Summary
Her demonstrerer vi en tre-trinns organoidmodell (todimensjonal [2D] ekspansjon, 2D-stimulering, tredimensjonal [3D] modning) som tilbyr et lovende verktøy for senegrunnforskning og en potensiell stillasfri metode for senevevsteknikk.
Abstract
Sener og leddbånd (T/L) er sterke hierarkisk organiserte strukturer som forener muskel- og skjelettsystemet. Disse vevene har en strengt arrangert kollagen type I-rik ekstracellulær matrise (ECM) og T / L-avstamningsceller hovedsakelig plassert i parallelle rader. Etter skade krever T/L lang tid for rehabilitering med høy sviktrisiko og ofte utilfredsstillende reparasjonsresultater. Til tross for nylige fremskritt innen T / L-biologisk forskning, er en av de gjenværende utfordringene at T / L-feltet fortsatt mangler en standardisert differensieringsprotokoll som er i stand til å rekapitulere T / L-dannelsesprosessen in vitro. For eksempel krever ben- og fettdifferensiering av mesenkymale forløperceller bare standard todimensjonal (2D) cellekultur og tilsetning av spesifikke stimuleringsmedier. For differensiering til brusk er tredimensjonal (3D) pelletskultur og tilskudd av TGFß nødvendig. Imidlertid trenger celledifferensiering til sene en veldig ryddig 3D-kulturmodell, som ideelt sett også bør utsettes for dynamisk mekanisk stimulering. Vi har etablert en 3-trinns (ekspansjon, stimulering og modning) organoidmodell for å danne en 3D-stavlignende struktur ut av et selvmontert celleark, som leverer et naturlig mikromiljø med sine egne ECM-, autokrine og parakrine faktorer. Disse stavlignende organoidene har en flerlags cellulær arkitektur i rik ECM og kan håndteres ganske enkelt for eksponering for statisk mekanisk belastning. Her demonstrerte vi 3-trinns protokollen ved å bruke kommersielt tilgjengelige dermale fibroblaster. Vi kunne vise at denne celletypen danner robuste og ECM-rike organoider. Den beskrevne prosedyren kan optimaliseres ytterligere når det gjelder kulturmedier og optimaliseres mot dynamisk aksial mekanisk stimulering. På samme måte kan alternative cellekilder testes for deres potensial til å danne T / L-organoider og dermed gjennomgå T / L-differensiering. I sum kan den etablerte 3D T / L organoide tilnærmingen brukes som en modell for senegrunnforskning og til og med for stillasfri T / L-engineering.
Introduction
Sener og leddbånd (T/L) er viktige komponenter i muskel- og skjelettsystemet som gir viktig støtte og stabilitet til kroppen. Til tross for deres kritiske rolle, er disse bindevevene utsatt for degenerasjon og skade, noe som forårsaker smerte og nedsatt mobilitet1. Videre kan deres begrensede blodtilførsel og langsomme helbredende kapasitet føre til kroniske skader, mens faktorer som aldring, repeterende bevegelse og feil rehabilitering ytterligere øker risikoen for degenerasjon og skade2. Konvensjonelle behandlinger, som hvile, fysioterapi og kirurgiske inngrep, er ikke i stand til å gjenopprette T / L-strukturen og funksjonen fullt ut. I løpet av de siste årene har forskere forsøkt å bedre forstå den intrikate naturen til T / L for å søke effektive behandlinger for T / L-lidelser 3,4,5. T/L kjennetegnes av en hierarkisk organisert, ekstracellulær matrise (ECM)-dominert struktur, hovedsakelig sammensatt av type I kollagenfibre og proteoglykaner, en egenskap som er vanskelig å replikere in vitro6. Tradisjonelle todimensjonale (2D) cellekulturmodeller klarer ikke å fange den karakteristiske tredimensjonale (3D) organisasjonen av T / L-vev, noe som begrenser deres translasjonspotensial, samt hindrer den innovative fremgangen innen T / L-regenerering.
Nylig har utviklingen av 3D-organoidmodeller gitt nye muligheter for å fremme grunnforskning og stillasfri vevsteknikk av ulike vevstyper 7,8,9,10,11,12,13. For eksempel, for å undersøke myotendinøs kryss, utviklet Larkin et al. 2006 3D-skjelettmuskelkonstruksjoner sammen med selvorganiserte senesegmenter avledet fra rottehalesene10. Videre regisserte Schiele et al. 2013, ved å bruke mikromaskinerte fibronektinbelagte vekstkanaler, selvmontering av humane dermale fibroblaster for å danne cellulære fibre uten hjelp av 3D-stillas, en tilnærming som kan fange viktige trekk ved embryonal seneutvikling11. I studien av Florida et al. 2016 ble benmargsstromale celler først utvidet til bein- og ligamentlinjer, deretter brukt til å generere selvmonterte monolagscelleark, som deretter ble implementert for å lage en multifasisk bein-ligament-beinkonstruksjon som etterligner det innfødte fremre korsbåndet, en modell som tar sikte på forbedret forståelse av ligamentregenerering12. For å belyse senemekanotransduksjonsprosesser benyttet Mubyana et al. 2018 en stillasfri metodikk der enkeltsenefibre ble opprettet og utsatt for mekanisk belastningsprotokoll13. Organoider er selvorganiserte 3D-strukturer som etterligner den opprinnelige arkitekturen, mikromiljøet og funksjonaliteten til vev. 3D organoidkulturer gir en mer fysiologisk relevant modell for å studere vevs- og organbiologi samt patofysiologi. Slike modeller kan også brukes til å indusere vevsspesifikk differensiering av forskjellige stam-/stamcelletyper14,15. Derfor blir implementering av 3D-organoidmodeller innen T / L-biologi og vevsteknikk en veldig attraktiv tilnærming 9,16. Alternative cellekilder kan implementeres for organoidforsamlingen og stimuleres mot tenogen differensiering. En relevant celletype som brukes til demonstrasjon i denne studien er dermale fibroblaster 7,17,18. Disse cellene er lett tilgjengelige gjennom en hudbiopsiprosedyre, som er mindre invasiv sammenlignet med benmargpunktering eller fettsuging og kan multipliseres ganske raskt til store mengder på grunn av deres gode proliferative kapasitet. I motsetning til dette er mer spesialiserte celletyper, som T / L-residente fibroblaster, mer utfordrende å isolere og utvide. Derfor ble dermal fibroblaster også brukt som utgangspunkt for celleomprogrammeringsteknologier mot induserte pluripotente embryonale stamceller19. Å utsette dermale fibroblaster for spesifikke 3D-kulturforhold og signalsignaler, for eksempel transformerende vekstfaktor-beta 3 (TGFß3), som har blitt rapportert å fungere som en nøkkelregulator for forskjellige cellulære prosesser, inkludert dannelse og vedlikehold av T / L, kan potensere deres in vitro tenogene differensiering som fører til ekspresjon av senespesifikke gener og avsetning av T / L-typisk ECM20, 21.
Her beskriver og demonstrerer vi en tidligere etablert og implementert 3-trinns (2D-utvidelse, 2D-stimulering og 3D-modning) organoidprotokoll ved bruk av kommersielt tilgjengelige normale voksne humane dermal fibroblaster (NHDF) som cellekilde, og tilbyr en verdifull modell for å studere in vitro tenogenese7. Til tross for at denne modellen ikke er ekvivalent med in vivo T/L-vev, gir den fortsatt et mer fysiologisk relevant system som kan brukes til å undersøke cellulære differensieringsmekanismer, etterligne T/L-patofysiologi in vitro og etablere T/L-persontilpasset medisin og legemiddelscreeningsplattformer. Videre kan studier i fremtiden evaluere om 3D-organoidene er egnet for stillasfri T / L-prosjektering ved ytterligere optimalisering, samt brukbar for utvikling av oppskalerte mekanisk robuste konstruksjoner som ligner dimensjonene og strukturelle og biofysiske egenskapene til innfødte T / L-vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle trinnene må utføres ved hjelp av aseptiske teknikker.
1. Kultur og pre-utvidelse av NHDFs
- Tine raskt kryohetteglasset som inneholder voksne kryopreserverte normale humane fibroblaster (NHDF, 1 x 106 celler) ved 37 °C til de nesten tiner.
- Tilsett sakte 1 ml forvarmet fibroblastvekstmedium 2 (bruksklart sett inkludert basalmedium, 2% føtalkalveserum (FCS), basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) og insulin) supplert med 1% penicillin / streptomycin (penn / streptokokker) (NHDF medium), forvarmet ved 37 ° C til cellene.
- Overfør cellene til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern supernatanten. Resuspender cellepelleten i 12 ml forvarmet NHDF-medium.
- Overfør cellene til en T-75-kolbe og rist kort på tvers. Plasser T-75-kolben ved 37 °C i en 5 % CO2 fuktet inkubator.
- Bytt medium hver 2. Observer NHDFene under et mikroskop til de når 70% - 80% sammenløp.
2. 2D-utvidelse
- Ta ut T-75-kolben til inkubatoren og fjern NHDF-mediet. Vask cellene med forvarmet fosfatbuffersaltvann (PBS).
- Tilsett 3 ml 0,05% trypsin-EDTA til cellene. Inkuber cellene ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet inkubator til cellene løsner fra kolben (ca. 3 min).
- Tilsett 6 ml forvarmet NHDF-medium for å nøytralisere trypsinvirkningen. Overfør cellene til et 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved RT og fjern supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) lav glukose supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1x MEM aminosyrer, 1% penn / streptokokker, forvarmet ved 37 ° C.
- Plate NHDFene i en 10 cm vedheftende cellekulturskål med en tetthet på 8 x 103 NHDFs/cm2 (totalt 4,4 x 105 NHDFer per 10 cm tallerken). Gyng forsiktig på en tverrvis måte.
- Plasser 10 cm cellekulturfat ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet inkubator. Bytt medium hver 2.
- Overvåk cellene under et mikroskop til du når 100% konfluens (ca. 5 dager).
3. 2D-stimulering
- Ta ut 10 cm cellekulturskålene som inneholder NHDFene (fra trinn 2,6 og 2,7) fra inkubatoren. Fjern kulturmediet og vask cellene med forvarmet PBS.
- Tilsett 10 ml DMEM høyglukosemedium supplert med 10 % FBS, 50 μg/ml askorbinsyre og 1 % penn/streptokokker, forvarmet ved 37 °C.
- Sett petriskålen på 37 °C i en 5 % CO2 fuktig atmosfære. Bytt medium hver 2.
- Overvåk NHDFene under et mikroskop i 14 dager.
4. 3D modning
- Ta ut 10 cm cellekulturskålen fra inkubatoren og fjern DMEM høyt glukosemedium.
- Løsne forsiktig og raskt det dannede cellearket fra fatet med en celleskraper. Mens du løsner, ruller du samtidig cellearket inn i en 3D-stanglignende organoid.
- Plukk opp og legg NHDF-organoidene i en 10 cm ikke-adherent (for celler) petriskål. Denne paraboltypen brukes for å unngå celleutvandring fra organoiden til plasten.
- På dette tidspunktet eller dagen etter (dag 0 eller dag 1 av 3D-modning), samle noen av organoidene for videre analyser som våtvekt, histologisk evaluering (dag 1 organoider er å foretrekke da de blir mer kompakte), RNA og proteinisolering.
- Fest kantene på organoiden med metallpinner som følger:
- Hold den ene siden av organoid forsiktig med en pinsett, og med en annen pinsett, bruk forsiktig manuell strekking på ca. 10% aksial forlengelse. For å estimere den aksiale forlengelsen på 10 %, bruk et millimeterpapir eller linjal.
- Deretter plukker du opp en metallpinne med pinsetten og trykker manuelt ned gjennom organoidkanten inn i plastfatet for å fikse det. Gjenta denne prosedyren med den andre pinnen på den andre kanten av organoiden.
- Tilsett 10 ml DMEM høyglukosemedium supplert med 10 % FBS, 1x MEM-aminosyrer, 50 μg/ml askorbinsyre, 10 ng/ml TGFß3 og 1 % penn/streptokokker, forvarmet ved 37 °C.
- Plasser 10 cm tallerkenen ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet atmosfære. Bytt medium hver 2.
- Overvåk organoider regelmessig i 14 dager.
MERK: Pinner kan løsne opp, og dermed refikse på nytt ved hjelp av samme teknikk som beskrevet i trinn 4.5. - Etter 14 dager, fjern DMEM høyt glukosemedium fra organoider. Vask organoider med forvarmet PBS.
- Mål organoider for våtvekt på dag 0 og dag 14 ved hjelp av en presisjonsskala.
- Legg en tom 10 cm tallerken på vekten og tare vekten til null for å sikre at bare vekten av organoidene måles. Fjern kulturmediet helt fra 10 cm-fatet og mål organoidens våtvekt en etter en.
MERK: I denne studien, på dag 0, ble tre organoider per donor, og på dag 14, to organoider per donor veid.
- Legg en tom 10 cm tallerken på vekten og tare vekten til null for å sikre at bare vekten av organoidene måles. Fjern kulturmediet helt fra 10 cm-fatet og mål organoidens våtvekt en etter en.
- I henhold til studieformålene, implementere noen av NHDF-organoidene i ytterligere histologiske analyser eller umiddelbart fryse dem i flytende nitrogen ved hjelp av sterile DNA / RNA-frie rør for påfølgende DNA, RNA og proteinisolering og lagre dem deretter ved -80 ° C.
- For histologisk undersøkelse, fikser hver organoid i 5 ml forkjølt (4 °C) 4% paraformaldehyd i PBS (justert til nøytral pH) i 45 minutter på is, etterfulgt av PBS-vask ved RT (2 x 5 min hver).
- Kryobeskytt de faste organoidene ved hjelp av en sukrosegradient ved å plassere organoidene i glasskrukker for histologi. Inkuber organoidene i 10 % sukrose i PBS-oppløsning i 2 timer ved 4 °C, etter 20 % sukrose/PBS i 2 timer ved 4 °C, og til slutt 30 % sukrose/PBS inkubasjon over natten ved 4 °C. Bytt sukroseoppløsningene ved først å pipettere ut og deretter fylle opp med den nye løsningen.
- Legg inn organoider i kryo-medium.
- Legg en kobberplate på tørris i en isoporboks og avkjøl den i 10 minutter.
- Legg deretter en kryomold av plast, forhåndsfylt med kryomedium, på kobberplaten og trykk organoiden forsiktig til bunnen av kryomolden ved hjelp av pinsett. Vent til kryomediet er helt frosset.
- For lange organoider, kutt først i to med en skalpell og legg de to halvdelene parallelt med hverandre i kryomolden. Gjenta prosedyren for hver organoid beregnet på å gjennomgå histologisk analyse.
- Oppbevar prøvene ved -20 °C til kryoseksjonering.
- Bruk en kryotom, kutt organoidene i lengderetningen i 10 μm tykke seksjoner og utsatt for histologisk farging som hematoksylin og eosin (H &E) ved bruk av standardprotokoll8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D T/L organoidmodellen ble tidligere etablert og demonstrert her ved å implementere kommersielt innkjøpt NHDF (n=3, 3 organoider per donor, NHDF ble brukt i passasje 5-8). Modellarbeidsflyten er oppsummert i figur 1. Figur 2 viser representative fasekontrastbilder av NHDF-kultur under pre-ekspansjonen i T-75-kolber (figur 2A) samt i begynnelsen og etter 5 dager med kultur i 2D-ekspansjonstrinnet i 10 cm cellekulturskåler (figur 2B). Figur 2C (representative fasekontrastbilder) viser samløpet av NHDF under 2D-stimulering etter 14 dagers kultur i 10 cm cellekulturskåler. Deretter ble cellearkene manuelt løsnet og samtidig rullet til 3D-stavlignende organoider (ved dag 0 er organoidlengden ca. 6 cm, bredden ca. 0,4 cm), som ble dyrket under 10 % statisk spenning i 14 dager (figur 3, dag 0 og dag 14, representative makroskopiske bilder). Ved dag 14 av 3D-modningsprosessen viste organoidene et glinsende hvitt utseende, kontrahert og virket tettere enn de første organoidene. Våtvekten til organoidene ble målt ved dannelsen (dag 0) og igjen på dag 14 i 3D-modningstrinnet (figur 4). En signifikant reduksjon i våtvekten ble observert, noe som indikerer sammentrekning og ECM-strukturell reorganisering i organoidene i løpet av tidsrommet for dette protokolltrinnet. I tillegg til vektendring, på grunn av sammentrekningen, reduseres organoidlengden også (ved dag 14 er organoidlengden ca. 3,5 cm og bredden er ca. 0,3 cm). I denne prosessen løsnet metallpinnene og måtte festes på nytt; I løpet av de 14 dagene med 3D-modning anbefaler vi derfor å overvåke organoidene ofte. For å evaluere organoidenes morfologi ble lengdesnitt hentet fra NHDF-organoider samlet inn dag 1 og dag 14 i 3D-modningstrinnet og utsatt for H&E-farging (figur 5). På dag 1 viste organoidene frakoblede lag, hovedsakelig sammensatt av celler omgitt av lave mengder ECM. Videre var cellene i organoidlagene ikke justert langs den langsgående organoidaksen som ble brukt som retning for den påførte statiske strekkbelastningen. NHDF-kjernene viste en rund form med varierende størrelser og former. H&E-analyse av organoider dag 14 viste en merkbar økning i eosinsignalet, noe som indikerer ECM-avsetning under 3D-modningsprosessen. På dette tidspunktet viste organoidene smeltede lag, med områder som inneholdt justerte celler. Cellene var ofte i grupper; Imidlertid ble de også organisert i cellerader på enkelte steder. Flertallet av kjernene hadde lignende størrelser og var tidvis langstrakte.
Figur 1: Tegneserie av 3D T / L organoid modell sammensatt av 3 trinn: 2D-utvidelse, 2D-stimulering og 3D-modning. I utgangspunktet ble NHDFer forhåndsutvidet i en T-75-kolbe til de nådde 70% -80% samløp. Deretter ble NHDF dyrket ved hjelp av Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) lavt glukosemedium i en 10 cm cellekulturskål i 5 dager (2D-utvidelse). Cellene ble deretter stimulert med DMEM høyglukosemedium supplert med askorbinsyre i 14 dager med kultur (2D-stimulering). Deretter ble NHDF løsrevet fra den 10 cm klebende parabolen, rullet inn i en 3D-stavlignende organoid, overført og festet i en 10 cm ikke-adherent cellekulturskål fylt med DMEM høyt glukosemedium tilsatt askorbinsyre og Transforming Growth Factor beta 3 (TGFß3) i 14 dager (3D-modning). De dannede 3D-organoidene kan gjennomgå en vurdering av våtvekt, histologisk evaluering, RNA- og proteinisolering og andre analyser (f.eks. Transmisjonselektronmikroskopi, biomekaniske målinger) på forskjellige tidspunkter som dag 0, 1 og 14. Tegneserien ble generert i BioRender-programvaren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative fasekontrastbilder av NHDFer under pre-ekspansjon, 2D-utvidelse og 2D-stimuleringstrinn. (A) NHDFer under pre-ekspansjon i T-75 kolbe. (B) NHDFer på dag 1 og 5 i 2D-ekspansjonstrinnet i en 10 cm cellekulturskål. (C) NHDFs på dag 1 og 14 av 2D stimuleringstrinn i en 10 cm cellekulturskål. Skala barer: 200 μm. Bildene ble tatt med et invertert mikroskop utstyrt med et høyoppløselig kamera. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Brutto morfologi av NHDF 3D-organoider. Representative makroskopiske bilder av NHDF-organoider på dag 0 og 14 i 3D-modningstrinnet. Skala bar: 1 cm. Bildene ble tatt med et mobilkamera. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Våtvektsanalyse av NHDF 3D-organoider. Organoids våtvektmåling var på dag 0 og dag 14, slutten av 3D-modningsprosessen. Grafen viser gjennomsnittsverdier og standardavvik (NHDF n = 3, 3 organoider/donor ved dag 0 og 2 organoider/donor ved dag 14 på grunn av 1 organoide/donor tatt for histologi på dag 1), hver prikk representerer individuelle organoider mens hver fargede form representerer en annen individuell donor. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik, og uparet parametrisk t-test ble benyttet. Statistiske forskjeller: **p ≤0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Histologisk analyse av NHDF 3D-organoider. Representative bilder av hematoksylin og eosin (H&E) fargede seksjoner av NHDF-organoider under 3D-modningsprosessen på dag 1 og 14. Høyre bilde - bilder med lav forstørrelse, venstre bilde - forstørret visning med indikatorer som følger: gule piler - frakoblede lag; gule pilspisser - kjerner med varierende størrelser og former; svarte piler - smeltede lag og ECM-avsetning; svarte pilespisser - cellerader, kjerner med tilsvarende størrelse og forlengelse; svarte stjerner -celler i grupper. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultatene demonstrert i denne studien gir verdifull innsikt i etablering og karakterisering av NHDF 3D organoidmodell for å studere T / L-vev. 3-trinns protokollen førte til dannelsen av 3D-stavlignende organoider som viser typiske trekk ved T / L-nisje. Denne modellen er tidligere omtalt i Kroner-Weigl et al. 20237 og demonstrert i detalj her.
Fasekontrastbildene presentert i figur 2 viste progresjonen av NHDF-konfluens og arkdannelse under ekspansjons- og stimuleringstrinnene. 3D-modningsprosessen ble utført ved å manuelt rulle cellearkene inn i 3D-stavlignende organoider, som deretter ble dyrket under statisk spenning i 14 dager. Organoidene viste et glinsende hvitt utseende og økt tetthet ved dag 14, noe som tyder på sammentrekning og strukturell omorganisering i organoidene. Dette indikerte at modningsperioden er kritisk for å oppnå en mer organisert og T/L vevslignende struktur.
Videre viste vektanalyse en signifikant reduksjon i våtvekten av organoider mellom dag 0 og 14, nok en gang indikerer signifikant sammentrekning og ECM-reorganisering i organoidene under modningsprosessen. Det er viktig at våtvektmålinger kan variere mellom eksperimenter på grunn av håndtering og restmedium i organoiden eller i oppvasken. Videre kan organoid inneholde mer medium i begynnelsen fordi, som diskutert nedenfor, på dag 0, lagene dannet av cellearkrullingen er segregert og ikke smeltet. Med tiden sluttet lagene seg sammen og ble mer kompakte, og dermed kan mediet ekstruderes.
Morfologisk evaluering ved H&E-farging ga ytterligere innsikt i de organoide strukturelle egenskapene. På dag 1 viste organoidene frakoblede lag, hovedsakelig sammensatt av celler med runde kjerner omgitt av tynn pericellulær ECM. Mangelen på cellejustering parallelt med strekkbelastningens akse antydet at ytterligere modning er nødvendig for å oppnå en mer organisert cellulær og ECM-arkitektur av organoidene. Til tross for sammentrekning og organoid vekt- og dimensjonsreduksjon mellom dag 1 og 14, viste H&E-fargingen en økning i eosinpositive områder, noe som tyder på forstørret ECM-avsetning. Videre var det ikke lenger synlige lag, og noen ganger hadde cellene langstrakte kjerner og ble plassert i parallelle cellerader. Dette påpekte at cellene i organoidene gjennomgår selvorganisering ved å endre sitt eget arrangement samt ECM-avsetning, struktur og justering, og dermed etterligne oppførselen til den opprinnelige T / L-vevsdannelsen.
Samlet sett fremhever disse funnene potensialet til NHDF-organoidmodellen som et verdifullt verktøy for å studere T / L-biologi, in vitro tenogenese, og til og med for videreutvikling av stillasfri T / L-engineering. Det er imidlertid tre kritiske trinn for vellykket håndtering av 3D-organoidmodellen: 1) Dannelsen av et tett celleark under 2D-stimuleringsstadiet av protokollen. Ved bruk av primære celler avhenger dette hovedsakelig av donorcelleegenskapene; Derfor er det viktig å vurdere flere givere parallelt; 2) Den manuelle rullingen av cellearket. Dette krever rulling raskt, men samtidig forsiktig, cellearket ved hjelp av en celleskraper. Derfor er det tilrådelig å planlegge innledende organoider for først å trene denne prosedyren; og 3) Den stabile fikseringen av pinnene ved organoidkantene. Denne fikseringen sikrer organoid aksial forlengelse og forhindrer deformiteter, samt kollapser i klumplignende struktur. Videre, under 3D-modningsstadiet, siden organoidene opplever ombygging av ECM, kan pinnene plutselig løsne, derfor er det viktig å ofte overvåke hver organoid og å fikse pinnene på nytt.
Den nåværende modellen har ennå ikke nådd nivået av in vivo etterligning til T / L-vev og har en rekke begrensninger. For eksempel krever det et stort antall celler per organoid samt 35 dager for at prosedyren skal fullføres, mens de fleste differensieringsprotokoller, for eksempel 3D kondrogen pelletsmodell, er satt til 21 dager22. Vasketrinnene i protokollprosedyren bør fortrinnsvis utføres med fysiologisk balansert vaskebuffer, for eksempel Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) eller Earles Balanced Salt Solution (EBSS), i stedet for PBS som kan ha metabolske konsekvenser for primære humane celler dyrket in vitro. Når det gjelder kulturmediet som brukes i 2D-stimulerings- og 3D-modningsstadiene i organoiden, har det blitt valgt DMEM pluss 10% FBS-formulering fordi dette er grunnlaget for allment aksepterte differensieringsprotokoller, samt med den hensikt å standardisere og sammenligne mellom forskjellige celletyper for deres organoidogeneegenskaper23. Reproduksjon av 3-trinns organoidprotokollen på tvers av forskjellige laboratorieinnstillinger kan påvirkes av celletype som brukes, cellekvalitet og passasje, samt donoravhengige celleegenskaper. Variasjoner i utstyret, spesielt i kvaliteten på de 10 cm cellekulturskålene24 som ble brukt under 2D-stimuleringstrinnet, kan potensielt påvirke robustheten til cellearkdannelsen. Videre, på grunn av ECM-sammentrekning over 3D-modningen, kan den aksiale fikseringen av organoidene via pinner løsne opp; Derfor, som nevnt ovenfor, anbefales hyppig overvåking. Testing og valg av forskjellige pinner når det gjelder diameter og styrke kan også redusere risikoen for pinneavløsning25. Bruk av pinner for manuell strekking er imidlertid ikke robust, og det er utsatt for å håndtere variasjon; Derfor er det svært viktig å utvikle i oppfølgingsforskning en klemmemekanisme for å holde organoidkantene, noe som ikke bare kan resultere i standardisering av dette trinnet, men kan også tillate dynamisk strekking av organoider. Generelt vil det være av interesse å undersøke to måter å modifisere organoidmodellen på, en nedskalering - for å redusere antall celler per organoid og prosedyretid, og dermed gjøre det mer brukervennlig, spesielt for in vitro-studier ; og den andre oppskaleringen - å øke dimensjonene til organoidene for å teste deres oppførsel i store dyremodeller som potensiell seneutskiftingsstrategi.
Modellen som demonstreres her kan gi en plattform for å undersøke mekanismene bak seneutvikling, patofysiologi, og kanskje reparasjon og regenerering hvis organoidene kombineres med forskjellige celletyper og utsettes for mikrorupturer. Det er viktig å nevne at studien til Kroner-Weigl et al. 20237 identifiserte flere begrensninger angående NHDF-celletypen, nemlig at NHDF-formede organoider er større og mer cellulære enn de som er avledet fra T/L-celler, noe som gjør det utfordrende å kontrollere celleproliferasjon og oppførsel. Med hensyn til celleapoptose viste terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) -basert analyse ingen tegn på døde celler gjennom organoid ved dag 147, noe som tyder på passende diffusjon av næringsstoffer, avfall og oksygen under 3D-modningstrinnet. Interessant, til tross for de morfologiske forskjellene, foreslo pilotscreening ved kvantitativ PCR av en rekke T / L-relaterte gener (inkludert forskjellige kollagentyper, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), etc.) sammenlignbart genuttrykk mellom NHDF og T / L-organoider7, et funn som bør undersøkes videre, så vel som bør valideres på proteinnivå. Derfor, for denne celletypen, er det nødvendig med ytterligere optimalisering for å støtte T / L-differensiering og kan baseres på å justere mediet som brukes i 2D-stimulering og 3D-modningstrinn (f.eks. Serumkonsentrasjon, vekstfaktorer, vitaminer), forlenge modningstiden eller til og med utsette organoidene for dynamisk mekanisk strekk. Utvikling av protokollen kan ytterligere forbedre organoid komposisjonelle, strukturelle og funksjonelle egenskaper, og dermed gjøre det mulig for modellen å bedre etterligne komplekset in vivo T / L vevsnisje. Videre kan alternative cellekilder undersøkes for deres evne til å danne T / L-organoider og om de kan gjennomgå T / L-differensiering. Yan et al. 20209, benyttet 3D-organoidmodellen ved å bruke unge/friske og eldre/degenerative senestamme-/stamceller (Y-TSPC og A-TSPCs) for å undersøke cellulær oppførsel i 3D, samt om senedannende kapasitet endres med T/L-aldring. De rapporterte at A-TSPC 3D-organoider utviser dårlig vevsmorfologi, og cellene i har en lavere spredningshastighet, men høyere apoptose parallelt med forhøyede nivåer av senescensrelaterte markører9. Derfor er T / L 3D organoidmodellen en lovende plattform for å studere molekylære og cellulære mekanismer involvert i senens aldring og videre kan brukes til å teste nye farmakologiske terapier for senereparasjon og regenerering. I en annen tilnærming implementerte Chu et al. 2021 dentale follikelceller (DFC) i 3D-organoidmodellen for å vurdere deres ligamentogene differensiering. Denne celletypen dannet svært velorganiserte organoider, og dermed foreslo DFC som en attraktiv cellekilde for å differensiere i periodontal ligament (PDL) vev, som igjen kunne utvikle en lovende terapeutisk strategi for periodontitt8.
I fremtiden kan modellen bli enda mer kompleks ved å inkludere forskjellige celletyper (f.eks. myofibroblaster, makrofager), som kan gi ny innsikt i cellespesifikk atferd og cellulær crosstalk i organoider og bidra til en mer omfattende forståelse av T / L-biologi, fysiologi og patofysiologi 8,9,16,26.
3D-organoidmodellene har flere fordeler for vevsteknikk og regenerativ medisin. De etterligner tett cellulær sammensetning og organisasjon, samt celle-til-celle- og celle-til-matrise-interaksjoner av humant vev, og tilbyr dermed en fysiologisk relevant plattform for å studere sykdomsmekanismer og legemiddelresponser27. Organoider kan brukes som en høy gjennomstrømningsscreeningsplattform for å vurdere effektiviteten, men også potensielle bivirkninger av forskjellige stoffer og gi et pålitelig og rimelig alternativ til dyreforsøk. Videre muliggjør de direkte sammenligninger mellom friske og syke tilstander, noe som gjør det mulig å oppdage viktige molekylære og cellulære endringer assosiert med ulike patologier, identifisering av biomarkører for tidlig sykdomsdeteksjon, samt tilrettelegging for oppstegne forståelse av sykdomsmekanismer og utvikling av målrettede terapier28,29.
Samlet demonstrerte vi i stor detalj trinnene i den tidligere etablerte 3D T / L-organoidmodellen som gir en lovende plattform for å studere T / L-vevsbiologi og in vitro tenogene prosesser av forskjellige celletyper. Videre implementering, optimalisering og forskning av denne modellen oppfordres sterkt, da de kan føre til å fremme stillasfrie T / L-tekniske strategier, som igjen kan bidra til å forbedre T / L-terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
D.D. og S.M.-D. "CellWiTaL: Reproduserbare cellesystemer for legemiddelforskning - overføring av lagfri laserutskrift av svært spesifikke enkeltceller i tredimensjonale cellulære strukturer" Forslag nr. 13N15874. D.D. og V.R.A. anerkjenner EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS "Holistisk opplæring av neste generasjons slitasjegiktforskning" GA Nr. 101034412. Alle forfattere anerkjenner fru Beate Geyer for teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H.
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
