Summary
Här demonstrerar vi en organoidmodell i tre steg (tvådimensionell [2D] expansion, 2D-stimulering, tredimensionell [3D] mognad) som erbjuder ett lovande verktyg för grundforskning om senor och en potentiell ställningsfri metod för senvävnadsteknik.
Abstract
Senor och ligament (T/L) är starka, hierarkiskt organiserade strukturer som förenar det muskuloskeletala systemet. Dessa vävnader har en strikt ordnad kollagen typ I-rik extracellulär matris (ECM) och T/L-linjeceller huvudsakligen placerade i parallella rader. Efter skada kräver T/L lång tid för rehabilitering med hög risk för fel och ofta otillfredsställande reparationsresultat. Trots de senaste framstegen inom T/L-biologisk forskning är en av de återstående utmaningarna att T/L-fältet fortfarande saknar ett standardiserat differentieringsprotokoll som kan rekapitulera T/L-bildningsprocessen in vitro. Till exempel kräver ben- och fettdifferentiering av mesenkymala prekursorceller endast vanlig tvådimensionell (2D) cellodling och tillsats av specifika stimuleringsmedier. För differentiering till brosk är tredimensionell (3D) pelletsodling och tillskott av TGFß nödvändig. Celldifferentiering till sena kräver dock en mycket ordnad 3D-odlingsmodell, som i idealfallet också bör vara föremål för dynamisk mekanisk stimulering. Vi har etablerat en 3-stegs (expansion, stimulering och mognad) organoidmodell för att bilda en 3D-stavliknande struktur av ett självmonterat cellark, vilket ger en naturlig mikromiljö med sina egna ECM, autokrina och parakrina faktorer. Dessa stavliknande organoider har en flerskiktad cellulär arkitektur inom rik ECM och kan hanteras ganska enkelt för exponering för statisk mekanisk belastning. Här demonstrerade vi 3-stegsprotokollet genom att använda kommersiellt tillgängliga dermala fibroblaster. Vi kunde visa att denna celltyp bildar robusta och ECM-rikliga organoider. Den beskrivna proceduren kan optimeras ytterligare när det gäller odlingsmedia och optimeras mot dynamisk axiell mekanisk stimulering. På samma sätt kan alternativa cellkällor testas för deras potential att bilda T/L-organoider och därmed genomgå T/L-differentiering. Sammanfattningsvis kan den etablerade 3D T/L-organoidmetoden användas som en modell för grundforskning om senor och till och med för ställningsfri T/L-teknik.
Introduction
Senor och ligament (T/L) är viktiga komponenter i muskuloskeletala systemet som ger viktigt stöd och stabilitet till kroppen. Trots sin avgörande roll är dessa bindväv benägna att degeneration och skadas, vilket orsakar smärta och försämring av rörligheten1. Dessutom kan deras begränsade blodtillförsel och långsamma läkningsförmåga leda till kroniska skador, medan faktorer som åldrande, repetitiva rörelser och felaktig rehabilitering ytterligare ökar risken för degeneration och skada2. Konventionella behandlingar, såsom vila, sjukgymnastik och kirurgiska ingrepp, kan inte helt återställa T/L-strukturen och funktionen. Under de senaste åren har forskare strävat efter att bättre förstå den intrikata karaktären hos T/L för att kunna söka effektiva behandlingar för T/L-störningar 3,4,5. T/L kännetecknas av en hierarkiskt organiserad, extracellulär matris (ECM)-dominerad struktur, som främst består av kollagenfibrer av typ I och proteoglykaner, en egenskap som är svår att replikera in vitro6. Traditionella tvådimensionella (2D) cellodlingsmodeller misslyckas med att fånga den karakteristiska tredimensionella (3D) organisationen av T/L-vävnader, vilket begränsar deras translationella potential samt hindrar innovativa framsteg inom området T/L-regenerering.
På senare tid har utvecklingen av 3D-organoidmodeller erbjudit nya möjligheter för att främja grundforskning och ställningsfri vävnadsteknik för olika vävnadstyper 7,8,9,10,11,12,13. Till exempel, för att undersöka myotendinous junction, utvecklade Larkin et al. 2006 3D-skelettmuskelkonstruktioner tillsammans med självorganiserade sensegment som härrör från råttsvanssena10. Dessutom riktade Schiele et al. 2013, genom att använda mikrobearbetade fibronektinbelagda tillväxtkanaler, självorganiseringen av humana dermala fibroblaster för att bilda cellulära fibrer utan hjälp av 3D-ställning, ett tillvägagångssätt som kan fånga viktiga egenskaper hos embryonal senutveckling11. I studien av Florida et al. 2016 utvidgades benmärgsstromaceller först till ben- och ligamentlinjer, därefter användes de för att generera självmonterade monolagercellark, som sedan implementerades för att skapa en multifasisk ben-ligament-benkonstruktion som efterliknar det ursprungliga främre korsbandet, en modell som syftar till förbättrad förståelse av ligamentregenerering12. För att belysa senmekanotransduktionsprocesser använde Mubyana et al. 2018 en ställningsfri metodik genom vilken enstaka senfibrer skapades och utsattes för mekanisk belastningsprotokoll13. Organoider är självorganiserade 3D-strukturer som efterliknar den ursprungliga arkitekturen, mikromiljön och funktionaliteten hos vävnader. 3D-organoidkulturer ger en mer fysiologiskt relevant modell för att studera vävnads- och organbiologi samt patofysiologi. Sådana modeller kan också användas för att inducera vävnadsspecifik differentiering av olika stam-/stamcellstyper14,15. Att implementera 3D-organoidmodeller inom T/L-biologi och vävnadsteknik blir därför ett mycket attraktivt tillvägagångssätt 9,16. Alternativa cellkällor kan implementeras för organoidsammansättningen och stimuleras mot tenogen differentiering. En relevant celltyp som används för demonstration i denna studie är dermala fibroblaster 7,17,18. Dessa celler är lättillgängliga genom en hudbiopsiprocedur, som är mindre invasiv jämfört med benmärgspunktion eller fettsugning och kan föröka sig ganska snabbt till ett stort antal på grund av deras goda proliferativa kapacitet. Däremot är mer specialiserade celltyper, såsom T/L-residenta fibroblaster, mer utmanande att isolera och expandera. Därför användes dermala fibroblaster också som en utgångspunkt för cellomprogrammeringstekniker mot inducerade pluripotenta embryonala stamceller19. Genom att utsätta dermala fibroblaster för specifika 3D-odlingsförhållanden och signalsignaler, såsom transforming growth factor-beta 3 (TGFß3), som har rapporterats fungera som en nyckelregulator för olika cellulära processer, inklusive bildning och underhåll av T/L, kan deras tenogena differentiering in vitro som leder till uttryck av senspecifika gener och deponering av T/L-typisk ECM20. 21. veckor
Här beskriver och demonstrerar vi ett tidigare etablerat och implementerat 3-stegs (2D-expansion, 2D-stimulering och 3D-mognad) organoidprotokoll med hjälp av kommersiellt tillgängliga normala vuxna humana dermala fibroblaster (NHDF) som cellkälla, vilket erbjuder en värdefull modell för att studera in vitro tenogenes7. Trots det faktum att denna modell inte är ekvivalent med in vivo T/L-vävnad, ger den fortfarande ett mer fysiologiskt relevant system som kan användas för att undersöka cellulära differentieringsmekanismer, efterlikna T/L-patofysiologi in vitro och etablera T/L-anpassade medicin- och läkemedelsscreeningplattformar. Dessutom kan studier i framtiden utvärdera om 3D-organoiderna är lämpliga för ställningsfri T/L-teknik genom ytterligare optimering samt kan användas för utveckling av uppskalade mekaniskt robusta konstruktioner som liknar dimensionerna och strukturella och biofysiska egenskaperna hos nativa T/L-vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla steg måste utföras med aseptisk teknik.
1. Kultur och förutvidgning av NHDF
- Tina snabbt den kryoflaska som innehåller kryokonserverade normala humana dermala fibroblaster (NHDF, 1 x 106 celler) vid 37 °C tills de nästan tinar upp.
- Tillsätt långsamt 1 ml förvärmt fibroblasttillväxtmedium 2 (färdigt att använda kit inklusive basalt medium, 2 % fetalt kalvserum (FCS), basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och insulin) kompletterat med 1 % penicillin/streptomycin (pen/streptokocker) (NHDF-medium), förvärmt vid 37 °C till cellerna.
- Överför cellerna till ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 12 ml förvärmt NHDF-medium.
- Överför cellerna till en T-75-kolv och skaka kort på tvären. Placera T-75-kolven vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 % CO2 .
- Byt medium varannan dag. Observera NHDF:erna under ett mikroskop tills de når 70% - 80% sammanflöde.
2. 2D-expansion
- Ta ut T-75-kolven i inkubatorn och avlägsna NHDF-mediet. Tvätta cellerna med förvärmd fosfatbuffertsaltlösning (PBS).
- Tillsätt 3 ml 0,05 % trypsin-EDTA till cellerna. Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 % CO2 tills cellerna lossnar från kolven (ca 3 min).
- Tillsätt 6 ml förvärmt NHDF-medium för att neutralisera trypsinverkan. Överför cellerna till ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid RT och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) låga glukos kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1x MEM-aminosyror, 1 % pen/streptokocker, förvärmd vid 37 °C.
- Platta NHDF:erna i en 10 cm vidhäftande cellodlingsskål med en densitet av 8 x 103 NHDF:er/cm2 (totalt 4,4 x 105 NHDF per 10 cm skål). Gunga försiktigt på tvären.
- Placera den 10 cm långa cellodlingsskålen vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 % CO2 . Byt medium var 2:e dag
- Övervaka cellerna i mikroskop tills de når 100 % sammanflöde (ca 5 dagar).
3. 2D-stimulering
- Ta ut de 10 cm stora cellodlingsskålarna som innehåller NHDF (från steg 2.6 och 2.7) från inkubatorn. Ta bort odlingsmediet och tvätta cellerna med förvärmd PBS.
- Tillsätt 10 ml DMEM högglukosmedium kompletterat med 10 % FBS, 50 μg/ml askorbinsyra och 1 % penna/streptokocker, förvärmt vid 37 °C.
- Placera petriskålen vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 % CO2 . Byt medium varannan dag.
- Övervaka NHDF i mikroskop i 14 dagar.
4. 3D mognad
- Ta ut den 10 cm långa cellodlingsskålen från inkubatorn och ta bort DMEM-mediet med högt glukos.
- Lossa försiktigt och snabbt det formade cellarket från skålen med en cellskrapa. Medan du lossar, rulla samtidigt cellarket till en 3D-stavliknande organoid.
- Plocka upp och placera NHDF-organoiderna i en 10 cm icke-vidhäftande (för celler) petriskål. Denna typ av maträtt används för att undvika cellutvandring från organoiden till plasten.
- Vid denna tidpunkt eller en dag efter (dag 0 eller dag 1 av 3D-mognad), samla in några av organoiderna för ytterligare analyser såsom våtvikt, histologisk utvärdering (dag 1 organoider är att föredra eftersom de blir mer kompakta), RNA och proteinisolering.
- Fixera kanterna på organoiden med metallstift enligt följande:
- Håll försiktigt ena sidan av organoiden med en pincett och med en annan pincett applicerar du försiktigt manuell sträckning på cirka 10 % axiell töjning. För att uppskatta den axiella förlängningen på 10 %, använd en millimeter papper eller linjal.
- Plocka sedan upp ett metallstift med pincetten och tryck manuellt ner genom organoidkanten i plastskålen för att fixa det. Upprepa denna procedur med det andra stiftet på den andra kanten av organoiden.
- Tillsätt 10 ml DMEM högglukosmedium kompletterat med 10 % FBS, 1x MEM-aminosyror, 50 μg/ml askorbinsyra, 10 ng/ml TGFß3 och 1 % penna/streptokocker, förvärmd vid 37 °C.
- Placera den 10 cm långa skålen vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 % CO2 . Byt medium varannan dag.
- Övervaka organoiderna regelbundet i 14 dagar.
OBS: Stiften kan lossna, och därför fixas om med samma teknik som beskrivs i steg 4.5. - Efter 14 dagar avlägsnas DMEM High Glucose Medium från organoiderna. Tvätta organoiderna med förvärmd PBS.
- Mät organoider för våtvikt på dag 0 och dag 14 med hjälp av en precisionsvåg.
- Placera en tom 10 cm skål på vågen och vrid vikten till noll för att säkerställa att endast vikten av organoiderna mäts. Ta bort odlingsmediet helt från den 10 cm långa skålen och mät den organiska våtvikten en efter en.
OBS: I denna studie, vid dag 0, vägdes tre organoider per donator och vid dag 14 två organoider per donator.
- Placera en tom 10 cm skål på vågen och vrid vikten till noll för att säkerställa att endast vikten av organoiderna mäts. Ta bort odlingsmediet helt från den 10 cm långa skålen och mät den organiska våtvikten en efter en.
- Enligt studiens syften, implementera några av NHDF-organoiderna i ytterligare histologiska analyser eller omedelbart frysa dem i flytande kväve med hjälp av sterila DNA/RNA-fria rör för efterföljande DNA-, RNA- och proteinisolering och sedan lagra dem vid -80 °C.
- För histologisk undersökning, fixera varje organoid i 5 ml förkyld (4 °C) 4 % paraformaldehyd i PBS (justerad till neutralt pH) i 45 minuter på is, följt av PBS-tvätt vid RT (2 x 5 min vardera).
- Kryoskydda de fasta organoiderna med hjälp av en sackarosgradient genom att placera organoiderna i glasburkar för histologi. Inkubera organoiderna i 10 % sackaros i PBS-lösning i 2 timmar vid 4 °C, efter 20 % sackaros/PBS i 2 timmar vid 4 °C och slutligen 30 % sackaros/PBS inkubation över natten vid 4 °C. Byt sackaroslösningar genom att först pipettera ut och sedan fylla på med den nya lösningen.
- Bädda in organoiderna i kryomedium.
- Lägg en kopparplatta på torris i en frigolitlåda och låt svalna i 10 min.
- Placera sedan en plastkryomold, förfylld med kryomedium, på kopparplattan och tryck försiktigt organoiden mot botten av kryomolden med en pincett. Vänta tills kryomediet är helt fryst.
- För långa organoider, skär först på mitten med en skalpell och lägg de två halvorna parallellt med varandra i kryomolden. Upprepa proceduren för varje organoid som är avsedd att genomgå histologisk analys.
- Förvara proverna vid -20 °C fram till kryosektion.
- Använd en kryotom, skär organoiderna längsgående i 10 μm tjocka sektioner och föremål för histologisk färgning såsom hematoxylin och eosin (H&E) med hjälp av standardprotokoll8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D T/L organoidmodellen har tidigare etablerats och demonstrerats här genom att implementera kommersiellt inköpt NHDF (n=3, 3 organoider per donator, NHDF användes vid passagerna 5-8). Modellens arbetsflöde sammanfattas i figur 1. Figur 2 visar representativa faskontrastbilder av NHDF-odling under förexpansionen i T-75-flaskor (figur 2A) samt i början och efter 5 dagars odling i 2D-expansionssteget i 10 cm cellodlingsskålar (figur 2B). Figur 2C (representativa faskontrastbilder) visar sammanflödet av NHDF under 2D-stimulering efter 14 dagars odling i de 10 cm stora cellodlingsskålarna. Därefter lossades cellarken för hand och rullades samtidigt till 3D-stavliknande organoider (vid dag 0 är organoidlängden cirka 6 cm, bredden cirka 0,4 cm), som odlades under 10 % statisk spänning i 14 dagar (Figur 3, dag 0 och dag 14, representativa makroskopiska bilder). På dag 14 av 3D-mognadsprocessen uppvisade organoiderna ett glittrande vitt utseende, drog ihop sig och verkade tätare än de ursprungliga organoiderna. Våtvikten hos organoiderna mättes vid tidpunkten för bildningen (dag 0) och igen på dag 14 i 3D-mognadssteget (figur 4). En signifikant minskning av våtvikten observerades, vilket tyder på kontraktion och ECM-strukturell omorganisation inom organoiderna under tidsperioden för detta protokollsteg. Förutom viktförändringen, på grund av sammandragningen, minskade också organoidlängden (på dag 14 är organoidlängden cirka 3,5 cm och bredden är cirka 0,3 cm). I denna process lossnade metallstiften och måste fixeras igen; Under de 14 dagarna av 3D-mognad rekommenderar vi därför att du övervakar organoiderna ofta. För att utvärdera organoidernas morfologi erhölls längsgående snitt från NHDF-organoider som samlats in på dag 1 och dag 14 i 3D-mognadssteget och utsattes för H&E-färgning (Figur 5). På dag 1 uppvisade organoiderna frånkopplade lager, främst bestående av celler omgivna av låga mängder ECM. Dessutom var cellerna i organoidlagren inte inriktade längs den längsgående organoidaxeln som användes som riktning för den applicerade statiska dragbelastningen. NHDF-kärnorna uppvisade en rund form med varierande storlek och form. H&E-analys av dag 14 organoider avslöjade en märkbar ökning av eosin-signalen, vilket indikerar ECM-deposition under 3D-mognadsprocessen. Vid denna tidpunkt uppvisade organoiderna sammansmälta lager, med områden som innehöll inriktade celler. Cellerna var ofta i grupper; Men de var också organiserade i cellrader på vissa platser. Majoriteten av kärnorna hade liknande storlek och var ibland långsträckta.
Figur 1: Tecknad film av 3D T/L organoidmodell som består av 3 steg: 2D-expansion, 2D-stimulering och 3D-mognad. Till en början expanderades NHDF i förväg i en T-75-kolv tills de nådde 70%-80% sammanflöde. Därefter odlades NHDF med hjälp av Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) lågglukosmedium i en 10 cm cellodlingsskål under 5 dagar (2D-expansion). Cellerna stimulerades sedan med DMEM högt glukosmedium kompletterat med askorbinsyra under 14 dagars odling (2D-stimulering). Därefter lossades NHDF från den 10 cm vidhäftande skålen, rullades in i en 3D-stavliknande organoid, överfördes och fixerades i en 10 cm icke-vidhäftande cellkulturskål fylld med DMEM högglukosmedium kompletterat med askorbinsyra och Transforming Growth Factor beta 3 (TGFß3) i 14 dagar (3D-mognad). De bildade 3D-organoiderna kan genomgå en bedömning av våtvikt, histologisk utvärdering, RNA- och proteinisolering och andra analyser (t.ex. transmissionselektronmikroskopi, biomekaniska mätningar) vid olika tidpunkter såsom dag 0, 1 och 14. Teckningen genererades i programvaran BioRender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa faskontrastbilder av NHDF under förexpansion, 2D-expansion och 2D-stimulering. A) NHDF under förexpansion i T-75-kolv. (B) NHDF på dag 1 och 5 av 2D-expansionssteget i en 10 cm cellodlingsskål. (C) NHDF vid dag 1 och 14 av 2D-stimuleringssteget i en 10 cm cellodlingsskål. Skalstänger: 200 μm. Bilderna togs med ett inverterat mikroskop utrustat med en högupplöst kamera. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Grov morfologi hos NHDF 3D-organoider. Representativa makroskopiska bilder av NHDF-organoider på dag 0 och 14 i 3D-mognadssteget. Skalstreck: 1 cm. Bilderna är tagna med en mobilkamera. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Våtviktsanalys av NHDF 3D-organoider. Organoidernas våtviktsmätning skedde vid dag 0 och dag 14, i slutet av 3D-mognadsprocessen. Grafen visar medelvärden och standardavvikelser (NHDF n = 3, 3 organoider/donator vid dag 0 och 2 organoider/donator vid dag 14 på grund av att 1 organoid/donator togs för histologi vid dag 1), varje prick representerar enskilda organoider medan varje färgad form representerar en annan individuell givare. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse, och ett oparat parametriskt t-test användes. Statistiska differenser: **p ≤0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Histologisk analys av NHDF 3D-organoider. Representativa bilder av hematoxylin och eosin (H&E) färgade sektioner av NHDF-organoider under 3D-mognadsprocessen vid dag 1 och 14. Höger bild - bilder med låg förstoring, vänster bild - förstorad vy med indikatorer enligt följande: gula pilar - frånkopplade lager; gula pilspetsar - kärnor med olika storlekar och former; svarta pilar - smälta lager och ECM-avsättning; svarta pilspetsar - cellrader, kärnor med liknande storlek och töjning; svarta stjärnor - celler i grupper. Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultaten som visas i denna studie ger värdefulla insikter i etableringen och karakteriseringen av NHDF 3D-organoidmodellen för studier av T/L-vävnader. 3-stegsprotokollet ledde till bildandet av 3D-stavliknande organoider som uppvisar typiska egenskaper hos T/L-nischen. Denna modell har tidigare rapporterats i Kroner-Weigl et al. 20237 och demonstreras i detalj här.
Faskontrastbilderna som presenterades i figur 2 visade progressionen av NHDF-sammanflödet och arkbildningen under expansions- och stimuleringsstegen. 3D-mognadsprocessen utfördes genom att manuellt rulla cellarken till 3D-stavliknande organoider, som sedan odlades under statisk spänning i 14 dagar. Organoiderna uppvisade ett glittrande vitt utseende och ökad densitet vid dag 14, vilket tyder på kontraktion och strukturell omorganisation inom organoiderna. Detta indikerade att mognadsperioden är kritisk för att uppnå en mer organiserad och T/L-vävnadsliknande struktur.
Dessutom avslöjade viktanalys en signifikant minskning av våtvikten av organoider mellan dag 0 och 14, vilket återigen indikerar signifikant kontraktion och ECM-omorganisation inom organoiderna under mognadsprocessen. Det är viktigt att notera att våtviktsmätningar kan variera mellan experiment på grund av hantering och restmedium i organoiden eller i disken. Dessutom kan organoiden innehålla mer medium i början eftersom, som diskuteras nedan, vid dag 0, de lager som bildas av cellarkets rullning är segregerade och inte sammansmälta. Med tiden gick lagren samman och blev mer kompakta, och därmed kunde mediet extruderas ut.
Morfologisk utvärdering med H&E-färgning gav ytterligare insikter om de organoida strukturella egenskaperna. På dag 1 uppvisade organoiderna osammanhängande lager, främst bestående av celler med runda kärnor omgivna av tunn pericellulärt ECM. Bristen på cellinriktning parallellt med draglastens axel tyder på att ytterligare mognad behövs för att uppnå en mer organiserad cellulär och ECM-arkitektur hos organoiderna. Trots kontraktionen och minskningen av organoidens vikt och dimension mellan dag 1 och 14, visade H&E-färgningen en ökning av eosinpositiva områden, vilket tyder på ökad ECM-deponering. Dessutom fanns det inte längre några synliga lager, och ibland hade cellerna långsträckta kärnor och var placerade i parallella celrader. Detta pekade på att cellerna inom organoiderna genomgår självorganisering genom att ändra sitt eget arrangemang samt ECM-avsättning, struktur och inriktning, vilket efterliknar beteendet hos den naturliga T/L-vävnadsbildningen.
Sammantaget belyser dessa resultat potentialen hos NHDF-organoidmodellen som ett värdefullt verktyg för att studera T/L-biologi, in vitro-tenogenes och till och med för vidareutveckling av ställningsfri T/L-teknik. Det finns dock tre kritiska steg för en framgångsrik hantering av 3D-organoidmodellen: 1) Bildandet av ett tätt cellark under 2D-stimuleringsstadiet av protokollet. Vid användning av primära celler beror detta främst på donatorcellens egenskaper; Därför är det viktigt att bedöma flera givare parallellt. 2) Den manuella rullningen av cellarket. Detta kräver att du rullar snabbt, men samtidigt försiktigt, cellarket med hjälp av en cellskrapa. Därför är det lämpligt att planera initiala organoider för att först träna denna procedur; och 3) Den stabila fixeringen av stiften vid organoidkanterna. Denna fixering säkerställer organoidens axiella töjning och förhindrar deformiteter samt kollapsar till klumpliknande struktur. Dessutom, under 3D-mognadsstadiet, eftersom organoiderna upplever ombyggnad av ECM, kan stiften plötsligt lossna, därför är det viktigt att ofta övervaka varje organoid och att fixera stiften igen.
Den nuvarande modellen har ännu inte nått nivån av in vivo-mimik till T/L-vävnad och har ett antal begränsningar. Till exempel kräver det ett stort antal celler per organoid samt 35 dagar för att proceduren ska slutföras, medan de flesta differentieringsprotokoll, såsom 3D kondrogen pelletsmodell, är inställda på 21 dagar22. Tvättningsstegen i protokollproceduren bör företrädesvis utföras med fysiologiskt balanserad tvättbuffert, t.ex. Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) eller Earles Balanced Salt Solution (EBSS), snarare än PBS som kan ha metabola konsekvenser för primära humana celler som odlas in vitro. När det gäller odlingsmediet som används i 2D-stimulerings- och 3D-mognadsstadierna i organoiden, har det valts DMEM plus 10 % FBS-formulering eftersom det är grunden för allmänt accepterade differentieringsprotokoll samt med avsikt att standardisera och jämföra mellan olika celltyper för deras organoidogena egenskaper23. Reproduktion av 3-stegs organoidprotokollet i olika laboratoriemiljöer kan påverkas av celltyp som används, cellkvalitet och passage, samt donatorberoende cellegenskaper. Variationer i utrustningen, särskilt i kvaliteten på de 10 cm cellodlingsskålar24 som användes under 2D-stimuleringsstadiet, kan potentiellt påverka robustheten i cellarksbildningen. Dessutom, på grund av ECM-kontraktion över 3D-mognaden, kan den axiella fixeringen av organoiderna via stift lossna; Därför, som nämnts ovan, rekommenderas frekvent övervakning. Att testa och välja olika stift när det gäller diameter och styrka kan också minska risken för att stiften lossnar25. Att använda stift för manuell sträckning är dock inte robust, och det är benäget att hantera variabilitet; Därför är det mycket viktigt att i uppföljande forskning utveckla en klämmekanism för att hålla organoidernas kanter, vilket inte bara kan resultera i standardisering av detta steg, utan också kan tillåta dynamisk sträckning av organoiderna. I allmänhet kommer det att vara av intresse att undersöka två sätt att modifiera organoidmodeller, en nedskalning - för att minska antalet celler per organoid och procedurtid, vilket gör det mer användarvänligt, särskilt för in vitro-studier ; och den andra uppskalningen - för att öka dimensionerna av organoiderna för att testa deras beteende i stora djurmodeller som en potentiell senbytesstrategi.
Modellen som demonstreras här kan ge en plattform för att undersöka mekanismerna bakom senutveckling, patofysiologi och kanske reparation och regenerering om organoiderna kombineras med olika celltyper och utsätts för mikrobristningar. Det är viktigt att nämna att studien av Kroner-Weigl et al. 20237 identifierade flera begränsningar när det gäller NHDF-celltypen, nämligen att de NHDF-bildade organoiderna är större och mer cellulära än de som härrör från T/L-celler, vilket gör det utmanande att kontrollera cellproliferation och beteende. När det gäller cellapoptos visade terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end labeling (TUNEL)-baserad analys inga tecken på döda celler i hela organoiden vid dag 147, vilket tyder på lämplig diffusion av näringsämnen, avfall och syre under 3D-mognadssteget. Intressant nog, trots de morfologiska skillnaderna, föreslog pilotscreening med kvantitativ PCR av ett antal T/L-relaterade gener (inklusive olika kollagentyper, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), etc.) jämförbart genuttryck mellan NHDF och T/L-organoider7, ett fynd som bör undersökas ytterligare samt valideras på proteinnivå. För denna celltyp krävs därför ytterligare optimering för att stödja T/L-differentiering och kan baseras på justering av mediet som används i 2D-stimulering och 3D-mognadssteg (t.ex. serumkoncentration, tillväxtfaktorer, vitaminer), förlängning av mognadstiden eller till och med utsätta organoiderna för dynamisk mekanisk sträckning. En utveckling av protokollet kan ytterligare förbättra organoidernas sammansättning, strukturella och funktionella egenskaper, vilket gör det möjligt för modellen att bättre efterlikna den komplexa in vivo T/L-vävnadsnischen. Dessutom kan alternativa cellkällor undersökas med avseende på deras förmåga att bilda T/L-organoider och om de kan genomgå T/L-differentiering. Yan et al. 20209, använde 3D-organoidmodellen genom att använda unga/friska och åldrade/degenerativa senstam-/stamceller (Y-TSPCs och A-TSPC) för att undersöka cellulärt beteende i 3D samt om senbildningskapaciteten förändras med T/L-åldrande. De rapporterade att A-TSPC 3D-organoider uppvisar dålig vävnadsmorfologi, och cellerna inuti har en lägre proliferationshastighet men högre apoptos parallellt med förhöjda nivåer av åldranderelaterade markörer9. Därför är T/L 3D-organoidmodellen en lovande plattform för att studera molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i senans åldrande och kan vidare användas för att testa nya farmakologiska terapier för reparation och regenerering av senor. I ett annat tillvägagångssätt implementerade Chu et al. 2021 dentala follikelceller (DFC) i 3D-organoidmodellen för att bedöma deras ligamentogena differentiering. Denna celltyp bildade mycket välorganiserade organoider, vilket tyder på att DFC är en attraktiv cellkälla för att differentiera i parodontal ligamentvävnad (PDL), vilket i sin tur skulle kunna utveckla en lovande terapeutisk strategi för parodontit8.
I framtiden kan modellen bli ännu mer komplex genom att inkludera olika celltyper (t.ex. myofibroblaster, makrofager), vilket kan ge nya insikter om cellspecifika beteenden och cellulär överhörning inom organoider och bidra till en mer omfattande förståelse av T/L-biologi, fysiologi och patofysiologi 8,9,16,26.
3D-organoidmodellerna har flera fördelar för tillämpningar inom vävnadsteknik och regenerativ medicin. De efterliknar den cellulära sammansättningen och organisationen samt cell-till-cell- och cell-till-matris-interaktioner i mänskliga vävnader, och erbjuder därigenom en fysiologiskt relevant plattform för att studera sjukdomsmekanismer och läkemedelssvar27. Organoider kan användas som en screeningplattform med hög kapacitet för att bedöma effektiviteten men också potentiella biverkningar av olika läkemedel och ge ett pålitligt och billigt alternativ till djurförsök. Dessutom möjliggör de direkta jämförelser mellan friska och sjuka tillstånd, vilket möjliggör upptäckt av viktiga molekylära och cellulära förändringar i samband med olika patologier, identifiering av biomarkörer för tidig sjukdomsupptäckt samt underlättande av ökad förståelse av sjukdomsmekanismer och utveckling av riktade terapier28,29.
Sammantaget demonstrerade vi i detalj stegen i den tidigare etablerade 3D T/L-organoidmodellen som ger en lovande plattform för att studera T/L-vävnadsbiologi och in vitro tenogena processer hos olika celltyper. Ytterligare implementering, optimering och forskning av denna modell uppmuntras starkt eftersom de kan leda till att utveckla ställningsfria T/L-teknikstrategier, vilket i sin tur kan bidra till att förbättra T/L-behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
D.D. och S.M.-D. erkänn BMBF-bidraget "CellWiTaL: Reproducible cell systems for drug research - transfer layer-free laser printing of highly specific single cells in three-dimensional cellular structures" Proposal Nr. 13N15874. D.D. och V.R.A. erkänner EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS "Holistisk utbildning av nästa generations artrosforskare" GA Nr. 101034412. Alla författare tackar Mrs. Beate Geyer för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H.
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
