Summary
כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.
Abstract
גידים ורצועות (T/L) הם מבנים חזקים המאורגנים היררכית המאחדים את מערכת השלד והשרירים. לרקמות אלה יש מטריצה חוץ-תאית עשירה בקולגן מסוג I (ECM) ותאי שושלת T/L המסודרים בקפידה הממוקמים בעיקר בשורות מקבילות. לאחר פציעה, T/L דורשים זמן רב לשיקום עם סיכון גבוה לכישלון ולעתים קרובות תוצאות תיקון לא משביעות רצון. למרות ההתקדמות האחרונה במחקר הביולוגיה של T/L, אחד האתגרים שנותרו הוא שבתחום T/L עדיין חסר פרוטוקול התמיינות סטנדרטי המסוגל לשחזר את תהליך היווצרות T/L במבחנה. לדוגמה, התמיינות עצם ושומן של תאים מקדימים מזנכימליים דורשת רק תרבית תאים דו-ממדית סטנדרטית (2D) ותוספת של אמצעי גירוי ספציפיים. לצורך התמיינות לסחוס, יש צורך בתרבית כדוריות תלת מימדית (תלת מימדית) ותוספת של TGFß. עם זאת, התמיינות תאים לגיד דורשת מודל תרבית תלת ממדי מסודר מאוד, אשר באופן אידיאלי צריך להיות נתון גם לגירוי מכני דינמי. הקמנו מודל אורגנואיד בן 3 שלבים (הרחבה, גירוי והתבגרות) כדי ליצור מבנה דמוי מוט תלת-ממדי מתוך יריעת תאים בהרכבה עצמית, המספקת מיקרו-סביבה טבעית עם גורמי ECM, אוטוקרינים ופרקריניים משלה. לאורגנואידים דמויי מוטות אלה יש ארכיטקטורה תאית רב-שכבתית בתוך ECM עשיר וניתן לטפל בהם די בקלות לחשיפה למתח מכני סטטי. כאן, הדגמנו את פרוטוקול 3 השלבים באמצעות פיברובלסטים עוריים הזמינים באופן מסחרי. אנו יכולים להראות שסוג התא הזה יוצר אורגנואידים חזקים ושופעי ECM. ההליך המתואר יכול להיות ממוטב עוד יותר במונחים של מדיה תרבותית ואופטימיזציה לקראת גירוי מכני צירי דינמי. באותו אופן, מקורות תאים חלופיים יכולים להיבדק עבור הפוטנציאל שלהם ליצור אורגנואידים T / L ובכך לעבור התמיינות T / L. לסיכום, הגישה האורגנואידית התלת-ממדית המבוססת יכולה לשמש כמודל למחקר בסיסי של גידים ואפילו להנדסת T/L ללא פיגומים.
Introduction
גידים ורצועות (T/L) הם מרכיבים חיוניים של מערכת השלד והשרירים המספקים תמיכה חיונית ויציבות לגוף. למרות תפקידן הקריטי, רקמות חיבור אלה מועדות להתנוונות ולפציעות, הגורמות לכאב ולפגיעה בניידות1. יתר על כן, אספקת הדם המוגבלת שלהם ויכולת הריפוי האיטית שלהם עלולים להוביל לפציעות כרוניות, בעוד שגורמים כגון הזדקנות, תנועה חוזרת ונשנית ושיקום לא תקין מגבירים עוד יותר את הסיכון לניוון ופציעה2. טיפולים קונבנציונליים, כגון מנוחה, פיזיותרפיה והתערבויות כירורגיות, אינם מסוגלים לשחזר באופן מלא את המבנה והתפקוד של T/L. במהלך השנים האחרונות, חוקרים שאפו להבין טוב יותר את האופי המורכב של T / L על מנת לחפש טיפולים יעילים להפרעות T / L 3,4,5. T/L נבדלים על ידי מבנה מאורגן היררכית, מטריצה חוץ-תאית (ECM), המורכב בעיקר מסיבי קולגן מסוג I ופרוטאוגליקנים, תכונה שקשה לשכפל במבחנה6. מודלים מסורתיים של תרביות תאים דו-ממדיות (2D) אינם מצליחים ללכוד את הארגון התלת-ממדי (3D) האופייני של רקמות T/L, ומגבילים את פוטנציאל התרגום שלהם, כמו גם מעכבים את ההתקדמות החדשנית בתחום התחדשות T/L.
לאחרונה, הפיתוח של מודלים אורגנואידים תלת-ממדיים הציע אפשרויות חדשות לקידום מחקר בסיסי והנדסת רקמות ללא פיגומים של סוגי רקמות שונים 7,8,9,10,11,12,13. לדוגמה, כדי לחקור צומת מיוטנדי, Larkin et al. 2006 פיתחו מבני שרירי שלד תלת-ממדיים יחד עם מקטעי גידים מאורגנים עצמיים הנגזרים מגיד זנב חולדה10. יתר על כן, שילה ועמיתיו 2013, באמצעות שימוש בתעלות גידול מצופות פיברונקטין במיקרו-מכונה, כיוונו את ההרכבה העצמית של פיברובלסטים עוריים אנושיים ליצירת סיבים תאיים ללא סיוע של פיגומים תלת-ממדיים, גישה שיכולה ללכוד תכונות מפתח של התפתחות גידים עובריים11. במחקר שנערך על ידי Florida et al. 2016, תאי סטרומה ממח עצם הורחבו תחילה לשושלות עצם ורצועות, ולאחר מכן שימשו ליצירת יריעות תאים חד-שכבתיות בהרכבה עצמית, אשר יושמו לאחר מכן ליצירת מבנה רב-פאזי של עצם-רצועה-עצם המחקה את הרצועה הצולבת הקדמית הטבעית, מודל שמטרתו לשפר את ההבנה של התחדשות רצועות12. כדי להבהיר תהליכי מכנוטרנסדוקציה של גידים, Mubyana et al. 2018 השתמשו במתודולוגיה נטולת פיגומים שבאמצעותה נוצרו סיבי גיד בודדים ונתונים לפרוטוקול העמסה מכני13. אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים המאורגנים בעצמם המחקים את הארכיטקטורה המקורית, המיקרו-סביבה והפונקציונליות של רקמות. תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות מספקות מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר ביולוגיה של רקמות ואיברים, כמו גם פתופיזיולוגיה. מודלים כאלה יכולים לשמש גם כדי לגרום להתמיינות ספציפית לרקמות של סוגי תאי גזע / אב שונים14,15. לפיכך, יישום מודלים אורגנואידים תלת ממדיים בתחום הביולוגיה T/L והנדסת רקמות הופך לגישה אטרקטיבית מאוד 9,16. מקורות תאים חלופיים יכולים להיות מיושמים עבור הרכבת אורגנואידים ולעורר לקראת התמיינות טנוגנית. סוג תא רלוונטי אחד המשמש להדגמה במחקר זה הוא פיברובלסטים עוריים 7,17,18. תאים אלה נגישים בקלות באמצעות הליך ביופסיה של העור, שהוא פחות פולשני בהשוואה לניקוב מח עצם או שאיבת שומן וניתן להכפיל אותם די מהר למספרים גדולים בשל יכולת ההתרבות הטובה שלהם. לעומת זאת, סוגי תאים מיוחדים יותר, כגון פיברובלסטים תושבי T/L, מאתגרים יותר לבידוד והרחבה. לכן, פיברובלסטים עוריים שימשו גם כנקודת מוצא לטכנולוגיות תכנות מחדש של תאים לקראת תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים מושרים19. חשיפת פיברובלסטים עוריים לתנאי תרבית תלת-ממדיים ספציפיים ולרמזי איתות, כגון טרנספורמציה של גורם גדילה-בטא 3 (TGFß3), אשר דווח כי הוא פועל כמווסת מרכזי של תהליכים תאיים שונים, כולל היווצרות ותחזוקה של T/L, יכול להגביר את ההתמיינות הטנוגנית שלהם במבחנה המובילה לביטוי גנים ספציפיים לגידים ולשקיעת T/L-טיפוסי ECM20, 21.
כאן, אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול אורגנואיד תלת-שלבי שהוקם ויושם בעבר (הרחבה דו-ממדית, גירוי דו-ממדי והבשלה תלת-ממדית) תוך שימוש בפיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים בוגרים (NHDFs) הזמינים מסחרית כמקור תא, ומציע מודל רב ערך לחקר טנוגנזה במבחנה 7. למרות העובדה שמודל זה אינו שווה ערך לרקמת In vivo T/L, הוא עדיין מספק מערכת רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שניתן להשתמש בה לחקר מנגנוני התמיינות תאית, חיקוי פתופיזיולוגיה של T/L במבחנה, והקמת פלטפורמות לרפואה מותאמת אישית וסינון תרופות. יתר על כן, בעתיד, מחקרים יכולים להעריך אם אורגנואידים תלת-ממדיים מתאימים להנדסת T/L נטולת פיגומים על ידי אופטימיזציה נוספת, כמו גם ניתנים לשימוש לפיתוח מבנים חזקים מבחינה מכנית בקנה מידה הדומים מאוד לממדים ולתכונות המבניות והביופיזיות של רקמות T/L מקוריות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל השלבים חייבים להתבצע באמצעות טכניקות אספטיות.
1. תרבות וטרום התרחבות של NHDFs
- הפשירו במהירות את בקבוקון ההקפאה המכיל פיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים (NHDFs, 1 x 106 תאים) בטמפרטורה של 37°C עד שהם כמעט מפשירים.
- יש להוסיף באיטיות 1 מ"ל של מדיום גידול פיברובלסטים שחומם מראש 2 (ערכה מוכנה לשימוש הכוללת מדיום בסיסי, סרום עגל עוברי 2% (FCS), גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) ואינסולין) בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקו) (מדיום NHDF), שחומם מראש ב-37°C לתאים.
- מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הסר את supernatant. להשהות מחדש את גלולת התא ב 12 מ"ל של מדיום NHDF שחומם מראש.
- מעבירים את התאים לבקבוק T-75 ומנערים לזמן קצר בצורה צולבת. מניחים את בקבוק T-75 ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 לח.
- שנה את המדיום כל יומיים. התבוננו ב- NHDFs תחת מיקרוסקופ עד שהם מגיעים למפגש של 70% - 80%.
2. הרחבה דו-ממדית
- מוציאים את בקבוק T-75 של האינקובטור ומסירים את מדיום ה-NHDF. שטפו את התאים במי מלח חומץ פוספט שחומם מראש (PBS).
- הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לתאים. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO2 עד שהתאים מתנתקים מהבקבוק (כ-3 דקות).
- הוסף 6 מ"ל של מדיום NHDF שחומם מראש כדי לנטרל את פעולת הטריפסין. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
- יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-DMEM (Modified Eagles Medium) של Dulbecco בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 1x MEM חומצות אמינו, 1% עט/סטרפטוקו, שחומם מראש ב-37°C.
- צלחת NHDFs בצלחת תרבית תאים דבק 10 ס"מ בצפיפות של 8 x 103 NHDFs / cm2 (בסך הכל, 4.4 x 105 NHDFs לכל צלחת 10 ס"מ). התנדנדו בעדינות בצורה צולבת.
- מניחים את צלחת תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח CO2 של 5%. שנה את המדיום כל יומיים
- עקוב אחר התאים תחת מיקרוסקופ עד הגעה למפגש של 100% (כ -5 ימים).
3. גירוי דו-ממדי
- הוציאו את צלחות תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ המכילות את ה-NHDF (משלבים 2.6 ו-2.7) מהאינקובטור. מוציאים את מדיום התרבית ושוטפים את התאים עם PBS שחומם מראש.
- הוסף 10 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה בינוני בתוספת 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, ו 1% עט / strep, מחומם מראש ב 37 ° C.
- הניחו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה של 5% CO2 . שנה את המדיום כל יומיים.
- עקוב אחר NHDFs תחת מיקרוסקופ במשך 14 ימים.
התבגרות 4. 3D
- מוציאים את צלחת תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ מהאינקובטור ומסירים את מדיום הגלוקוז הגבוה DMEM.
- בעדינות ובמהירות לנתק את גיליון התא שנוצר מן הצלחת עם מגרד התא. תוך כדי ניתוק, גלגלו בו זמנית את יריעת התא לאורגנואיד דמוי מוט תלת-ממדי.
- הרימו והניחו את האורגנואידים מסוג NHDF בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ שאינה נצמדת (לתאים). סוג מנה זה משמש למניעת נדידת תאים מהאורגנואיד לפלסטיק.
- בנקודת זמן זו או יום לאחר מכן (יום 0 או יום 1 להבשלה תלת-ממדית), אספו חלק מהאורגנואידים לניתוחים נוספים כגון משקל רטוב, הערכה היסטולוגית (אורגנואידים ביום 1 עדיפים ככל שהם הופכים קומפקטיים יותר), RNA ובידוד חלבונים.
- תקן את הקצוות של האורגנואיד עם פיני מתכת כדלקמן:
- החזק צד אחד של האורגנואיד בזהירות עם טוויטר, ועם טוויטר אחר, החל בעדינות מתיחה ידנית של כ -10% התארכות צירית. כדי להעריך את התארכות הצירית של 10%, השתמש בנייר מילימטרי או בסרגל.
- לאחר מכן, הרימו סיכת מתכת אחת עם הפינצטה ולחצו ידנית למטה דרך קצה האורגנואיד לתוך צלחת הפלסטיק כדי לתקן אותה. חזור על הליך זה עם הסיכה השנייה בקצה השני של האורגנואיד.
- הוסף 10 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה בינוני בתוספת 10% FBS, 1x MEM חומצות אמינו, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, 10 ng / mL TGFß3, ו 1% עט / strep, מחומם מראש ב 37 ° C.
- הניחו את המנה בקוטר 10 ס"מ בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה של 5% CO2 . שנה את המדיום כל יומיים.
- עקוב אחר האורגנואידים באופן קבוע במשך 14 יום.
הערה: הסיכות עשויות להשתחרר, ולכן לתקן מחדש באמצעות אותה טכניקה כמתואר בשלב 4.5. - לאחר 14 יום, להסיר את מדיום גלוקוז גבוה DMEM מן האורגנואידים. שטפו את האורגנואידים עם PBS שחומם מראש.
- מדדו אורגנואידים למשקל רטוב ביום 0 וביום 14 באמצעות סולם מדויק.
- הניחו צלחת ריקה בקוטר 10 ס"מ על המאזניים והורידו את המשקל לאפס כדי לוודא שרק משקל האורגנואידים נמדד. מוציאים את מדיום התרבית במלואו מהכלי בקוטר 10 ס"מ ומודדים את המשקל הרטוב של האורגנואיד אחד אחד.
הערה: במחקר זה, ביום 0, שלושה אורגנואידים לכל תורם, וביום 14, שני אורגנואידים לכל תורם נשקלו.
- הניחו צלחת ריקה בקוטר 10 ס"מ על המאזניים והורידו את המשקל לאפס כדי לוודא שרק משקל האורגנואידים נמדד. מוציאים את מדיום התרבית במלואו מהכלי בקוטר 10 ס"מ ומודדים את המשקל הרטוב של האורגנואיד אחד אחד.
- על פי מטרות המחקר, ליישם חלק מהאורגנואידים של NHDF בניתוחים היסטולוגיים נוספים או להקפיא אותם מיד בחנקן נוזלי באמצעות צינורות סטריליים נטולי DNA/RNA לבידוד DNA, RNA וחלבונים לאחר מכן ולאחר מכן לאחסן אותם ב -80 ° C.
- לחקירה היסטולוגית, תקן כל אורגנואיד ב- 5 מ"ל של פרפורמלדהיד 4% מקורר מראש (4 ° C) ב- PBS (מותאם ל- pH ניטרלי) למשך 45 דקות על קרח, ולאחר מכן שטיפת PBS ב- RT (2 x 5 דקות כל אחד).
- Cryoprotect את האורגנואידים הקבועים באמצעות שיפוע סוכרוז על ידי הנחת האורגנואידים בצנצנות זכוכית עבור היסטולוגיה. לדגור על האורגנואידים ב-10% סוכרוז בתמיסת PBS במשך שעתיים ב-4°C, לאחר 20% סוכרוז/PBS במשך שעתיים ב-4°C, ולבסוף, 30% סוכרוז/PBS למשך הלילה ב-4°C. החליפו את תמיסות הסוכרוז על ידי כך שתחילה תוציאו אותן ואז תתמלאו בתמיסה החדשה.
- הטמע את האורגנואידים בקריו-מדיום.
- מניחים צלחת נחושת על קרח יבש בקופסת קלקר ומצננים למשך 10 דקות.
- לאחר מכן, הניחו קריומולד פלסטיק, ממולא מראש בקריו-מדיום, על צלחת הנחושת ולחצו בעדינות את האורגנואיד לתחתית הקריומולד באמצעות פינצטה. המתן עד שהקריומדיום קפוא לחלוטין.
- עבור אורגנואידים ארוכים, תחילה לחתוך לשניים עם אזמל ולשים את שני חצאים מקבילים זה לזה ב cryomold. חזור על ההליך עבור כל אורגנואיד המיועד לעבור ניתוח היסטולוגי.
- אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C עד להקפאה.
- באמצעות קריוטום חותכים את האורגנואידים לאורכם במקטעים בעובי 10 מיקרומטר ובכפוף לצביעה היסטולוגית כגון המטוקסילין ואאוזין (H&E) באמצעות פרוטוקולסטנדרטי 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל האורגנואידים התלת-ממדיים T/L הוקם בעבר והודגם כאן על ידי יישום NHDF שנרכש מסחרית (n = 3, 3 אורגנואידים לכל תורם, NHDF שימשו במעברים 5-8). זרימת העבודה של המודל מסוכמת באיור 1. איור 2 מראה תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה של תרבית NHDF במהלך טרום ההתפשטות בצלוחיות T-75 (איור 2A), כמו גם בתחילת ואחרי 5 ימי תרבית בשלב ההתפשטות הדו-ממדית בצלחות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ (איור 2B). איור 2C (תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה) מדגים את המפגש של NHDFs במהלך גירוי דו-ממדי לאחר 14 ימי תרבית בצלחות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. לאחר מכן, יריעות התא נותקו ידנית וגולגלו בו זמנית לאורגנואידים דמויי מוט תלת-ממדי (ביום 0, אורך אורגנואיד הוא כ-6 ס"מ, רוחב כ-0.4 ס"מ), שתורבתו תחת מתח סטטי של 10% במשך 14 יום (איור 3, יום 0 ויום 14, תמונות מקרוסקופיות מייצגות). ביום ה-14 של תהליך ההבשלה התלת-ממדי, האורגנואידים הציגו מראה לבן בוהק, התכווצו ונראו צפופים יותר מהאורגנואידים הראשוניים. המשקל הרטוב של האורגנואידים נמדד בזמן היווצרותם (יום 0) ושוב ביום ה-14 של שלב ההבשלה התלת-ממדי (איור 4). נצפתה ירידה משמעותית במשקל הרטוב, דבר המצביע על התכווצות וארגון מחדש של מבנה ECM בתוך האורגנואידים במהלך פרק הזמן של שלב פרוטוקול זה. בנוסף לשינוי במשקל, עקב ההתכווצות, גם אורך האורגנואיד הצטמצם (ביום ה-14, אורך האורגנואיד הוא כ-3.5 ס"מ, והרוחב הוא כ-0.3 ס"מ). בתהליך זה, סיכות המתכת התרופפו והיה צורך לתקן אותן מחדש; לכן, במהלך 14 הימים של הבשלה 3D, אנו ממליצים לעקוב אחר אורגנואידים לעתים קרובות. כדי להעריך את המורפולוגיה של האורגנואידים, התקבלו חתכי אורך מאורגנואידים מסוג NHDF שנאספו ביום הראשון וביום ה-14 של שלב ההבשלה התלת-ממדית ועברו צביעת H&E (איור 5). ביום הראשון, האורגנואידים הציגו שכבות מנותקות, המורכבות בעיקר מתאים המוקפים בכמויות נמוכות של ECM. יתר על כן, התאים בתוך שכבות האורגנואידים לא היו מיושרים לאורך ציר האורגנואיד האורכי ששימש ככיוון לעומס המתיחה הסטטי שהופעל. גרעיני NHDF הציגו צורה עגולה עם גדלים וצורות שונות. ניתוח H&E של אורגנואידים מהיום ה-14 גילה עלייה ניכרת באות האוזין, מה שמצביע על שקיעת ECM במהלך תהליך ההבשלה התלת-ממדי. בנקודת זמן זו, האורגנואידים הציגו שכבות מאוחות, עם אזורים המכילים תאים מיושרים. התאים היו לעתים קרובות בקבוצות; עם זאת, הם היו מאורגנים גם בשורות תאים במקומות מסוימים. רוב הגרעינים היו בעלי גדלים דומים ולעיתים היו מוארכים.
איור 1: קריקטורה של מודל אורגנואיד תלת-ממדי T/L המורכב משלושה שלבים: הרחבה דו-ממדית, גירוי דו-ממדי והבשלה תלת-ממדית. בתחילה, NHDFs הורחבו מראש בבקבוק T-75 עד שהגיעו למפגש של 70%-80%. לאחר מכן, NHDFs טופחו באמצעות מדיום גלוקוז נמוך (DMEM) של Dulbecco בצלחת תרבית תאים של 10 ס"מ למשך 5 ימים (הרחבה דו-ממדית). התאים היו מגורים עם DMEM גלוקוז גבוה בינוני בתוספת חומצה אסקורבית במשך 14 ימים של תרבית (גירוי 2D). לאחר מכן, NHDF נותקו מצלחת הדבקה בקוטר 10 ס"מ, גולגלו לאורגנואיד דמוי מוט תלת-ממדי, הועברו וקיבעו בצלחת תרבית תאים לא דבקה בקוטר 10 ס"מ מלאה בתווך גלוקוז גבוה DMEM בתוספת חומצה אסקורבית וגורם גדילה טרנספורמטיבי בטא 3 (TGFß3) למשך 14 יום (הבשלה תלת-ממדית). האורגנואידים התלת-ממדיים שנוצרו עשויים לעבור הערכה של משקל רטוב, הערכה היסטולוגית, בידוד RNA וחלבונים, וניתוחים אחרים (למשל, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, מדידות ביומכניות) בנקודות זמן שונות כגון ימים 0, 1 ו-14. הקריקטורה נוצרה בתוכנת BioReender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה של NHDF במהלך שלבי טרום הרחבה, הרחבה דו-ממדית וגירוי דו-ממדי. (A) NHDFs במהלך טרום הרחבה בצלוחית T-75. (B) NHDFs בימים 1 ו-5 של שלב ההתפשטות הדו-ממדית בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. (C) NHDFs בימים 1 ו-14 של שלב גירוי דו-ממדי בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. התמונות צולמו במיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מורפולוגיה גולמית של אורגנואידים תלת-ממדיים מסוג NHDF. תמונות מקרוסקופיות מייצגות של אורגנואידים מסוג NHDF בימים 0 ו-14 של שלב ההתבגרות התלת-ממדית. סרגל קנה מידה: 1 ס"מ. התמונות צולמו במצלמת טלפון נייד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח משקל רטוב של אורגנואידים תלת-ממדיים מסוג NHDF. מדידת המשקל הרטוב של אורגנואידים הייתה ביום 0 וביום 14, סוף תהליך ההבשלה התלת-ממדי. הגרף מציג ערכים ממוצעים וסטיות תקן (NHDF n = 3, 3 אורגנואידים / תורם ביום 0 ו -2 אורגנואידים / תורם ביום 14 עקב 1 אורגנואידים / תורם שנלקח להיסטולוגיה ביום 1), כל נקודה מייצגת אורגנואידים בודדים ואילו כל צורה צבעונית מייצגת תורם אינדיבידואלי אחר. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן, ונעשה שימוש במבחן t פרמטרי לא מזווג. הבדלים סטטיסטיים: **p ≤0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח היסטולוגי של אורגנואידים תלת-ממדיים מסוג NHDF. תמונות מייצגות של מקטעים מוכתמים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) של אורגנואידים מסוג NHDF במהלך תהליך ההבשלה התלת-ממדית בימים 1 ו-14. תמונה ימנית - תמונות הגדלה נמוכה, תמונה שמאלית - תצוגה מוגדלת עם מחוונים כדלקמן: חצים צהובים - שכבות מנותקות; ראשי חץ צהובים - גרעינים בגדלים וצורות שונות; חצים שחורים - שכבות מאוחות ותצהיר ECM; ראשי חץ שחורים - שורות תאים, גרעינים בגודל דומה והתארכות; כוכבים שחורים -תאים בקבוצות. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התוצאות שהודגמו במחקר זה מספקות תובנות חשובות לגבי ביסוס ואפיון מודל האורגנואיד התלת-ממדי NHDF לחקר רקמות T/L. פרוטוקול 3 השלבים הוביל להיווצרות אורגנואידים דמויי מוט תלת-ממדי המציגים תכונות אופייניות של נישת T/L. מודל זה דווח בעבר ב- Kroner-Weigl et al. 20237 והודגם בפירוט רב כאן.
תמונות ניגודיות הפאזה שהוצגו באיור 2 הראו את התקדמות מפגש ה-NHDF והיווצרות היריעות במהלך שלבי ההתרחבות והגירוי. תהליך ההבשלה התלת-ממדי בוצע על ידי גלגול ידני של יריעות התא לאורגנואידים דמויי מוט תלת-ממדי, אשר תורבתו במתח סטטי במשך 14 יום. האורגנואידים הציגו מראה לבן בוהק וצפיפות מוגברת ביום ה-14, מה שמרמז על התכווצות וארגון מחדש של המבנה בתוך האורגנואידים. זה הצביע על כך שתקופת ההבשלה היא קריטית להשגת מבנה מאורגן יותר ומחקה רקמות T/L.
יתר על כן, ניתוח משקל גילה ירידה משמעותית במשקל הרטוב של אורגנואידים בין ימים 0 ל -14, שוב מצביע על התכווצות משמעותית וארגון מחדש של ECM בתוך האורגנואידים במהלך תהליך ההבשלה. חשוב לציין, מדידות משקל רטוב עשויות להשתנות בין ניסויים עקב טיפול ומדיום שיורי בתוך האורגנואיד או בכלים. יתר על כן, האורגנואיד עשוי להכיל יותר מדיום בהתחלה כי, כפי שנדון להלן, ביום 0, השכבות הנוצרות על ידי גלגול יריעות התא מופרדות ולא מאוחות. עם הזמן, השכבות התחברו ונעשו קומפקטיות יותר, וכך ניתן היה למתוח את התווך.
הערכה מורפולוגית על ידי צביעת H&E סיפקה תובנות נוספות לגבי המאפיינים המבניים של האורגנואידים. ביום הראשון, האורגנואידים הציגו שכבות מנותקות, המורכבות בעיקר מתאים עם גרעינים עגולים המוקפים ב-ECM פרי-תאי דק. חוסר יישור התאים במקביל לציר עומס המתיחה הציע כי נדרשת הבשלה נוספת כדי להשיג ארכיטקטורה תאית ו-ECM מאורגנת יותר של האורגנואידים. למרות ההתכווצות והפחתת משקל האורגנואיד והממדים בין הימים 1 ו -14, צביעת H&E הראתה עלייה באזורים חיוביים לאוזין, מה שמרמז על שקיעת ECM מוגברת. יתר על כן, כבר לא היו שכבות נראות לעין, ומדי פעם, התאים היו גרעינים מוארכים ומוקמו בשורות תאים מקבילות. זה הצביע על כך שהתאים בתוך האורגנואידים עוברים ארגון עצמי על ידי שינוי הסידור שלהם, כמו גם שיקוע, מבנה ויישור ECM, ובכך מחקים את ההתנהגות של היווצרות רקמת T/L הטבעית.
בסך הכל, ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל של מודל האורגנואידים NHDF ככלי רב ערך לחקר ביולוגיה של T/L, טנוגנזה חוץ גופית , ואפילו לפיתוח נוסף של הנדסת T/L ללא פיגומים. עם זאת, ישנם שלושה שלבים קריטיים לטיפול מוצלח במודל האורגנואיד התלת-ממדי: 1) היווצרות יריעת תאים הדוקה במהלך שלב הגירוי הדו-ממדי של הפרוטוקול. בעת שימוש בתאים ראשוניים, הדבר תלוי בעיקר בתכונות התא התורם; לכן, חשוב להעריך מספר תורמים במקביל; 2) גלגול ידני של גיליון התא. זה דורש גלגול מהיר, אבל באותו זמן בעדינות, את גיליון התא באמצעות מגרד התא. לכן, מומלץ לתכנן אורגנואידים ראשוניים כדי לאמן תחילה הליך זה; ו-3) קיבוע יציב של הפינים בקצוות האורגנואידים. קיבוע זה מבטיח את התארכות ציר האורגנואיד ומונע עיוותים כמו גם קריסה למבנה דמוי גוש. יתר על כן, במהלך שלב ההבשלה התלת-ממדית, מכיוון שהאורגנואידים חווים שיפוץ של ה-ECM, הפינים יכולים להתנתק פתאום, ולכן חשוב לעקוב לעתים קרובות אחר כל אורגנואיד ולתקן מחדש את הפינים.
המודל הנוכחי עדיין לא הגיע לרמה של חיקוי in vivo לרקמת T/L ויש לו מספר מגבלות. לדוגמה, זה דורש מספר גדול של תאים לכל אורגנואיד כמו גם 35 ימים כדי להשלים את ההליך, בעוד שרוב פרוטוקולי ההתמיינות, כגון מודל גלולה כונדרוגנית 3D, מוגדרים ל 21 ימים22. עדיף ששלבי השטיפה בהליך הפרוטוקול יבוצעו עם חיץ שטיפה מאוזן פיזיולוגית, לדוגמה, תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) או תמיסת מלח מאוזנת של ארלס (EBSS), ולא PBS שעשויות להיות להן השלכות מטבוליות על תאים אנושיים ראשוניים המעובדים במבחנה. באשר למדיום התרבית המשמש בשלבי הגירוי הדו-ממדי וההבשלה התלת-ממדית באורגנואיד, הוא נבחר DMEM בתוספת ניסוח FBS 10% מכיוון שזהו הבסיס לפרוטוקולי התמיינות מקובלים, כמו גם מתוך כוונה לתקנן ולהשוות בין סוגי תאים שונים עבור תכונותיהם האורגנואידוגניות23. רבייה של פרוטוקול אורגנואיד בן 3 שלבים בסביבות מעבדה שונות עשויה להיות מושפעת מסוג התא שבו נעשה שימוש, איכות התא ומעברו, כמו גם תכונות התא התלויות בתורם. שינויים בציוד, במיוחד באיכות צלחות תרבית התאיםבקוטר 10 ס"מ 24 המשמשות בשלב הגירוי הדו-ממדי, עלולים להשפיע על החוסן של היווצרות יריעות התא. יתר על כן, בשל התכווצות ECM במהלך ההבשלה התלת-ממדית, הקיבוע הצירי של האורגנואידים באמצעות פינים עשוי להשתחרר; לכן, כאמור, מומלץ לעקוב בתדירות גבוהה. בדיקה ובחירה של פינים שונים מבחינת קוטר וחוזק יכולה גם להפחית את הסיכון לניתוק פינים25. עם זאת, השימוש בפינים למתיחה ידנית אינו חזק, והוא נוטה להתמודד עם שונות; לכן, חשוב מאוד לפתח במחקר המשך מנגנון הידוק להחזקת קצוות האורגנואידים, אשר יכול לגרום לא רק לסטנדרטיזציה של שלב זה, אלא גם יכול לאפשר מתיחה דינמית של האורגנואידים. באופן כללי, יהיה מעניין לחקור שתי דרכים לשינוי מודל אורגנואידים, האחת downscaling - כדי להפחית את מספר התאים לכל אורגנואיד ואת זמן ההליך, ובכך להפוך אותו ידידותי יותר למשתמש, במיוחד עבור מחקרים במבחנה ; והשדרוג השני - להגדיל את ממדי האורגנואידים כדי לבחון את התנהגותם במודלים של בעלי חיים גדולים כאסטרטגיה פוטנציאלית להחלפת גידים.
המודל המוצג כאן יכול לספק פלטפורמה לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות הגידים, הפתופיזיולוגיה, ואולי תיקון והתחדשות אם האורגנואידים משולבים עם סוגי תאים שונים ונתונים למיקרו-קרעים. חשוב לציין כי המחקר של Kroner-Weigl et al. 20237 זיהה מספר מגבלות לגבי סוג התא NHDF, כלומר, האורגנואידים שנוצרו NHDFs הם גדולים יותר ותאיים יותר מאלה שמקורם בתאי T / L, מה שהופך את זה מאתגר לשלוט בהתרבות תאים והתנהגות. באשר לאפופטוזיס של תאים, בדיקה טרמינלית המבוססת על תיוג דקסינולאוטידיל טרנספראז dUTP nick end labeling (TUNEL) לא הראתה עדות לתאים מתים לאורך האורגנואיד ביום 147, מה שמרמז על דיפוזיה מתאימה של חומרים מזינים, פסולת וחמצן במהלך שלב ההבשלה התלת-ממדית. באופן מעניין, למרות ההבדלים המורפולוגיים, בדיקת פיילוט על ידי PCR כמותי של מספר גנים הקשורים ל- T/L (כולל סוגי קולגן שונים, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX) וכו ') הציעה ביטוי גנים דומה בין NHDF ואורגנואידים T/L7, ממצא שיש להמשיך לחקור כמו גם צריך להיות מאומת ברמת החלבון. לפיכך, עבור סוג תא זה, אופטימיזציה נוספת נדרשת על מנת לתמוך בהתמיינות T/L ויכולה להתבסס על התאמת המדיום המשמש בגירוי דו-ממדי ובשלבי הבשלה תלת-ממדיים (למשל, ריכוז בסרום, גורמי גדילה, ויטמינים), הארכת זמן ההבשלה או אפילו חשיפת האורגנואידים למתיחה מכנית דינמית. פיתוח הפרוטוקול יכול לשפר עוד יותר את התכונות האורגנואידיות, ההרכביות, המבניות והפונקציונליות, ובכך לאפשר למודל לחקות טוב יותר את נישת הרקמה המורכבת in vivo T/L. יתר על כן, מקורות תאים חלופיים יכולים להיחקר על יכולתם ליצור אורגנואידים מסוג T/L והאם הם יכולים לעבור התמיינות T/L. Yan et al. 20209, השתמשו במודל אורגנואיד תלת-ממדי על ידי שימוש בתאי גזע/אב בגידים צעירים/בריאים ומבוגרים/ניווניים (Y-TSPCs ו-A-TSPCs) כדי לחקור התנהגות תאית בתלת-ממד, כמו גם האם יכולת יצירת הגידים משתנה עם הזדקנות T/L. הם דיווחו כי אורגנואידים תלת-ממדיים A-TSPC מפגינים מורפולוגיה ירודה של רקמות, ולתאים שבתוכם יש קצב התרבות נמוך יותר אך אפופטוזיס גבוה יותר במקביל לרמות גבוהות של סמנים הקשורים להזדקנות9. לפיכך, מודל האורגנואיד התלת-ממדי T/L הוא פלטפורמה מבטיחה לחקר מנגנונים מולקולריים ותאיים המעורבים בהזדקנות גידים, ובהמשך ניתן להשתמש בו לבדיקת טיפולים תרופתיים חדשניים לתיקון והתחדשות גידים. בגישה אחרת, Chu et al. 2021 יישמו תאי זקיק דנטליים (DFC) במודל אורגנואיד תלת-ממדי על מנת להעריך את התמיינות הליגאמנטוגנית שלהם. סוג תא זה יצר אורגנואידים מאורגנים היטב, ובכך הציע DFCs כמקור תאים אטרקטיבי להתמיין ברקמת רצועות חניכיים (PDL), אשר יכול, בתורו, לפתח אסטרטגיה טיפולית מבטיחה עבור periodontitis8.
בעתיד, המודל יכול להיות מורכב עוד יותר על ידי הכללת סוגי תאים שונים (למשל, myofibroblasts, מקרופאגים), אשר עשוי להציע תובנות חדשות על התנהגויות ספציפיות לתאים ו crosstalk תאים בתוך אורגנואידים ולתרום להבנה מקיפה יותר של T / L ביולוגיה, פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה 8,9,16,26.
המודלים האורגנואידים התלת-ממדיים טומנים בחובם מספר יתרונות ליישומי הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. הם מחקים באופן הדוק את ההרכב והארגון התאי, כמו גם אינטראקציות בין תאים ותא-למטריצה של רקמות אנושיות, ובכך מציעים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחקר מנגנוני מחלה ותגובות תרופתיות27. אורגנואידים יכולים לשמש כפלטפורמת סינון בתפוקה גבוהה כדי להעריך את היעילות, אך גם תופעות לוואי פוטנציאליות של תרופות שונות ולספק חלופה אמינה ובעלות נמוכה לניסויים בבעלי חיים. יתר על כן, הם מאפשרים השוואה ישירה בין מצבים בריאים וחולים, ומאפשרים גילוי שינויים מולקולריים ותאיים מרכזיים הקשורים לפתולוגיות מגוונות, זיהוי סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם של מחלות, כמו גם הקלה על הבנה מוגברת של מנגנוני המחלה, ופיתוח טיפולים ממוקדים28,29.
יחד, הדגמנו בפירוט רב את השלבים של מודל אורגנואיד T/L תלת-ממדי שהוקם בעבר, המספק פלטפורמה מבטיחה לחקר ביולוגיה של רקמות T/L ותהליכים טנוגניים במבחנה של סוגי תאים שונים. יישום נוסף, אופטימיזציה ומחקר של מודל זה מעודדים מאוד מכיוון שהם עשויים להוביל לקידום אסטרטגיות הנדסת T/L ללא פיגומים, אשר, בתורם, יכולים לתרום לשיפור הטיפול ב- T / L.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
ד.ד. וש.מ.-ד. הכירו במענק BMBF "CellWiTaL: מערכות תאים ניתנות לשכפול למחקר תרופתי - הדפסת לייזר ללא שכבת העברה של תאים בודדים ספציפיים מאוד במבנים תאיים תלת ממדיים" הצעה מס' 13N15874. D.D. ו- V.R.A. מכירים במענק EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "הכשרה הוליסטית של מחקרי אוסטאוארתריטיס מהדור הבא", GA Nr. 101034412. כל המחברים מודים לגברת ביאטה גייר על הסיוע הטכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H.
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
