrelse og krever flere doser medisinering eller hyppigere injeksjoner for å oppnå ønsket effekt. Dessuten er kaniner litt dyrere, noe som betyr flere kostnader for forsøket. Mus brukes også ofte i oftalmisk forskning, men de brukes vanligvis til å konstruere Sjögrens syndrommodeller20. Disse modellene fokuserer på å sammenligne organbetennelse og lymfocyttinfiltrasjon for å utforske immunpatologiske mekanismer. Mus har små kroppsstørrelser, kompleks lacrimal kjertel anatomi og lav tåre sekresjon, noe som gjør det vanskelig å reflektere tåreproduksjon nøyaktig. Rottedyrmodellen er en mer egnet tørrøymodell da den muliggjør praktiske legemiddelinjeksjoner, har relativt enkle fôringsforhold, er egnet for både kliniske og eksperimentelle studier, og har også fordeler når det gjelder kostnad. Det er en god dyremodell for ADDE.
Vi brukte den kolinerge reseptorblokkeren skopolamin for å hemme de kolinerge reseptorene i rottens kropp, redusere lacrimal kjertel sekresjon og endre den patologiske strukturen av lacrimal kjertelceller, som fundamentalt simulerer tilstanden av lacrimal kjertler hos tørre øyepasienter. Sammenlignet med andre metoder, simulerer denne tilnærmingen bedre den skadede tilstanden til lacrimal kjertler i naturlig tilstand. Andre metoder, som å bruke benzalkoniumklorid øyedråper21 eller endre ytre forhold som å redusere fuktighet og øke okulær overflatefordampning 4,8, forstyrrer bare det okulære overflatemiljøet og endrer ikke den funksjonelle tilstanden til tårekjertelen. Derfor er de ikke egnet for langvarige, kroniske tørre øyeforhold.
Ved å måle sekresjonsvolumet av tårer hos rotter, forbedret vi Schirmer-tårteststrimlene. Først kuttet vi tåreteststrimmelen som brukes av mennesker langs midtlinjen. Deretter trimmet vi toppen til en rund bueform og brettet den forsiktig tilbake på toppen for å lette enkel innsetting i rottens nedre konjunktivalsekk. Det skal bemerkes at rotter er aktive og vanskelige å måle tårer i 5 minutter. Etter å ha satt inn Schirmers tåreteststrimmel i rottens nedre konjunktivalsekk, lukket vi rottens øyne manuelt for å øke komforten og unngå å slite under den lange målingen av tårer, noe som kan påvirke måleresultatene.
Mens du trekker ut lacrimal kjertelen, er det nødvendig først å finne den. Poenget med lacrimal kjertel lokalisering er midtpunktet mellom forsiden av øret og den indre canthus. Deretter kutter du hudvevet under pelsen, minimerer innføringen av fragmentert pels og reduserer håndteringsprosessen i senere stadium. Under utvinningsprosessen er det også viktig å rydde opp den fragmenterte pelsen i tide. Spesielt når du separerer lacrimal kjertelen, bruk fosfatbufret saltvann (PBS) eller saltvann for å skylle gjentatte ganger og unngå å blande med andre vev som kan påvirke seksjoneringsresultatene.
Fordelen med den utviklede tørrøyedyrmodellen er at protokollen korrelerte forskjellige legemiddelkonsentrasjoner med forskjellige grader av lacrimal kjertelskade. Dette gir et eksperimentelt grunnlag for studiet av behandling av lacrimal kjertel dysfunksjon. Vi har raffinert noen av de operative trinnene i modelleringsprosessen for å gi mer detaljert referansemateriale for en forsker. I tillegg har vi lagt til analyseindikatorer for tørrøydyrmodellen, som inneholder morfologiske indikatorer på hornhinnen, konjunktivene og lacrimal kjertelen, teller konjunktivceller og scorer graden av lacrimal kjertelskade. Vi evaluerte lacrimal kjertelfunksjon fra betennelse, ødem og atrofi. Vi har valgt de mest omfattende, kostnadseffektive og nøyaktige analysemetodene for å gjenspeile graden av tørre øyne og tårekjerteldysfunksjon.
Vår metode har imidlertid også visse begrensninger. På grunn av den lange prosessen med å konstruere dyremodeller, må eksperimenter injisere gjentatte ganger. Selv om det for tiden er noen metoder for å erstatte manuelle injeksjoner, for eksempel legemiddelpumper eller depotplastre, er det fortsatt noen komplikasjoner i bruken. Hvordan bruke bedre metoder for å redusere hyppigheten av medisinering, unngå forekomst av komplikasjoner, og sikre nøyaktigheten av doseringen er vårt neste mål. Til slutt har vi forbedret en tørr øyedyrmodell forårsaket av skopolamininjeksjon, noe som gir et eksperimentelt grunnlag for forskning på lacrimal kjertel dysfunksjon i ADDE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen potensielle interessekonflikter knyttet til stoffene og materialene som brukes i denne prosedyren.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) og Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
