Summary
Aquí, demostramos un modelo de organoide de tres pasos (expansión bidimensional [2D], estimulación 2D, maduración tridimensional [3D]) que ofrece una herramienta prometedora para la investigación fundamental de tendones y un posible método sin andamios para la ingeniería de tejidos tendinosos.
Abstract
Los tendones y ligamentos (T/L) son estructuras fuertes y jerárquicamente organizadas que unen el sistema musculoesquelético. Estos tejidos tienen una matriz extracelular (MEC) rica en colágeno tipo I estrictamente dispuesta y células de linaje T / L ubicadas principalmente en filas paralelas. Después de una lesión, las T/L requieren mucho tiempo para la rehabilitación con un alto riesgo de fracaso y, a menudo, resultados de reparación insatisfactorios. A pesar de los recientes avances en la investigación de la biología T/L, uno de los desafíos pendientes es que el campo T/L aún carece de un protocolo de diferenciación estandarizado que sea capaz de recapitular el proceso de formación de T/L in vitro. Por ejemplo, la diferenciación ósea y grasa de las células precursoras mesenquimales requiere solo un cultivo celular bidimensional (2D) estándar y la adición de medios de estimulación específicos. Para la diferenciación al cartílago, es necesario el cultivo tridimensional (3D) de gránulos y la suplementación con TGFß. Sin embargo, la diferenciación celular al tendón necesita un modelo de cultivo 3D muy ordenado, que idealmente también debería ser sometida a estimulación mecánica dinámica. Hemos establecido un modelo de organoide de 3 pasos (expansión, estimulación y maduración) para formar una estructura 3D en forma de bastón a partir de una lámina celular autoensamblada, que proporciona un microambiente natural con sus propios factores ECM, autocrinos y paracrinos. Estos organoides en forma de bastón tienen una arquitectura celular de múltiples capas dentro de una ECM rica y se pueden manejar con bastante facilidad para la exposición a la tensión mecánica estática. Aquí, demostramos el protocolo de 3 pasos mediante el uso de fibroblastos dérmicos disponibles comercialmente. Podríamos demostrar que este tipo de células forma organoides robustos y abundantes en MEC. El procedimiento descrito puede optimizarse aún más en términos de medios de cultivo y optimizarse hacia la estimulación mecánica axial dinámica. De la misma manera, se puede probar el potencial de las fuentes celulares alternativas para formar organoides T/L y, por lo tanto, experimentar una diferenciación T/L. En resumen, el enfoque establecido de organoides T/L en 3D se puede utilizar como modelo para la investigación básica de tendones e incluso para la ingeniería de T/L sin andamios.
Introduction
Los tendones y ligamentos (T/L) son componentes vitales del sistema musculoesquelético que proporcionan soporte y estabilidad esenciales al cuerpo. A pesar de su papel crítico, estos tejidos conectivos son propensos a la degeneración y a las lesiones, causando dolor y deteriorode la movilidad. Además, su suministro limitado de sangre y su lenta capacidad de curación pueden provocar lesiones crónicas, mientras que factores como el envejecimiento, los movimientos repetitivos y la rehabilitación inadecuada aumentan aún más el riesgo de degeneracióny lesiones. Los tratamientos convencionales, como el reposo, la fisioterapia y las intervenciones quirúrgicas, no pueden restaurar completamente la estructura y la función de la T/L. En los últimos años, los investigadores se han esforzado por comprender mejor la naturaleza compleja de la T/L con el fin de buscar tratamientos efectivos para los trastornos de la T/L 3,4,5. Las T/L se distinguen por una estructura jerárquicamente organizada, dominada por la matriz extracelular (MEC), compuesta principalmente por fibras de colágeno tipo I y proteoglicanos, una característica difícil de replicar in vitro6. Los modelos tradicionales de cultivo celular bidimensional (2D) no logran capturar la organización tridimensional (3D) característica de los tejidos T/L, lo que limita su potencial de traducción y obstaculiza el progreso innovador en el campo de la regeneración T/L.
Recientemente, el desarrollo de modelos de organoides en 3D ha ofrecido nuevas posibilidades para avanzar en la investigación básica y la ingeniería de tejidos sin andamios de varios tipos de tejidos 7,8,9,10,11,12,13. Por ejemplo, para investigar la unión miotendinosa, Larkin et al. 2006 desarrollaron construcciones de músculo esquelético en 3D junto con segmentos de tendón autoorganizados derivados del tendón de cola de rata10. Por otra parte, Schiele et al. 2013, mediante el uso de canales de crecimiento recubiertos de fibronectina micromecanizados, dirigieron el autoensamblaje de fibroblastos dérmicos humanos para formar fibras celulares sin la ayuda de andamios 3D, un enfoque que puede capturar rasgos clave del desarrollo del tendón embrionario11. En el estudio de Florida et al. 2016, las células estromales de la médula ósea se expandieron primero en linajes de hueso y ligamento, y luego se utilizaron para generar láminas de células monocapa autoensambladas, que luego se implementaron para crear una construcción multifásica hueso-ligamento-hueso que imita el ligamento cruzado anterior nativo, un modelo que tiene como objetivo mejorar la comprensión de la regeneración del ligamento12. Para dilucidar los procesos de mecanotransducción de tendones, Mubyana et al. 2018 utilizaron una metodología sin andamios mediante la cual se crearon fibras de tendones individuales y se sometieron a un protocolo de carga mecánica13. Los organoides son estructuras 3D autoorganizadas que imitan la arquitectura nativa, el microambiente y la funcionalidad de los tejidos. Los cultivos de organoides en 3D proporcionan un modelo fisiológicamente más relevante para estudiar la biología de tejidos y órganos, así como la fisiopatología. Estos modelos también se pueden utilizar para inducir la diferenciación específica del tejido de diferentes tipos de células madre/progenitoras14,15. Por lo tanto, la implementación de modelos de organoides 3D en el campo de la biología T/L y la ingeniería de tejidos se convierte en un enfoque muy atractivo 9,16. Se pueden implementar fuentes celulares alternativas para el ensamblaje de organoides y estimularlas hacia la diferenciación tenogénica. Un tipo de célula relevante utilizado para la demostración en este estudio son los fibroblastos dérmicos 7,17,18. Estas células son fácilmente accesibles a través de un procedimiento de biopsia de piel, que es menos invasivo en comparación con la punción de médula ósea o la liposucción y puede multiplicarse con bastante rapidez a grandes cantidades debido a su buena capacidad proliferativa. Por el contrario, los tipos de células más especializados, como los fibroblastos residentes en T/L, son más difíciles de aislar y expandir. Por lo tanto, los fibroblastos dérmicos también se utilizaron como punto de partida para las tecnologías de reprogramación celular hacia células madre embrionarias pluripotentes inducidas19. El sometimiento de fibroblastos dérmicos a condiciones específicas de cultivo 3D y señales de señalización, como el factor de crecimiento transformante beta 3 (TGFß3), que se ha informado que actúa como un regulador clave de varios procesos celulares, incluida la formación y el mantenimiento de T/L, puede potenciar su diferenciación tenogénica in vitro, lo que conduce a la expresión de genes específicos del tendón y la deposición de ECM típica de T/L20. Artículo 21.
Aquí, describimos y demostramos un protocolo de organoides de 3 pasos (expansión 2D, estimulación 2D y maduración 3D) previamente establecido e implementado utilizando fibroblastos dérmicos humanos adultos normales (NHDF) disponibles comercialmente como fuente celular, ofreciendo un modelo valioso para estudiar la tenogénesis in vitro 7. A pesar de que este modelo no es equivalente al tejido T/L in vivo, proporciona un sistema fisiológicamente más relevante que puede utilizarse para investigar los mecanismos de diferenciación celular, imitar la fisiopatología T/L in vitro y establecer plataformas de detección de fármacos y medicina personalizada T/L. Además, en el futuro, los estudios pueden evaluar si los organoides 3D son adecuados para la ingeniería de T/L sin andamios mediante una mayor optimización, así como utilizables para el desarrollo de construcciones mecánicamente robustas a escala que se asemejen mucho a las dimensiones y propiedades estructurales y biofísicas de los tejidos T/L nativos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos los pasos deben realizarse utilizando técnicas asépticas.
1. Cultura y preexpansión de los NHDF
- Descongele rápidamente el vial criogénico que contiene fibroblastos dérmicos humanos normales adultos criopreservados (NHDF, 1 x 106 células) a 37 °C hasta que estén casi descongelados.
- Añada lentamente 1 mL de medio de crecimiento de fibroblastos precalentado 2 (kit listo para usar que incluye medio basal, suero de ternero fetal (FCS) al 2%, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) e insulina) suplementado con penicilina/estreptomicina (pen/estreptococo) al 1% (medio NHDF), precalentado a 37 °C a las células.
- Transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las celdas a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Retire el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en 12 mL de medio NHDF precalentado.
- Transfiera las células a un matraz T-75 y agite brevemente de manera transversal. Coloque el matraz T-75 a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 .
- Cambie el medio cada 2 días. Observe los NHDF bajo un microscopio hasta que alcancen un 70% - 80% de confluencia.
2. Expansión 2D
- Saque el matraz T-75 de la incubadora y retire el medio NHDF. Lave las células con solución salina tampón de fosfato (PBS) precalentado.
- Añadir 3 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a las células. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 hasta que las células se desprendan del matraz (aproximadamente 3 min).
- Añadir 6 mL de medio NHDF precalentado para neutralizar la acción de la tripsina. Transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 ml.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el pellet celular en Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) de baja glucosa suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), 1x aminoácidos MEM, 1% pen/estreptococo, precalentado a 37 °C.
- Colocar los NHDF en una placa de cultivo celular adherente de 10 cm a una densidad de 8 x 103 NHDF/cm2 (en total, 4,4 x 105 NHDF por placa de 10 cm). Mecete suavemente en forma transversal.
- Coloque la placa de cultivo celular de 10 cm a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 . Cambiar el medio cada 2 días
- Monitorizar las células al microscopio hasta alcanzar el 100% de confluencia (aprox. 5 días).
3. Estimulación 2D
- Extraiga las placas de cultivo celular de 10 cm que contienen los NHDF (de los pasos 2.6 y 2.7) de la incubadora. Retire el medio de cultivo y lave las células con PBS precalentado.
- Añadir 10 mL de medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de FBS, 50 μg/mL de ácido ascórbico y 1% de pen/estreptococo, precalentado a 37 °C.
- Coloque la placa de Petri a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 . Cambie el medio cada 2 días.
- Monitoree los NHDF bajo un microscopio durante 14 días.
Maduración 4. 3D
- Saque la placa de cultivo celular de 10 cm de la incubadora y retire el medio DMEM con alto contenido de glucosa.
- Separe suave y rápidamente la lámina de células formada del plato con un raspador de células. Mientras se separa, enrolle simultáneamente la lámina de células en un organoide 3D similar a una varilla.
- Recoja y coloque los organoides NHDF en una placa de Petri no adherente (para células) de 10 cm. Este tipo de placa se utiliza para evitar la emigración celular del organoide al plástico.
- En este momento o un día después (día 0 o día 1 de maduración 3D), recoja algunos de los organoides para análisis posteriores como el peso húmedo, la evaluación histológica (los organoides del día 1 son preferibles ya que se vuelven más compactos), el aislamiento de ARN y proteínas.
- Fije los bordes del organoide con alfileres de metal de la siguiente manera:
- Sostenga un lado del organoide con cuidado con una pinza y, con otra pinza, aplique suavemente un estiramiento manual de aproximadamente el 10% de elongación axial. Para estimar el alargamiento axial del 10%, utilice un milímetro de papel o una regla.
- A continuación, tome un alfiler de metal con la pinza y presione manualmente hacia abajo a través del borde del organoide en el plato de plástico para fijarlo. Repita este procedimiento con el segundo alfiler en el segundo borde del organoide.
- Añadir 10 mL de medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de FBS, 1x aminoácidos MEM, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 ng/mL de TGFß3 y 1% de pen/estreptococo, precalentado a 37 °C.
- Coloque el plato de 10 cm a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 . Cambie el medio cada 2 días.
- Controle los organoides regularmente durante 14 días.
NOTA: Es posible que los alfileres se aflojen, por lo tanto, vuelva a fijarlos utilizando la misma técnica que se describe en el paso 4.5. - Después de 14 días, retire el medio DMEM con alto contenido de glucosa de los organoides. Lave los organoides con PBS precalentado.
- Mida el peso húmedo de los organoides en el día 0 y el día 14 utilizando una báscula de precisión.
- Coloque un plato vacío de 10 cm en la báscula y tara el peso a cero para asegurarse de que solo se mida el peso de los organoides. Retire completamente el medio de cultivo del plato de 10 cm y mida el peso húmedo del organoide uno por uno.
NOTA: En este estudio, en el día 0, se pesaron tres organoides por donante, y en el día 14, dos organoides por donante.
- Coloque un plato vacío de 10 cm en la báscula y tara el peso a cero para asegurarse de que solo se mida el peso de los organoides. Retire completamente el medio de cultivo del plato de 10 cm y mida el peso húmedo del organoide uno por uno.
- De acuerdo con los propósitos del estudio, implementar algunos de los organoides NHDF en análisis histológicos posteriores o congelarlos inmediatamente en nitrógeno líquido utilizando tubos estériles sin ADN/ARN para el posterior aislamiento de ADN, ARN y proteínas y luego almacenarlos a -80 °C.
- Para la investigación histológica, fije cada organoide en 5 mL de paraformaldehído al 4% preenfriado (4 °C) en PBS (ajustado a pH neutro) durante 45 min en hielo, seguido de lavado con PBS en RT (2 x 5 min cada uno).
- Crioproteja los organoides fijados utilizando un gradiente de sacarosa colocando los organoides en frascos de vidrio para su histología. Incubar los organoides en sacarosa al 10% en solución de PBS durante 2 h a 4 °C, después de sacarosa al 20%/PBS durante 2 h a 4 °C y, por último, incubación nocturna al 30% de sacarosa/PBS a 4 °C. Cambie las soluciones de sacarosa pipeteando primero y luego llenándolas con la nueva solución.
- Incrustar los organoides en crio-medio.
- Coloque una placa de cobre sobre hielo seco en una caja de espuma de poliestireno y enfríe durante 10 minutos.
- A continuación, coloque un criomolde de plástico, precargado con criomedio, sobre la placa de cobre y presione suavemente el organoide contra el fondo del criomold con unas pinzas. Espere hasta que el criomedio esté completamente congelado.
- Para organoides largos, primero córtelo por la mitad con un bisturí y coloque las dos mitades paralelas entre sí en el criomolde. Repita el procedimiento para cada organoide que se vaya a someter a un análisis histológico.
- Almacene las muestras a -20 °C hasta la criosección.
- Utilizando un criótomo, corte los organoides longitudinalmente en secciones de 10 μm de espesor y someta a tinción histológica como hematoxilina y eosina (H&E) utilizando el protocolo estándar8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El modelo de organoide T/L 3D se estableció previamente y se demostró aquí mediante la implementación de NHDF comprado comercialmente (n = 3, se utilizaron 3 organoides por donante, se utilizaron NHDF en los pasajes 5-8). El flujo de trabajo del modelo se resume en la Figura 1. La Figura 2 muestra imágenes representativas de contraste de fase del cultivo de NHDF durante la preexpansión en matraces T-75 (Figura 2A), así como al comienzo y después de 5 días de cultivo en la etapa de expansión 2D en placas de cultivo celular de 10 cm (Figura 2B). La Figura 2C (imágenes representativas de contraste de fase) muestra la confluencia de NHDFs durante la estimulación 2D después de 14 días de cultivo en las placas de cultivo celular de 10 cm. Posteriormente, las láminas celulares se separaron manualmente y se enrollaron simultáneamente en organoides 3D en forma de varilla (en el día 0, la longitud del organoide es de aproximadamente 6 cm, el ancho de aproximadamente 0,4 cm), que se cultivaron bajo una tensión estática del 10 % durante 14 días (Figura 3, día 0 y día 14, imágenes macroscópicas representativas). En el día 14 del proceso de maduración en 3D, los organoides mostraban una apariencia blanca brillante, se contraían y parecían más densos que los organoides iniciales. El peso húmedo de los organoides se midió en el momento de la formación (día 0) y nuevamente en el día 14 de la etapa de maduración 3D (Figura 4). Se observó una reducción significativa en el peso húmedo, lo que indica contracción y reorganización estructural de la MEC dentro de los organoides durante el lapso de tiempo de esta etapa del protocolo. Además del cambio de peso, debido a la contracción, la longitud del organoide también se redujo (en el día 14, la longitud del organoide es de aproximadamente 3,5 cm y el ancho es de aproximadamente 0,3 cm). En este proceso, los pasadores de metal se aflojaron y tuvieron que volver a fijarse; por lo tanto, durante los 14 días de maduración 3D, recomendamos monitorear los organoides con frecuencia. Para evaluar la morfología de los organoides, se obtuvieron cortes longitudinales de organoides NHDF recolectados en el día 1 y el día 14 de la etapa de maduración 3D y se sometieron a tinción de H&E (Figura 5). En el día 1, los organoides mostraron capas desconectadas, compuestas principalmente por células rodeadas por bajas cantidades de MEC. Además, las células dentro de las capas de organoides no estaban alineadas a lo largo del eje longitudinal del organoide utilizado como dirección para la carga de tracción estática aplicada. Los núcleos de la NHDF exhibían una forma redonda con diferentes tamaños y formas. El análisis de H&E de los organoides del día 14 reveló un aumento notable en la señal de eosina, lo que indica la deposición de ECM durante el proceso de maduración en 3D. En este punto de tiempo, los organoides exhibieron capas fusionadas, con áreas que contenían células alineadas. Con frecuencia, las células estaban agrupadas; sin embargo, también se organizaron en filas de celdas en algunos lugares. La mayoría de los núcleos tenían tamaños similares y ocasionalmente eran alargados.
Figura 1: Caricatura de un modelo de organoide T/L en 3D compuesto por 3 pasos: expansión 2D, estimulación 2D y maduración 3D. Inicialmente, los NHDF se preexpandieron en un matraz T-75 hasta que alcanzaron una confluencia del 70%-80%. Posteriormente, los NHDF se cultivaron utilizando el medio de baja glucosa Modified Eagles Medium (DMEM) de Dulbecco en una placa de cultivo celular de 10 cm durante 5 días (expansión 2D). A continuación, las células se estimularon con medio DMEM de alta glucosa suplementado con ácido ascórbico durante 14 días de cultivo (estimulación 2D). A continuación, los NHDF se separaron de la placa adherente de 10 cm, se enrollaron en un organoide 3D en forma de varilla, se transfirieron y se fijaron en una placa de cultivo celular no adherente de 10 cm llena de medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con ácido ascórbico y factor de crecimiento transformante beta 3 (TGFß3) durante 14 días (maduración 3D). Los organoides 3D formados pueden someterse a una evaluación del peso húmedo, una evaluación histológica, un aislamiento de ARN y proteínas, y otros análisis (por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión, mediciones biomecánicas) en diferentes puntos temporales, como los días 0, 1 y 14. La caricatura fue generada en el software BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de contraste de fase de los NHDF durante las etapas de preexpansión, expansión 2D y estimulación 2D. (A) NHDF durante la preexpansión en matraz T-75. (B) NHDFs en los días 1 y 5 de la etapa de expansión 2D en una placa de cultivo celular de 10 cm. (C) NHDFs en los días 1 y 14 de la etapa de estimulación 2D en una placa de cultivo celular de 10 cm. Barras de escala: 200 μm. Las imágenes se tomaron con un microscopio invertido equipado con una cámara de alta resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología bruta de los organoides 3D de NHDF. Imágenes macroscópicas representativas de organoides NHDF en los días 0 y 14 de la etapa de maduración 3D. Barra de escala: 1 cm. Las imágenes fueron tomadas con la cámara de un teléfono móvil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis del peso húmedo de organoides NHDF 3D. La medición del peso húmedo de los organoides se realizó en el día 0 y el día 14, al final del proceso de maduración en 3D. El gráfico muestra los valores medios y las desviaciones estándar (NHDF n = 3, 3 organoides/donante en el día 0 y 2 organoides/donante en el día 14 debido a 1 organoide/donante tomado para histología en el día 1), cada punto representa organoides individuales, mientras que cada forma de color representa un donante individual diferente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, y se utilizó una prueba t paramétrica no pareada. Diferencias estadísticas: **p ≤0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis histológico de organoides NHDF 3D. Imágenes representativas de secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) de organoides NHDF durante el proceso de maduración en 3D en los días 1 y 14. Imagen de la derecha: imágenes de baja ampliación, imagen de la izquierda: vista ampliada con indicadores de la siguiente manera: flechas amarillas: capas desconectadas; puntas de flecha amarillas: núcleos con diferentes tamaños y formas; flechas negras: capas fusionadas y deposición de ECM; puntas de flecha negras: filas de células, núcleos con tamaño y elongación similares; Estrellas negras: células en grupos. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los resultados demostrados en este estudio proporcionan información valiosa sobre el establecimiento y la caracterización del modelo de organoide NHDF 3D para el estudio de los tejidos T/L. El protocolo de 3 pasos condujo a la formación de organoides en forma de bastón en 3D que exhiben características típicas del nicho T/L. Este modelo se informó anteriormente en Kroner-Weigl et al. 20237 y se demostró con gran detalle aquí.
Las imágenes de contraste de fase presentadas en la Figura 2 mostraron la progresión de la confluencia de NHDF y la formación de láminas durante las etapas de expansión y estimulación. El proceso de maduración en 3D se llevó a cabo enrollando manualmente las láminas celulares en organoides en forma de varillas en 3D, que luego se cultivaron bajo tensión estática durante 14 días. Los organoides mostraron una apariencia blanca brillante y una densidad aumentada en el día 14, lo que sugiere una contracción y reorganización estructural dentro de los organoides. Esto indicó que el período de maduración es crítico para lograr una estructura más organizada y que imita a los tejidos T/L.
Además, el análisis de peso reveló una disminución significativa en el peso húmedo de los organoides entre los días 0 y 14, lo que indica una vez más una contracción significativa y una reorganización de la MEC dentro de los organoides durante el proceso de maduración. Es importante destacar que las mediciones del peso húmedo pueden variar entre los experimentos debido a la manipulación y al medio residual dentro del organoide o en los platos. Además, el organoide puede contener más medio al principio porque, como se comenta a continuación, en el día 0, las capas formadas por el enrollado de la lámina celular están segregadas y no fusionadas. Con el tiempo, las capas se unieron y se volvieron más compactas, y por lo tanto, el medio podría extruirse.
La evaluación morfológica mediante tinción con H&E proporcionó información adicional sobre las características estructurales del organoide. En el día 1, los organoides exhibieron capas desconectadas, compuestas principalmente por células con núcleos redondos rodeados por una delgada ECM pericelular. La falta de alineación de las celdas paralela al eje de la carga de tracción sugiere que se necesita una mayor maduración para lograr una arquitectura celular y de ECM más organizada de los organoides. A pesar de la contracción y la reducción del peso y la dimensión de los organoides entre los días 1 y 14, la tinción con H&E mostró un aumento en las áreas positivas para eosina, lo que sugiere un aumento del depósito de MEC. Además, ya no había capas visibles y, en ocasiones, las células tenían núcleos alargados y estaban colocadas en filas de células paralelas. Esto señaló que las células dentro de los organoides experimentan una autoorganización al cambiar su propia disposición, así como la deposición, estructura y alineación de ECM, imitando así el comportamiento de la formación de tejido T/L nativo.
En general, estos hallazgos ponen de manifiesto el potencial del modelo de organoide NHDF como una herramienta valiosa para el estudio de la biología T/L, la tenogénesis in vitro e incluso para el desarrollo posterior de la ingeniería T/L sin andamios. Sin embargo, hay tres pasos críticos para el manejo exitoso del modelo de organoide 3D: 1) La formación de una capa celular apretada durante la etapa de estimulación 2D del protocolo. Cuando se utilizan células primarias, esto depende predominantemente de las propiedades de la célula donante; Por lo tanto, es importante evaluar a múltiples donantes en paralelo; 2) El enrollado manual de la hoja de celda. Esto requiere enrollar rápidamente, pero al mismo tiempo suavemente, la lámina de celdas con un raspador de celdas. Por lo tanto, es recomendable planificar los organoides iniciales para entrenar primero este procedimiento; y 3) La fijación estable de los alfileres en los bordes de los organoides. Esta fijación asegura la elongación axial del organoide y evita deformidades, así como el colapso en una estructura similar a un bulto. Además, durante la etapa de maduración 3D, dado que los organoides experimentan una remodelación de la MEC, los alfileres pueden desprenderse repentinamente, por lo tanto, es importante monitorear con frecuencia cada organoide y volver a fijar los alfileres.
El modelo actual aún no ha alcanzado el nivel de mimetismo in vivo con el tejido T/L y presenta una serie de limitaciones. Por ejemplo, requiere un gran número de células por organoide, así como 35 días para que se complete el procedimiento, mientras que la mayoría de los protocolos de diferenciación, como el modelo de pellets condrogénicos en 3D, se establecen en 21 días22. Los pasos de lavado en el procedimiento del protocolo deben llevarse a cabo preferiblemente con tampón de lavado fisiológicamente equilibrado, por ejemplo, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) o Earles Balanced Salt Solution (EBSS), en lugar de PBS, que podría tener consecuencias metabólicas para las células humanas primarias cultivadas in vitro. En cuanto al medio de cultivo utilizado en las etapas de estimulación 2D y maduración 3D en el organoide, se ha elegido la formulación DMEM más 10% de FBS porque es la base de protocolos de diferenciación ampliamente aceptados, así como con la intención de estandarizar y comparar entre diferentes tipos celulares por sus propiedades organoidogénicas23. La reproducción del protocolo de organoides de 3 pasos en diferentes entornos de laboratorio puede verse influenciada por el tipo de célula utilizado, la calidad y el paso de la célula, así como por las propiedades de la célula dependiente del donante. Las variaciones en el equipo, especialmente en la calidad de las placas de cultivo celular de 10 cm24 utilizadas durante la etapa de estimulación 2D, podrían afectar potencialmente la robustez de la formación de la lámina celular. Además, debido a la contracción de la MEC a lo largo de la maduración 3D, la fijación axial de los organoides a través de alfileres podría aflojarse; Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, se recomienda un monitoreo frecuente. Probar y seleccionar diferentes pasadores en términos de diámetro y resistencia también puede reducir el riesgo de desprendimiento de pasadores25. Sin embargo, el uso de pasadores para el estiramiento manual no es robusto y es propenso a la variabilidad del manejo; Por lo tanto, es muy importante desarrollar en la investigación de seguimiento un mecanismo de sujeción para sujetar los bordes de los organoides, lo que puede resultar no solo en la estandarización de este paso, sino que también puede permitir el estiramiento dinámico de los organoides. En general, será de interés investigar dos formas de modificación del modelo de organoide, una reducción de escala: para reducir el número de células por organoide y el tiempo del procedimiento, haciéndolo así más fácil de usar, especialmente para estudios in vitro ; y el segundo escalamiento: aumentar las dimensiones de los organoides con el fin de probar su comportamiento en modelos animales grandes como posible estrategia de reemplazo de tendones.
El modelo demostrado aquí puede proporcionar una plataforma para investigar los mecanismos que subyacen al desarrollo de los tendones, la fisiopatología y, tal vez, la reparación y regeneración si los organoides se combinan con diferentes tipos de células y se someten a microrrupturas. Es importante mencionar que el estudio de Kroner-Weigl et al. 20237 identificó varias limitaciones con respecto al tipo de célula NHDF, a saber, los organoides formados por NHDF son más grandes y celulares que los derivados de las células T/L, lo que dificulta el control de la proliferación y el comportamiento celular. Con respecto a la apoptosis celular, el ensayo basado en el marcador de punta de corte de dUTP (TUNEL) de desoxinucleotidil transferasa terminal no mostró evidencia de células muertas en todo el organoide en el día 147, lo que sugiere una difusión adecuada de nutrientes, desechos y oxígeno durante la etapa de maduración 3D. Curiosamente, a pesar de las diferencias morfológicas, el cribado piloto mediante PCR cuantitativa de una serie de genes relacionados con T/L (incluidos diferentes tipos de colágeno, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), etcétera) sugirió una expresión génica comparable entre los organoides NHDF y T/L7, un hallazgo que debe investigarse más a fondo y validarse a nivel de proteína. Por lo tanto, para este tipo de célula, se requiere una mayor optimización para apoyar la diferenciación T/L y puede basarse en el ajuste del medio utilizado en las etapas de estimulación 2D y maduración 3D (por ejemplo, concentración sérica, factores de crecimiento, vitaminas), extendiendo el tiempo de maduración o incluso sometiendo a los organoides a un estiramiento mecánico dinámico. La evolución del protocolo podría mejorar aún más las propiedades composicionales, estructurales y funcionales de los organoides, lo que permitiría que el modelo imitara mejor el nicho de tejido T/L in vivo del complejo. Además, se pueden investigar fuentes celulares alternativas para determinar su capacidad de formar organoides T/L y si pueden sufrir diferenciación T/L. Yan et al. 20209, emplearon el modelo de organoide 3D utilizando células madre/progenitoras de tendones jóvenes/sanas y envejecidas/degenerativas (Y-TSPCs y A-TSPCs) para investigar el comportamiento celular en 3D, así como si la capacidad de formación de tendones cambia con el envejecimiento T/L. Informaron que los organoides A-TSPC 3D exhiben una morfología tisular pobre, y las células dentro tienen una tasa de proliferación más baja, pero una apoptosis más alta paralela a niveles elevados de marcadores relacionados con la senescencia9. Por lo tanto, el modelo de organoide T/L 3D es una plataforma prometedora para estudiar los mecanismos moleculares y celulares implicados en el envejecimiento de los tendones y, además, puede utilizarse para probar nuevas terapias farmacológicas para la reparación y regeneración de los tendones. En un enfoque diferente, Chu et al. 2021 implementaron células de folículos dentales (DFC) en el modelo de organoide 3D para evaluar su diferenciación ligamentógena. Este tipo de célula formó organoides muy bien organizados, lo que sugiere que las DFC son una fuente celular atractiva para diferenciarse en el tejido del ligamento periodontal (PDL), que podría, a su vez, desarrollar una estrategia terapéutica prometedora para la periodontitis8.
En el futuro, el modelo podría volverse aún más complejo al incluir diferentes tipos de células (por ejemplo, miofibroblastos, macrófagos), lo que puede ofrecer nuevos conocimientos sobre los comportamientos específicos de las células y la diafonía celular dentro de los organoides y contribuir a una comprensión más completa de la biología, fisiología y fisiopatología de T/L 8,9,16,26.
Los modelos de organoides 3D tienen varias ventajas para las aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Imitan de cerca la composición y organización celular, así como las interacciones célula a célula y célula a matriz de los tejidos humanos, lo que ofrece una plataforma fisiológicamente relevante para estudiar los mecanismos de las enfermedades y las respuestas a los medicamentos27. Los organoides pueden utilizarse como una plataforma de cribado de alto rendimiento para evaluar la eficacia, pero también los posibles efectos secundarios de diferentes fármacos, y proporcionar una alternativa fiable y de bajo coste a los ensayos con animales. Además, permiten comparaciones directas entre condiciones sanas y enfermas, lo que permite el descubrimiento de cambios moleculares y celulares clave asociados con diversas patologías, la identificación de biomarcadores para la detección temprana de enfermedades, así como la facilitación de la comprensión avanzada de los mecanismos de la enfermedad y el desarrollo de terapias dirigidas28,29.
En conjunto, demostramos con gran detalle los pasos del modelo de organoide T/L 3D previamente establecido que proporciona una plataforma prometedora para estudiar la biología de los tejidos T/L y los procesos tenógenos in vitro de varios tipos de células. Se recomienda encarecidamente una mayor implementación, optimización e investigación de este modelo, ya que pueden conducir al avance de estrategias de ingeniería de T/L sin andamios, que, a su vez, pueden contribuir a mejorar la terapia de T/L.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
D.D. y S.M.-D. reconocer la subvención del BMBF "CellWiTaL: Sistemas celulares reproducibles para la investigación de fármacos - impresión láser sin capas de transferencia de células individuales altamente específicas en estructuras celulares tridimensionales" Propuesta Nr. 13N15874. D.D. y V.R.A. reconocen la subvención EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "Formación holística de las investigaciones sobre la osteoartritis de próxima generación" GA Nr. 101034412. Todos los autores agradecen a la Sra. Beate Geyer por su asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H.
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
