Summary
Aquí, establecemos un modelo de rata de disfunción de la glándula lagrimal para proporcionar una base para el estudio del ojo seco con deficiencia acuosa.
Abstract
El ojo seco por deficiencia acuosa (ADDE) es un tipo de enfermedad del ojo seco que puede resultar en la reducción de la cantidad y calidad de la secreción lagrimal. La producción anormal prolongada de lágrimas puede provocar una alteración en el entorno de la superficie ocular, incluido el daño e inflamación de la córnea. En casos graves, la ADDE puede causar pérdida de la visión o incluso ceguera. Actualmente, el tratamiento del ojo seco se limita a gotas para los ojos o fisioterapia, que solo pueden aliviar los síntomas de las molestias oculares y no pueden curar fundamentalmente el síndrome del ojo seco. Para restaurar la función de la glándula lagrimal en el ojo seco, hemos creado un modelo animal de disfunción de la glándula lagrimal en ratas inducida por escopolamina. A través de la evaluación integral de la glándula lagrimal, córneas, conjuntivas y otros factores, nuestro objetivo es proporcionar una comprensión completa de los cambios patológicos de la ADDE. En comparación con el modelo actual de ratón con ojo seco, este modelo animal de ADDE incluye una evaluación funcional de la glándula lagrimal, lo que proporciona una mejor plataforma para estudiar la disfunción de la glándula lagrimal en ADDE.
Introduction
Para el año 2021, aproximadamente el 12% de las personas se ven afectadas significativamente por la sequedad ocular1, lo que la convierte en una de las enfermedades oculares crónicas más comunes. El ojo seco se puede dividir en dos tipos: ojo seco acuoso-deficiente (ADDE) y ojo seco evaporativo (EDE)2, dependiendo de los diferentes factores que inciden en la enfermedad. El ADDE se divide a su vez en síndrome de Sjögren (SS) y no SS, pero la mayoría de los pacientes con ojo seco son pacientes sin SS en la clínica3. Los síntomas crónicos del ojo seco afectan gravemente a la calidad visual de los pacientes. Actualmente, el tratamiento convencional de la DED consiste en la aplicación de lágrimas artificiales para lubricar la superficie ocular y la fisioterapia de los párpados. Sin embargo, el síndrome del ojo seco puede no ofrecer una cura completa en muchos casos. Por lo tanto, el estudio de la patogénesis de la enfermedad del ojo seco es crucial para el desarrollo de nuevas terapias y fármacos. Los modelos animales del síndrome del ojo seco proporcionan una base para futuras investigaciones.
Hay muchas maneras de construir modelos animales del síndrome del ojo seco4, incluyendo el cambio de los niveles de secreción lagrimal mediante la alteración de los niveles hormonales. Por ejemplo, la extirpación de los testículos de ratas puede reducir la secreción de andrógenos, aumentar la secreción lagrimal y disminuir la concentración del componente secretor libre (SC) e IgA en las lágrimas 5,6. Otro método consiste en indicar reacciones autoinmunes en la glándula lagrimal mediante la extirpación de los nervios de la superficie ocular que controlan la glándula. Además, se puede lograr una reducción directa de la secreción lagrimal mediante la extirpación quirúrgica de la glándula lagrimal7. Las condiciones ambientales cambiantes también pueden acelerar la evaporación de las lágrimas. Por ejemplo, el cultivo de animales en condiciones de baja humedad y ventilación seca puede establecer un modelo de ojo seco por evaporación excesiva8, que puede combinarse con otros métodos para aumentar la gravedad del ojo seco. Los principales fármacos utilizados para inducir el ojo seco en modelos experimentales son la atropina y la escopolamina9. Como inhibidores parasimpáticos, ambos pueden inducir el bloqueo farmacológico de los receptores colinérgicos (muscarínicos) en la glándula lagrimal e inhibir la secreción lagrimal. En comparación con la sequedad ocular causada por la inyección de atropinamuscular 10, la escopolamina tiene un efecto inhibidor más fuerte sobre las glándulas de secreción, una mayor duración de la acción del fármaco y efectos más débiles sobre los músculos lisos cardíacos, intestinales delgados y bronquiales. Es uno de los fármacos más maduros para modelos animales de ojo seco.
Se pueden utilizar diferentes métodos para inducir el ojo seco con escopolamina, como la inyección subcutánea, la bomba de fármaco o la aplicación de parches 4,11,12. Con el fin de reducir la frecuencia de la administración de fármacos a animales de experimentación, muchos investigadores aplican parches transdérmicos a las colas de los ratones o utilizan bombas de fármacos. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones. Por ejemplo, la absorción de parches transdérmicos debe tener en cuenta la absorción individual de ratones, lo que puede conducir a una dosis inconsistente del medicamento. Aunque las bombas de fármacos pueden controlar con precisión la dosis de cada administración, no siempre son compatibles con el fármaco que se administra o la concentración que se utiliza. También deben colocarse quirúrgicamente, lo que es más invasivo para el animal, requiere un evento anestésico y existe la posibilidad de complicaciones posquirúrgicas como la dehiscencia. La inyección subcutánea, aunque más engorrosa, puede garantizar una dosis precisa para cada administración y mantener la consistencia en la administración del fármaco entre diferentes ratas. Al mismo tiempo, tiene un costo menor y es adecuado para realizar una gran cantidad de experimentos con animales.
Este estudio aplica inyecciones subcutáneas repetidas de escopolamina para establecer un modelo de rata con ojo seco. Analizamos indicadores de ojo seco como defectos corneales, niveles de secreción lagrimal y morfología patológica de la córnea, la conjuntiva y la glándula lagrimal. Al combinar la concentración del fármaco, las manifestaciones patológicas y los síntomas del ojo seco, profundizamos en el modelo de rata de ojo seco en detalle, proporcionando datos experimentales más precisos para el estudio del tratamiento del ojo seco y los mecanismos patológicos. También describimos el proceso de modelado en detalle para futuros investigadores.
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Protocol
Todos los experimentos con animales realizados siguiendo este protocolo se realizan bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
1. Preparación animal
- Prepare 12 ratas hembras Wistar SPF sanas de 6 semanas de edad con un peso de 160 g ± 20 g.
- Use una lámpara de hendidura y un oftalmoscopio para examinar las condiciones oculares de todas las ratas, asegurándose de que no haya enfermedades del segmento anterior o de la retina.
- Cría a todas las ratas durante 1 semana con suficientes fuentes de comida y agua.
- Dividieron aleatoriamente todas las ratas en grupos normales, concentración del fármaco escopolamina 2,5 mg/mL, concentración del fármaco escopolamina 5 mg/mL y concentración del fármaco escopolamina 7,5 mg/mL, con tres animales en cada grupo.
2. Preparación de la solución
- Prepare el bromuro de escopolamina disolviéndolo en una solución de cloruro de sodio al 0,9% para hacer una solución con concentraciones de 7,5 mg/ml, 5 mg/ml y 2,5 mg/ml.
- Preparar una solución de cloruro de sodio al 0,9% sin bromuro de escopolamina para ser utilizada como inyección para el grupo de control de ratas.
3. Preparación de equipos y materiales
- Prepara un microscopio para animales pequeños.
- Preparar los materiales para el experimento, incluyendo una jeringa desechable de 1 ml con aguja (26 G); tiras oftálmicas de fluoresceína sódica; Tira reactiva de desgarro Schirmer; etanol absoluto; 4% de paraformaldehído; xileno; bálsamo neutro; hematoxilina, eosina; y kit de tinción de ácido peryódico-Schiff.
4. Inyección subcutánea
NOTA: Este procedimiento requiere la ayuda de una segunda persona para ayudar a asegurar las ratas.
- Sostén el cuerpo de la rata con firmeza y atrapa y estira sus patas traseras izquierdas (o derechas).
NOTA: Un asistente puede ayudar a sostener al animal. - Limpie el lugar de la inyección con alcohol.
- Inserte una jeringa desechable de 1 ml con aguja (26 G) en la base del pliegue cutáneo entre el pulgar y el dedo.
- Aspire la jeringa tirando hacia atrás del émbolo de la jeringa. Cualquier sangre en la jeringa indica una colocación incorrecta de la aguja; Retire y vuelva a colocar la aguja.
- Administre una solución de cloruro de sodio al 0,9% con o sin bromuro de escopolamina con un movimiento constante y fluido.
- Inyectar a todas las ratas de acuerdo con diferentes concentraciones, inyectando 0,5 ml cada vez y cuatro veces al día (a las 9:00, 12:00, 15:00 y 18:00) durante un período consecutivo de 19 días, alternando entre las extremidades izquierda y derecha.
NOTA: Los grupos se nombran de la siguiente manera:
Grupo sin bromuro de escopolamina: grupo 0 (control)
Grupo con bromuro de escopolamina 2,5 mg/mL: Grupo 2,5
Grupo con bromuro de escopolamina 5 mg/mL: grupo 5
Grupo con bromuro de escopolamina 7,5 mg/mL: Grupo 7,5 - Regrese al animal a su jaula y controle la respiración y el comportamiento durante 5-10 minutos.
5. Prueba de secreción lagrimal (prueba de lágrima de Schirmer, STT)
- Crea una tira de papel de filtro modificada para las ratas11. Corta la mitad de la tira de papel de filtro utilizada para las personas a lo largo de la línea central (1 mm × 15 mm) y recorta la cabeza de la tira para que quede lisa.
NOTA: Antes de realizar la prueba de secreción lagrimal, sujete manualmente el cuerpo de la rata para evitar el movimiento y asegurar la exposición de los ojos de la rata. - Coloque la tira de papel de filtro en el 1/3 exterior del saco conjuntival del párpado inferior de la rata.
- Cronometra la prueba durante 5 min. Controle el cierre de los ojos de la rata durante todo el procedimiento.
- Después de medir, use pinzas para sujetar la tira de papel de filtro en un tubo de microcentrífuga y registre el volumen de lágrima haciendo una marca en la pared del tubo.
- Mida la secreción de lágrimas el día 0, el día 1, el día 3, el día 5, el día 7, el día 11, el día 15 y el día 19.
6. Tinción con fluoresceína corneal
- Dejar caer 0,5 μL de solución de fluoresceína sódica al 0,5% en el saco conjuntival inferior de cada rata.
- Observe la córnea bajo luz azul durante 3 minutos después de la instilación con fluoresceína.
- Registre la tinción de fluorescencia de la córnea de cada rata y observe si hay un defecto corneal.
- Realice la tinción con fluoresceína corneal el día 0, el día 1, el día 3, el día 5, el día 7, el día 11, el día 15 y el día 19.
7. Observación histológica del tejido conjuntival
- Una vez finalizado el desarrollo del modelo, anestesiar profundamente a las ratas con una inyección intraperitoneal de 0,4 mL/100 g de hidrato acuoso de cloral al 10% para aliviar la tensión de los animales. Luego, sacrificar a las ratas por dislocación cervical.
- Tome la conjuntiva bulbar de las mismas regiones de cada rata, con un tamaño aproximado de 2 mm x 2 mm.
- Fijar los tejidos inmediatamente en paraformaldehído al 4% durante 24 h e incrustar en parafina13.
- Corte secciones de 5 μm de espesor y tiña con hematoxilina y eosina (HE)14 y tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) (siga las instrucciones del fabricante).
8. Observación histológica del tejido de la glándula corneal y lagrimal
- Después de completar el desarrollo del modelo, eutanasiar a la rata como se describe en el paso 7.1.
- Tome la córnea del lado derecho de cada rata y fíjela inmediatamente en una solución de paraformaldehído al 4%.
- Corte la epidermis cefálica y el tejido subcutáneo a lo largo de la línea que conecta la oreja y la esquina exterior del ojo, expanda la incisión a ambos lados y aísle aún más la glándula extraorbitaria amarillenta.
- Retire completamente el pelaje de la rata y separe la glándula extraorbitaria con una solución de cloruro de sodio al 0,9%.
- Colocar las glándulas extraorbitarias aisladas en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h e incrustarlas en parafina.
- Corte secciones continuas de ~5 μm de espesor y tiña con HE para muestras de tejido de glándulas corneales y extraorbitarias.
9. Análisis estadístico
- Utilizar un software adecuado para el análisis estadístico de los datos.
- Realice un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para analizar los datos y la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) para la comparación entre grupos. Establezca el nivel de significación estadística en α = 0,05, donde P < 0,05 indica significación estadística.
NOTA: Para el análisis estadístico de los datos experimentales se utilizó el programa SPSS 20.
- Realice un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para analizar los datos y la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) para la comparación entre grupos. Establezca el nivel de significación estadística en α = 0,05, donde P < 0,05 indica significación estadística.
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Representative Results
Prueba Schirmer I, SIT I
El volumen lagrimal de las ratas se midió en los días 0, 3, 5, 7, 11, 15 y 19 después del inicio del experimento. Los resultados experimentales mostraron que la secreción lagrimal del grupo escopolamina (grupo 2,5, grupo 5, grupo 7,5), en comparación con el grupo control (grupo 0), disminuyó significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,01). No hubo significación estadística entre el grupo 2,5, el grupo 5 y el grupo 7,5 (P > 0,05). No se observaron diferencias significativas entre los diferentes grupos en cuanto al número de días (P > 0,05) (Figura 1, Tabla 1).
Tinción con fluoresceína corneal
La tinción con fluoresceína corneal se realizó en los días 0, 3, 5, 7, 11, 15 y 19 del experimento. Los resultados mostraron que no hubo tinción de fluoresceína corneal en ningún grupo, lo que indica que no se formaron defectos epiteliales corneales evidentes durante el experimento de 20 días con diferentes concentraciones de fármacos escopolamina (Figura 2).
Análisis anatomopatológico del epitelio corneal
Después del experimento, se recolectaron tejidos corneales de cada rata para la tinción de HE para observar la morfología del epitelio corneal y medir el grosor de la capa epitelial corneal. El epitelio corneal del grupo control estaba compuesto por 4-6 capas de células epiteliales ordenadas, entre las cuales la capa basal consistía en una sola capa de células epiteliales columnares dispuestas de forma ordenada y cercana. El epitelio corneal de los grupos 2.5, 5 y 7 de escopolamina era significativamente más delgado que el grupo control, con morfología celular aplanada y atrófica y estructura celular desordenada. En el grupo 7.5, había una conexión intercelular y una estructura vacuolar laxas en la capa basal (indicada por la flecha roja en la Figura 3). En comparación con el epitelio corneal de los grupos escopolamina, el epitelio corneal del grupo control normal mostró diferencias estadísticas en el grosor de la capa epitelial corneal (Figura 4).
Análisis anatomopatológico de la glándula lagrimal
La glándula principal para la secreción lagrimal en ratas es la glándula lagrimal extrorbital15. Al observar cortes de glándula lagrimal, se observaron cambios en la morfología de las células epiteliales de la glándula lagrimal con el aumento de la concentración de escopolamina, acompañado de inflamación y edema tisular. No se observaron tales cambios en el grupo de control. Los resultados de la anatomía patológica sugieren que los cambios inflamatorios de la glándula lagrimal, el edema celular y la atrofia de las células epiteliales glandulares pueden ser utilizados como indicadores de daño funcional de la glándula lagrimal16 (Tabla 2). Estos indicadores se pueden utilizar para medir la gravedad del ojo seco en relación con la cantidad de secreción lagrimal (Figura 5).
Análisis de los resultados de la tinción conjuntival
La estructura de la conjuntiva en el grupo control es completa, compuesta principalmente por la capa superficial y la lámina propia. La capa superficial está formada por células epiteliales cilíndricas laminadas, lisas y completas, con microvellosidades en la superficie celular. Las células caliciformes dispersas estaban presentes entre las células epiteliales, con gran volumen celular y gránulos mucosos en el citoplasma celular. La capa superficial del epitelio conjuntival en los tres grupos de fármacos escopolamina era significativamente más delgada, el número de microvellosidades y células caliciformes se reducía, la estructura de la disposición celular era incompleta, acompañada de edema, y una pequeña cantidad de células inflamatorias como se observó en la tinción de HE (Figura 6).
Mediante la tinción de la conjuntiva con PAS, se calculó el número promedio de células caliciformes por campo microscópico de 40x en tres muestras independientes de cada ratón y se expresó como media ± DE (Figura 7).
Figura 1: Estadísticas del valor de la prueba de Schirmer en cada grupo (mm) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tinción con fluoresceína sódica de la córnea de rata. En el experimento de 20 días con fluoresceína sódica, no se observaron hallazgos positivos en las córneas de todas las ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tinción del epitelio corneal y medición del espesor. En el grupo 7.5, había una conexión intercelular y una estructura vacuolar laxas en la capa basal (indicada por la flecha roja) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estadísticas del grosor epitelial corneal en cada grupo. En comparación con el epitelio corneal de los grupos de escopolamina, el epitelio corneal del grupo control normal mostró diferencias estadísticas en el grosor de la capa epitelial corneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados de la tinción HE de la glándula lagrimal extrorbital de ratas. (A) Grupo 0: En el campo visual, las glándulas lagrimales mostraron estructura lobulillar y estaban compuestas por conductos y glándulas tubulares, sin anomalías evidentes en la morfología de los conductos, mientras que las glándulas tubulares estaban compuestas por células glandulares en forma de cono con abundantes sustancias mucosas en el citoplasma, No hay edema obvio en los tejidos conectivos, no hay anomalías obvias en los vasos sanguíneos intersticiales, y no hay necrosis obvia ni infiltración de células inflamatorias. (B) Grupo 2.5: En el campo visual, se observa atrofia ocasional de las células epiteliales de la glándula lagrimal, con volumen reducido, cavidades glandulares dilatadas de forma irregular y sustancia mucinosa reducida dentro de la cavidad (indicada por la flecha roja). También hay infiltración ocasional de linfocitos libres en el estroma (indicado por la flecha azul), pero no se observan anomalías evidentes en la morfología del conducto ni signos de edema. (C) Grupo 5: En el campo visual, las células epiteliales lagrimales se atrofiaron ocasionalmente y redujeron su tamaño, la cavidad glandular se agrandó, la sustancia mucosa en la cavidad se redujo (flecha roja) y ocasionalmente se observó infiltración de linfocitos libres en el estroma (flecha azul), y no se observaron anomalías obvias en la morfología del conducto o edema del tejido conectivo entre los lóbulos de la glándula lagrimal. (D) Grupo 7.5: El edema se puede ver en el campo visual; el espacio entre las glándulas lagrimales se ensancha y la disposición es irregular (flecha verde), las células epiteliales de las glándulas lagrimales a menudo se atrofian, el volumen se vuelve más pequeño y la forma es irregular (flecha amarilla), ocasionalmente la cavidad de la glándula se agranda, la materia mucosa en la cavidad se reduce (flecha roja), ocasionalmente el linfocito libre se infiltra (flecha azul), sin anomalías aparentes en la morfología del conducto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Tinción de HE de la conjuntiva de rata. En comparación con el epitelio conjuntival del grupo control, los tres grupos de epitelio conjuntival medicado con escopolamina mostraron diversos grados de daño estructural. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tinción PAS de la conjuntiva. (A) Ratas control normales. (B) ratas del grupo de la escopolamina. (C) Densidad de células caliciformes en cada grupo (20x). Barra negra = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Prueba de Schirmer I, SIT (Valor medio, unidad [mm]) | |||||||
| Grupo | 0 días | 3 días | 5 días | 7 días | 11 días | 15 días | 19 días |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabla 1: Prueba de Schirmer de ratas de los cuatro grupos en diferentes momentos (mm). Después de aplicar medicamentos, la secreción de lágrimas en ratas disminuyó significativamente.
| Número | Necrosis | Inflamación | Edema | Atrofia epitelial |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabla 2: Puntuación del tejido patológico de la glándula lagrimal de rata. Criterios de puntuación: 0: En condiciones normales, teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo y la cepa del animal, el tejido se considera normal;
1: Los cambios observados acaban de exceder el rango normal; 2: Se pueden observar lesiones, pero aún no son graves; 3: Las lesiones son evidentes y continúan empeorando; 4: Las lesiones son extremadamente severas y han afectado a todo el tejido16.
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Discussion
El ojo seco con deficiencia acuosa (ADDE) es un tipo importante de ojo seco, que representa aproximadamente 1/3 de la población total de ojo seco17, y la principal causa de ADDE es el daño patológico y la inflamación de la glándula lagrimal13. Para este tipo de ojo seco, los métodos de tratamiento clínico más comunes son las lágrimas artificiales para aliviar los síntomas o la aplicación tópica de esteroides o ciclosporina18, mientras que existen pocas opciones de tratamiento para el daño de la glándula lagrimal. Por lo tanto, es muy importante explorar el impacto de la reconstrucción de la función de la glándula lagrimal en el ojo seco y establecer un modelo animal de disfunción de la glándula lagrimal. Utilizamos un método de aplicación repetida de medicamentos para suprimir la secreción de la glándula lagrimal en ratas y creamos un modelo animal de disfunción crónica de la glándula lagrimal en ojo seco.
Elegimos ratas para construir este modelo de ojo seco, que tiene más ventajas en comparación con otros modelos animales19. Por ejemplo, los conejos tienen un tamaño corporal más grande y requieren más dosis de medicamentos o inyecciones más frecuentes para lograr el efecto deseado. Además, los conejos son un poco más caros, lo que significa más costos para el experimento. Los ratones también se utilizan comúnmente en la investigación oftalmológica, pero generalmente se utilizan para construir modelos de síndrome de Sjögren20. Estos modelos se centran en comparar la inflamación de órganos y la infiltración de linfocitos para explorar los mecanismos inmunopatológicos. Los ratones tienen un tamaño corporal pequeño, una anatomía compleja de la glándula lagrimal y una baja secreción lagrimal, lo que dificulta reflejar con precisión la producción de lágrimas. El modelo animal de rata es un modelo de ojo seco más adecuado, ya que permite inyecciones de medicamentos convenientes, tiene condiciones de alimentación relativamente simples, es adecuado tanto para estudios clínicos como experimentales y también tiene ventajas en términos de costo. Es un buen modelo animal para ADDE.
Aplicamos el bloqueador de receptores colinérgicos escopolamina para inhibir los receptores colinérgicos en el cuerpo de la rata, reduciendo la secreción de la glándula lagrimal y alterando la estructura patológica de las células de la glándula lagrimal, lo que simula fundamentalmente el estado de las glándulas lagrimales en pacientes con ojo seco. En comparación con otros métodos, este enfoque simula mejor el estado dañado de las glándulas lagrimales en estado natural. Otros métodos, como el uso de colirios de cloruro de benzalconio21 o la alteración de las condiciones externas, como la reducción de la humedad y el aumento de la evaporación de la superficie ocular 4,8, solo alteran el ambiente de la superficie ocular y no cambian el estado funcional de la glándula lagrimal. Por lo tanto, no son adecuados para afecciones crónicas de ojo seco a largo plazo.
Al medir el volumen de secreción de lágrimas en ratas, mejoramos las tiras reactivas de lágrimas de Schirmer. Primero, cortamos la tira reactiva de desgarro utilizada por los humanos a lo largo de la línea central. Luego, recortamos la parte superior en forma de arco redondo y la doblamos suavemente hacia atrás en la parte superior para facilitar la inserción en el saco conjuntival inferior de la rata. Cabe señalar que las ratas son activas y difíciles de medir las lágrimas durante 5 min. Después de insertar la tira reactiva de lágrimas Schirmer en el saco conjuntival inferior de la rata, cerramos manualmente los ojos de la rata para aumentar su comodidad y evitar luchar durante la medición prolongada de lágrimas, lo que puede afectar los resultados de la medición.
Al extraer la glándula lagrimal, primero es necesario localizarla. El punto de localización de la glándula lagrimal es el punto medio entre la parte frontal de la oreja y el canto interno. Luego, corte el tejido de la piel debajo del pelaje, minimizando la entrada de pelaje fragmentado y reduciendo el proceso de manipulación en la etapa posterior. Durante el proceso de extracción, también es importante limpiar el pelaje fragmentado de manera oportuna. Especialmente al separar la glándula lagrimal, use solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina para enjuagar repetidamente y evitar mezclarla con otros tejidos que puedan afectar los resultados de la sección.
La ventaja del modelo animal de ojo seco desarrollado es que el protocolo correlacionó diferentes concentraciones de fármacos con diferentes grados de lesión de la glándula lagrimal. Esto proporciona una base experimental para el estudio del tratamiento de la disfunción de la glándula lagrimal. Hemos refinado algunos de los pasos operativos en el proceso de modelado para proporcionar materiales de referencia más detallados para un investigador. Además, hemos añadido indicadores de análisis para el modelo animal de ojo seco, incorporando indicadores morfológicos de la córnea, la conjuntiva y la glándula lagrimal, contando las células conjuntivales y puntuando el grado de lesión de la glándula lagrimal. Se evaluó la función de la glándula lagrimal a partir de inflamación, edema y atrofia. Hemos elegido los métodos de análisis más completos, rentables y precisos para reflejar el grado de disfunción del ojo seco y de la glándula lagrimal.
Sin embargo, nuestro método también tiene ciertas limitaciones. Debido al largo proceso de construcción de modelos animales, los experimentadores necesitan inyectar repetidamente. Aunque actualmente existen algunos métodos para sustituir las inyecciones manuales, como las bombas de fármacos o los parches transdérmicos, todavía existen algunas complicaciones en su uso. Cómo aplicar mejores métodos para reducir la frecuencia de la medicación, evitar la aparición de complicaciones y garantizar la precisión de la dosis es nuestro próximo objetivo. En conclusión, hemos mejorado un modelo animal de ojo seco causado por la inyección de escopolamina, proporcionando una base experimental para la investigación sobre la disfunción de la glándula lagrimal en la ADDE.
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Disclosures
Los autores no tienen posibles conflictos de intereses relacionados con los medicamentos y materiales utilizados en este procedimiento.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo de la Provincia de Guangdong de Especialidades Clínicas Clave de Alto Nivel (SZGSP014) y la Fundación de Ciencias Naturales de Shenzhen (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
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