Summary
Darin demonstrieren wir ein dreistufiges Organoidmodell (zweidimensionale [2D]-Expansion, 2D-Stimulation, dreidimensionale [3D]-Reifung), das ein vielversprechendes Werkzeug für die Sehnengrundlagenforschung und eine potenziell gerüstfreie Methode für das Tendon Tissue Engineering bietet.
Abstract
Sehnen und Bänder (T/L) sind starke, hierarchisch organisierte Strukturen, die den Bewegungsapparat vereinen. Diese Gewebe haben eine streng angeordnete Kollagen-Typ-I-reiche extrazelluläre Matrix (EZM) und Zellen der T/L-Linie, die hauptsächlich in parallelen Reihen angeordnet sind. Nach einer Verletzung benötigen T/L eine lange Zeit für die Rehabilitation mit hohem Ausfallrisiko und oft unbefriedigenden Reparaturergebnissen. Trotz der jüngsten Fortschritte in der T/L-Biologieforschung besteht eine der verbleibenden Herausforderungen darin, dass es im T/L-Bereich immer noch kein standardisiertes Differenzierungsprotokoll gibt, das in der Lage ist, den T/L-Bildungsprozess in vitro zu rekapitulieren. Zum Beispiel erfordert die Knochen- und Fettdifferenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen nur eine standardmäßige zweidimensionale (2D) Zellkultur und die Zugabe spezifischer Stimulationsmedien. Zur Differenzierung zum Knorpel ist eine dreidimensionale (3D) Pelletkultur und eine Supplementierung von TGFß notwendig. Für die Zelldifferenzierung zur Sehne ist jedoch ein sehr geordnetes 3D-Kulturmodell erforderlich, das idealerweise auch einer dynamischen mechanischen Stimulation unterzogen werden kann. Wir haben ein 3-stufiges Organoidmodell (Expansion, Stimulation und Reifung) etabliert, um eine 3D-stäbchenartige Struktur aus einem selbstorganisierten Zellblatt zu bilden, das eine natürliche Mikroumgebung mit eigenen EZM-, autokrinen und parakrinen Faktoren liefert. Diese stäbchenartigen Organoide haben eine mehrschichtige zelluläre Architektur innerhalb einer reichhaltigen EZM und können recht einfach gehandhabt werden, um statischer mechanischer Belastung ausgesetzt zu werden. Hier haben wir das 3-Stufen-Protokoll anhand von kommerziell erhältlichen dermalen Fibroblasten demonstriert. Wir konnten zeigen, dass dieser Zelltyp robuste und EZM-reiche Organoide bildet. Das beschriebene Verfahren kann hinsichtlich der Nährmedien weiter optimiert und in Richtung dynamischer axial-mechanischer Stimulation optimiert werden. Auf die gleiche Weise können alternative Zellquellen auf ihr Potenzial getestet werden, T/L-Organoide zu bilden und so eine T/L-Differenzierung zu durchlaufen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der etablierte 3D-T/L-Organoid-Ansatz als Modell für die Sehnengrundlagenforschung und sogar für das gerüstfreie T/L-Engineering verwendet werden kann.
Introduction
Sehnen und Bänder (T/L) sind wichtige Bestandteile des Bewegungsapparates, die dem Körper wesentliche Unterstützung und Stabilität bieten. Trotz ihrer entscheidenden Rolle ist dieses Bindegewebe anfällig für Degeneration und Verletzungen, was zu Schmerzen und Einschränkungen der Beweglichkeit führt1. Darüber hinaus können ihre eingeschränkte Blutversorgung und ihre langsame Heilungsfähigkeit zu chronischen Verletzungen führen, während Faktoren wie Alterung, wiederholte Bewegungen und unsachgemäße Rehabilitation das Risiko von Degeneration und Verletzungen weiter erhöhen2. Konventionelle Behandlungen wie Ruhe, Physiotherapie und chirurgische Eingriffe sind nicht in der Lage, die T/L-Struktur und -Funktion vollständig wiederherzustellen. In den letzten Jahren haben sich Forscher bemüht, die komplizierte Natur von T/L besser zu verstehen, um wirksame Behandlungen für T/L-Störungen zu finden 3,4,5. T/L zeichnen sich durch eine hierarchisch organisierte, extrazelluläre Matrix (ECM)-dominierte Struktur aus, die hauptsächlich aus Typ-I-Kollagenfasern und Proteoglykanen besteht, ein Merkmal, das in vitro nur schwer repliziert werden kann 6. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle erfassen nicht die charakteristische dreidimensionale (3D) Organisation von T/L-Geweben, was ihr translationales Potenzial einschränkt und den innovativen Fortschritt auf dem Gebiet der T/L-Regeneration behindert.
In jüngster Zeit bietet die Entwicklung von 3D-Organoidmodellen neue Möglichkeiten, die Grundlagenforschung und das gerüstfreie Tissue Engineering verschiedener Gewebetypen voranzutreiben 7,8,9,10,11,12,13. Um beispielsweise den myotendinösen Übergang zu untersuchen, entwickelten Larkin et al. 2006 3D-Skelettmuskelkonstrukte zusammen mit selbstorganisierten Sehnensegmenten, die von der Rattenschwanzsehneabgeleitet wurden 10. Darüber hinaus steuerten Schiele et al. 2013 durch die Verwendung von mikromaschinell bearbeiteten, mit Fibronektin beschichteten Wachstumskanälen die Selbstorganisation menschlicher dermaler Fibroblasten zur Bildung von Zellfasern ohne die Hilfe eines 3D-Gerüsts, ein Ansatz, der Schlüsselmerkmale der embryonalen Sehnenentwicklung erfassen kann11. In der Studie von Florida et al. 2016 wurden Knochenmark-Stromazellen zunächst in Knochen- und Bänderlinien expandiert, um dann selbstorganisierte Monolayer-Zellschichten zu erzeugen, die dann implementiert wurden, um ein mehrphasiges Knochen-Band-Knochen-Konstrukt zu schaffen, das das native vordere Kreuzband nachahmt, ein Modell, das auf ein verbessertes Verständnis der Bandregeneration abzielt12. Um die Mechanotransduktionsprozesse von Sehnen aufzuklären, verwendeten Mubyana et al. 2018 eine gerüstfreie Methodik, bei der einzelne Sehnenfasern erzeugt und einem mechanischen Belastungsprotokollunterzogen wurden 13. Organoide sind selbstorganisierte 3D-Strukturen, die die native Architektur, Mikroumgebung und Funktionalität von Geweben nachahmen. 3D-Organoidkulturen bieten ein physiologisch relevanteres Modell für die Untersuchung der Gewebe- und Organbiologie sowie der Pathophysiologie. Solche Modelle können auch verwendet werden, um die gewebespezifische Differenzierung verschiedener Stamm-/Vorläuferzelltypen zu induzieren 14,15. Daher wird die Implementierung von 3D-Organoidmodellen im Bereich der T/L-Biologie und des Tissue Engineering zu einem sehr attraktiven Ansatz 9,16. Alternative Zellquellen können für den Organoid-Assemblierung implementiert und zur tenogenen Differenzierung angeregt werden. Ein relevanter Zelltyp, der in dieser Studie zur Demonstration verwendet wurde, sind die dermalen Fibroblasten 7,17,18. Diese Zellen sind durch ein Hautbiopsieverfahren leicht zugänglich, das im Vergleich zur Knochenmarkpunktion oder Fettabsaugung weniger invasiv ist und aufgrund ihrer guten Proliferationsfähigkeit relativ schnell in großer Zahl vermehrt werden kann. Im Gegensatz dazu ist es schwieriger, spezialisiertere Zelltypen, wie z. B. T/L-residente Fibroblasten, zu isolieren und zu vermehren. Daher wurden dermale Fibroblasten auch als Ausgangspunkt für Zellreprogrammierungstechnologien hin zu induzierten pluripotenten embryonalen Stammzellen verwendet19. Wenn dermale Fibroblasten spezifischen 3D-Kulturbedingungen und Signalsignalen ausgesetzt werden, wie z. B. dem transformierenden Wachstumsfaktor-beta 3 (TGFß3), von dem berichtet wurde, dass er als Schlüsselregulator verschiedener zellulärer Prozesse, einschließlich der Bildung und Aufrechterhaltung von T/L, wirkt, kann dies ihre in vitro tenogene Differenzierung potenzieren, die zur Expression sehnenspezifischer Gene und zur Ablagerung von T/L-typischer EZMführt 20, 21. Urheberrecht
In dieser Arbeit beschreiben und demonstrieren wir ein bereits etabliertes und implementiertes 3-stufiges (2D-Expansion, 2D-Stimulation und 3D-Reifung) Organoid-Protokoll, das kommerziell erhältliche normale adulte humane dermale Fibroblasten (NHDFs) als Zellquelle verwendet und ein wertvolles Modell für die Untersuchung der In-vitro-Tenogenese darstellt7. Trotz der Tatsache, dass dieses Modell nicht äquivalent zu In-vivo-T /L-Gewebe ist, bietet es dennoch ein physiologisch relevanteres System, das zur Untersuchung zellulärer Differenzierungsmechanismen, zur Nachahmung der T/L-Pathophysiologie in vitro und zur Etablierung von T/L-personalisierten Medizin- und Wirkstoffscreening-Plattformen verwendet werden kann. Darüber hinaus können in zukünftigen Studien evaluiert werden, ob die 3D-Organoide durch weitere Optimierung für ein gerüstfreies T/L-Engineering geeignet sind und für die Entwicklung von mechanisch robusten Konstrukten nutzbar sind, die den Abmessungen und strukturellen und biophysikalischen Eigenschaften von nativen T/L-Geweben sehr ähnlich sind.
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Protocol
HINWEIS: Alle Schritte müssen mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.
1. Kultur und Vorausbau von NHDFs
- Tauen Sie das Kryofläschchen mit adulten kryokonservierten normalen dermalen Fibroblasten (NHDFs, 1 x 106 Zellen) schnell bei 37 °C auf, bis sie fast aufgetaut sind.
- Geben Sie langsam 1 ml vorgewärmtes Fibroblasten-Wachstumsmedium 2 (gebrauchsfertiges Kit mit Basalmedium, 2 % fötalem Kälberserum (FCS), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Insulin), ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptokokken) (NHDF-Medium), vorgewärmt bei 37 °C, zu den Zellen.
- Übertragen Sie die Zellen in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 12 mL vorgewärmtem NHDF-Medium.
- Die Zellen werden in einen T-75-Kolben umgefüllt und kurz über Kreuz geschüttelt. Stellen Sie den T-75-Kolben bei 37 °C in einen 5 % CO2 -befeuchteten Inkubator.
- Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. Beobachten Sie die NHDFs unter einem Mikroskop, bis sie eine Konfluenz von 70 % - 80 % erreichen.
2. 2D-Erweiterung
- Nehmen Sie den T-75-Kolben aus dem Inkubator und entfernen Sie das NHDF-Medium. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmter Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
- Geben Sie 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Zellen. Die Zellen werden bei 37 °C in einem mit 5 % CO2 befeuchteten Inkubator inkubiert, bis sich die Zellen aus dem Kolben lösen (ca. 3 Minuten).
- Fügen Sie 6 ml vorgewärmtes NHDF-Medium hinzu, um die Trypsinwirkung zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen.
- Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugiert und der Überstand entfernt.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) niedriger Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1x MEM-Aminosäuren, 1 % Pen/Streptokokken, vorgewärmt auf 37 °C.
- Die NHDFs werden in einer 10 cm großen adhärenten Zellkulturschale mit einer Dichte von 8 x 103 NHDFs/cm2 (insgesamt 4,4 x 105 NHDFs pro 10 cm Schale) plattiert. Schaukeln Sie sanft über Kreuz.
- Stellen Sie die 10 cm große Zellkulturschale bei 37 °C in einen 5 % CO2 -befeuchteten Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage
- Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bis zum Erreichen einer Konfluenz von 100% (ca. 5 Tage).
3. 2D-Stimulation
- Nehmen Sie die 10 cm großen Zellkulturschalen mit den NHDFs (aus den Schritten 2.6 und 2.7) aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem PBS.
- 10 ml DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 1 % Pen/Streptokokken, vorgewärmt auf 37 °C, hinzufügen.
- Stellen Sie die Petrischale bei 37 °C in eine mit 5 % CO2 befeuchtete Atmosphäre. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
- Überwachen Sie die NHDFs 14 Tage lang unter einem Mikroskop.
4. 3D Reifung
- Nehmen Sie die 10-cm-Zellkulturschale aus dem Inkubator und entfernen Sie das DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt.
- Lösen Sie das gebildete Zellblatt vorsichtig und schnell mit einem Zellschaber von der Schale. Während des Ablösens rollen Sie gleichzeitig das Zellblatt zu einem 3D-stäbchenartigen Organoid.
- Nehmen Sie die NHDF-Organoide auf und legen Sie sie in eine 10 cm große, nicht adhärente (für Zellen) Petrischale. Dieser Schalentyp wird verwendet, um eine Abwanderung von Zellen aus dem Organoid in den Kunststoff zu verhindern.
- Sammeln Sie zu diesem Zeitpunkt oder einen Tag danach (Tag 0 oder Tag 1 der 3D-Reifung) einige der Organoide für weitere Analysen wie Nassgewicht, histologische Bewertung (Organoide am Tag 1 sind vorzuziehen, da sie kompakter werden), RNA- und Proteinisolierung.
- Fixieren Sie die Ränder des Organoids mit Metallstiften wie folgt:
- Halten Sie eine Seite des Organoids vorsichtig mit einer Pinzette fest und wenden Sie mit einer anderen Pinzette vorsichtig eine manuelle Dehnung von ca. 10 % axialer Dehnung an. Um die axiale Dehnung von 10 % zu schätzen, verwenden Sie ein Millimeterpapier oder Lineal.
- Nehmen Sie als Nächstes eine Metallnadel mit der Pinzette auf und drücken Sie sie manuell durch den Organoidrand in die Plastikschale, um sie zu fixieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Stift an der zweiten Kante des Organoids.
- 10 ml DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, 1x MEM-Aminosäuren, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10 ng/ml TGFß3 und 1 % Pen/Streptokokken, auf 37 °C vorgewärmt, hinzufügen.
- Stellen Sie die 10-cm-Schüssel bei 37 °C in einer mit 5 % CO2 befeuchteten Atmosphäre auf. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
- Überwachen Sie die Organoide regelmäßig für 14 Tage.
HINWEIS: Stifte können sich lösen, daher mit der gleichen Technik wie in Schritt 4.5 beschrieben wieder fixieren. - Entfernen Sie nach 14 Tagen das DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt aus den Organoiden. Die Organoide mit vorgewärmtem PBS waschen.
- Messen Sie Organoide für das Nassgewicht an Tag 0 und Tag 14 mit einer Präzisionswaage.
- Stellen Sie eine leere 10-cm-Schale auf die Waage und tarieren Sie das Gewicht auf Null, um sicherzustellen, dass nur das Gewicht der Organoide gemessen wird. Nehmen Sie das Nährmedium vollständig aus der 10-cm-Schale und messen Sie das Organoid-Nassgewicht nacheinander.
HINWEIS: In dieser Studie wurden an Tag 0 drei Organoide pro Spender und an Tag 14 zwei Organoide pro Spender gewogen.
- Stellen Sie eine leere 10-cm-Schale auf die Waage und tarieren Sie das Gewicht auf Null, um sicherzustellen, dass nur das Gewicht der Organoide gemessen wird. Nehmen Sie das Nährmedium vollständig aus der 10-cm-Schale und messen Sie das Organoid-Nassgewicht nacheinander.
- Entsprechend den Studienzwecken wird ein Teil der NHDF-Organoide in weitere histologische Analysen implementiert oder mit sterilen DNA/RNA-freien Röhrchen für die anschließende DNA-, RNA- und Proteinisolierung sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei -80 °C gelagert.
- Für die histologische Untersuchung wird jedes Organoid 45 Minuten lang in 5 ml vorgekühltem (4 °C) 4 % Paraformaldehyd in PBS (auf neutralen pH-Wert eingestellt) auf Eis fixiert, gefolgt von PBS-Waschen bei RT (jeweils 2 x 5 Minuten).
- Kryoschützen Sie die fixierten Organoide mit einem Saccharosegradienten, indem Sie die Organoide für die Histologie in Gläser legen. Inkubieren Sie die Organoide in 10 % Saccharose in PBS-Lösung für 2 Stunden bei 4 °C, danach 20 % Saccharose/PBS für 2 Stunden bei 4 °C und schließlich 30 % Saccharose/PBS über Nacht bei 4 °C. Wechseln Sie die Saccharoselösungen, indem Sie sie zuerst auspipettieren und dann mit der neuen Lösung auffüllen.
- Betten Sie die Organoide in Kryomedium ein.
- Eine Kupferplatte auf das Trockeneis in einer Styroporbox legen und 10 Min. abkühlen lassen.
- Legen Sie anschließend eine mit Kryomedium vorgefüllte Kryoform aus Kunststoff auf die Kupferplatte und drücken Sie das Organoid mit einer Pinzette vorsichtig auf den Boden der Kryoform. Warten Sie, bis das Kryomedium vollständig gefroren ist.
- Bei langen Organoiden schneidest du zuerst mit einem Skalpell in zwei Hälften und legst die beiden Hälften parallel zueinander in die Kryoform. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Organoid, das einer histologischen Analyse unterzogen werden soll.
- Lagern Sie die Proben bei -20 °C bis zur Kryosektion.
- Schneiden Sie die Organoide mit einem Kryotom in 10 μm dicken Abschnitten in Längsrichtung und unterziehen Sie sie einer histologischen Färbung wie Hämatoxylin und Eosin (H&E) unter Verwendung des Standardprotokolls8.
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Representative Results
Das 3D-T/L-Organoidmodell wurde zuvor etabliert und hier durch die Implementierung von kommerziell erworbenem NHDF demonstriert (n=3, 3 Organoide pro Spender, NHDF wurden in den Passagen 5-8 verwendet). Der Modell-Workflow ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Abbildung 2 zeigt repräsentative Phasenkontrastbilder der NHDF-Kultur während der Vorexpansion in T-75-Kolben (Abbildung 2A) sowie zu Beginn und nach 5 Tagen Kultur im 2D-Expansionsschritt in 10-cm-Zellkulturschalen (Abbildung 2B). Abbildung 2C (repräsentative Phasenkontrastbilder) zeigt die Konfluenz von NHDFs während der 2D-Stimulation nach 14-tägiger Kultur in den 10-cm-Zellkulturschalen. Anschließend wurden die Zellfaltblätter manuell abgelöst und gleichzeitig zu 3D-stäbchenförmigen Organoiden gerollt (an Tag 0 beträgt die Organoidlänge ca. 6 cm, die Breite ca. 0,4 cm), die 14 Tage lang unter 10 % statischer Spannung kultiviert wurden (Abbildung 3, Tag 0 und Tag 14, repräsentative makroskopische Bilder). Am 14. Tag des 3D-Reifungsprozesses zeigten die Organoide ein glitzerndes weißes Aussehen, zogen sich zusammen und erschienen dichter als die ursprünglichen Organoide. Das Nassgewicht der Organoide wurde zum Zeitpunkt der Bildung (Tag 0) und erneut am Tag 14 des 3D-Reifungsschritts gemessen (Abbildung 4). Es wurde eine signifikante Verringerung des Nassgewichts beobachtet, was auf eine Kontraktion und strukturelle Reorganisation der EZM innerhalb der Organoide während der Zeitspanne dieses Protokollschritts hinweist. Neben der Gewichtsveränderung verringerte sich durch die Kontraktion auch die Organoidlänge (am 14. Tag beträgt die Organoidlänge ca. 3,5 cm und die Breite ca. 0,3 cm). Dabei lockerten sich die Metallstifte und mussten neu befestigt werden; Daher empfehlen wir, die Organoide während der 14-tägigen 3D-Reifung häufig zu überwachen. Um die Morphologie der Organoide zu bewerten, wurden Längsschnitte von NHDF-Organoiden erhalten, die an Tag 1 und Tag 14 des 3D-Reifungsschritts gesammelt und einer H&E-Färbung unterzogen wurden (Abbildung 5). An Tag 1 zeigten die Organoide unzusammenhängende Schichten, die hauptsächlich aus Zellen bestanden, die von geringen Mengen an EZM umgeben waren. Des Weiteren waren die Zellen innerhalb der Organoidschichten nicht entlang der Organoid-Längsachse ausgerichtet, die als Richtung für die aufgebrachte statische Zuglast diente. Die NHDF-Kerne wiesen eine runde Form mit unterschiedlichen Größen und Formen auf. Die H&E-Analyse von Organoiden am Tag 14 zeigte einen deutlichen Anstieg des Eosinsignals, was auf eine EZM-Ablagerung während des 3D-Reifungsprozesses hinweist. Zu diesem Zeitpunkt wiesen die Organoide verschmolzene Schichten auf, wobei sich Bereiche mit ausgerichteten Zellen befanden. Die Zellen waren häufig in Gruppen; An einigen Orten waren sie jedoch auch in Zellenreihen organisiert. Die Mehrzahl der Kerne war ähnlich groß und gelegentlich länglich.
Abbildung 1: Karikatur eines 3D-T/L-Organoidmodells, das aus 3 Schritten besteht: 2D-Expansion, 2D-Stimulation und 3D-Reifung. Zunächst wurden NHDFs in einem T-75-Kolben vorexpandiert, bis sie eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichten. Anschließend wurden NHDFs mit Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) niedrigem Glukosemedium in einer 10 cm Zellkulturschale für 5 Tage kultiviert (2D-Expansion). Die Zellen wurden dann 14 Tage lang mit DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt stimuliert, das mit Ascorbinsäure ergänzt wurde (2D-Stimulation). Anschließend wurden NHDF von der 10 cm adhärenten Schale gelöst, in ein 3D-stäbchenartiges Organoid gerollt, übertragen und in einer 10 cm großen, nicht adhärenten Zellkulturschale fixiert, die mit DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt gefüllt und mit Ascorbinsäure und Transforming Growth Factor beta 3 (TGFß3) für 14 Tage gefüllt war (3D-Reifung). Die gebildeten 3D-Organoide können zu verschiedenen Zeitpunkten wie den Tagen 0, 1 und 14 einer Bewertung des Nassgewichts, einer histologischen Bewertung, der RNA- und Proteinisolierung und anderen Analysen (z. B. Transmissionselektronenmikroskopie, biomechanische Messungen) unterzogen werden. Der Cartoon wurde in der BioRender-Software erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Phasenkontrastbilder von NHDFs während der Vorexpansion, der 2D-Expansion und der 2D-Stimulationsschritte. (A) NHDFs während der Vorexpansion im T-75-Kolben. (B) NHDFs an den Tagen 1 und 5 des 2D-Expansionsschritts in einer 10-cm-Zellkulturschale. (C) NHDFs an den Tagen 1 und 14 des 2D-Stimulationsschritts in einer 10-cm-Zellkulturschale. Maßstabsleisten: 200 μm. Die Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop aufgenommen, das mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Grobmorphologie von NHDF 3D-Organoiden. Repräsentative makroskopische Bilder von NHDF-Organoiden an den Tagen 0 und 14 des 3D-Reifungsschritts. Maßstabsleiste: 1 cm. Die Bilder wurden mit einer Handykamera aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Nassgewichtsanalyse von NHDF 3D-Organoiden. Die Nassgewichtsmessung der Organoide erfolgte an Tag 0 und Tag 14, dem Ende des 3D-Reifungsprozesses. Das Diagramm zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen (NHDF n = 3, 3 Organoide/Spender an Tag 0 und 2 Organoide/Spender an Tag 14 aufgrund von 1 Organoid/Spender, der an Tag 1 für die Histologie entnommen wurde), jeder Punkt repräsentiert einzelne Organoide, während jede farbige Form einen anderen individuellen Spender darstellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, und es wurde ein ungepaarter parametrischer t-Test verwendet. Statistische Unterschiede: **p ≤0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Histologische Analyse von NHDF 3D-Organoiden. Repräsentative Bilder von Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-gefärbten Schnitten von NHDF-Organoiden während des 3D-Reifungsprozesses an den Tagen 1 und 14. Rechtes Bild - Bilder mit geringer Vergrößerung, linkes Bild - vergrößerte Ansicht mit Indikatoren wie folgt: gelbe Pfeile - getrennte Ebenen; gelbe Pfeilspitzen - Kerne mit unterschiedlichen Größen und Formen; schwarze Pfeile - verschmolzene Schichten und ECM-Abscheidung; schwarze Pfeilspitzen - Zellreihen, Zellkerne mit ähnlicher Größe und Dehnung; schwarze Sterne - Zellen in Gruppen. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die in dieser Studie gezeigten Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in die Etablierung und Charakterisierung des NHDF 3D-Organoidmodells zur Untersuchung von T/L-Geweben. Das 3-Stufen-Protokoll führte zur Bildung von 3D-stäbchenförmigen Organoiden, die typische Merkmale der T/L-Nische aufweisen. Dieses Modell wurde bereits in Kroner-Weigl et al. 20237 berichtet und hier sehr detailliert demonstriert.
Die Phasenkontrastbilder in Abbildung 2 zeigen den Verlauf der NHDF-Konfluenz und der Blattbildung während der Expansions- und Stimulationsschritte. Der 3D-Reifungsprozess wurde durchgeführt, indem die Zellblätter manuell zu 3D-stäbchenartigen Organoiden gerollt wurden, die dann 14 Tage lang unter statischer Spannung kultiviert wurden. Die Organoide zeigten ein glitzerndes weißes Aussehen und eine erhöhte Dichte am 14. Tag, was auf eine Kontraktion und strukturelle Reorganisation innerhalb der Organoide hindeutet. Dies deutet darauf hin, dass die Reifungszeit entscheidend ist, um eine besser organisierte und T/L-Gewebe nachahmende Struktur zu erreichen.
Darüber hinaus zeigte die Gewichtsanalyse eine signifikante Abnahme des Nassgewichts der Organoide zwischen den Tagen 0 und 14, was wiederum auf eine signifikante Kontraktion und EZM-Reorganisation innerhalb der Organoide während des Reifungsprozesses hinweist. Wichtig ist, dass die Nassgewichtsmessungen zwischen den Experimenten aufgrund der Handhabung und des Restmediums im Organoid oder in den Schalen variieren können. Darüber hinaus könnte das Organoid zu Beginn mehr Medium enthalten, da, wie unten diskutiert, an Tag 0 die Schichten, die durch das Walzen der Zellfalte gebildet werden, getrennt und nicht verschmolzen sind. Mit der Zeit fügten sich die Schichten zusammen und wurden kompakter, so dass das Medium extrudiert werden konnte.
Die morphologische Bewertung durch H&E-Färbung lieferte zusätzliche Einblicke in die strukturellen Eigenschaften der Organoide. An Tag 1 wiesen die Organoide unzusammenhängende Schichten auf, die hauptsächlich aus Zellen mit runden Kernen bestanden, die von dünner perizellulärer EZM umgeben waren. Die fehlende Zellausrichtung parallel zur Achse der Zugbelastung deutet darauf hin, dass eine weitere Reifung erforderlich ist, um eine besser organisierte zelluläre und EZM-Architektur der Organoide zu erreichen. Trotz der Kontraktion und der Gewichts- und Dimensionsreduktion der Organoide zwischen Tag 1 und 14 zeigte die H&E-Färbung eine Zunahme der Eosin-positiven Bereiche, was auf eine verstärkte EZM-Ablagerung hindeutet. Außerdem waren keine Schichten mehr sichtbar, und gelegentlich hatten die Zellen längliche Zellkerne und waren in parallelen Zellreihen angeordnet. Dabei wurde darauf hingewiesen, dass die Zellen innerhalb der Organoide eine Selbstorganisation durchlaufen, indem sie ihre eigene Anordnung sowie die Ablagerung, Struktur und Ausrichtung der EZM verändern und so das Verhalten der nativen T/L-Gewebebildung nachahmen.
Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse das Potenzial des NHDF-Organoidmodells als wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der T/L-Biologie, der In-vitro-Tenogenese und sogar für die Weiterentwicklung des gerüstfreien T/L-Engineerings. Es gibt jedoch drei kritische Schritte für die erfolgreiche Handhabung des 3D-Organoidmodells: 1) Die Bildung eines dichten Zellblatts während der 2D-Stimulationsphase des Protokolls. Bei der Verwendung von Primärzellen hängt dies vor allem von den Eigenschaften der Spenderzelle ab; Daher ist es wichtig, mehrere Spender parallel zu bewerten; 2) Das manuelle Walzen des Zellblatts. Dazu muss das Zellblatt schnell, aber gleichzeitig schonend mit einem Zellschaber gewalzt werden. Daher ist es ratsam, erste Organoide zu planen, um dieses Verfahren zunächst zu trainieren; und 3) Die stabile Fixierung der Stifte an den Organoidkanten. Diese Fixierung sorgt für die Achsendehnung des Organoids und verhindert Deformitäten sowie das Zusammenfallen in eine klumpenartige Struktur. Darüber hinaus können sich die Stifte während der 3D-Reifungsphase plötzlich lösen, da die Organoide eine Umgestaltung der EZM erfahren, daher ist es wichtig, jedes Organoid regelmäßig zu überwachen und die Stifte wieder zu fixieren.
Das derzeitige Modell hat noch nicht das Niveau der In-vivo-Mimikry auf T/L-Gewebe erreicht und weist eine Reihe von Einschränkungen auf. Zum Beispiel erfordert es eine große Anzahl von Zellen pro Organoid sowie 35 Tage, bis das Verfahren abgeschlossen ist, während die meisten Differenzierungsprotokolle, wie z. B. das 3D-chondrogene Pelletmodell, auf 21 Tageeingestellt sind 22. Die Waschschritte im Protokollverfahren sollten vorzugsweise mit physiologisch ausgewogenem Waschpuffer, beispielsweise Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) oder Earles Balanced Salt Solution (EBSS), anstelle von PBS durchgeführt werden, was metabolische Folgen für primäre menschliche Zellen haben könnte, die in vitro kultiviert werden. In Bezug auf das Kulturmedium, das in den 2D-Stimulations- und 3D-Reifungsstadien des Organoids verwendet wird, wurde die Formulierung DMEM plus 10 % FBS gewählt, da dies die Grundlage für weithin akzeptierte Differenzierungsprotokolle ist und mit der Absicht, verschiedene Zelltypen hinsichtlich ihrer organoidogenen Eigenschaften zu standardisieren und zu vergleichen23. Die Reproduktion des 3-stufigen Organoid-Protokolls in verschiedenen Laborumgebungen kann durch den verwendeten Zelltyp, die Zellqualität und -passage sowie die spenderabhängigen Zelleigenschaften beeinflusst werden. Variationen in der Ausrüstung, insbesondere in der Qualität der 10-cm-Zellkulturschalen24 , die während der 2D-Stimulationsphase verwendet werden, könnten möglicherweise die Robustheit der Zellblattbildung beeinträchtigen. Darüber hinaus kann es aufgrund der EZ-Kontraktion während der 3D-Reifung zu einer Lockerung der axialen Fixierung der Organoide über Stifte kommen; Daher wird wie oben erwähnt eine häufige Überwachung empfohlen. Auch das Testen und Auswählen unterschiedlicher Stifte in Bezug auf Durchmesser und Festigkeit kann das Risiko eines Stiftablösensverringern 25. Die Verwendung von Stiften für das manuelle Dehnen ist jedoch nicht robust und anfällig für Variabilität. Daher ist es sehr wichtig, in der Folgeforschung einen Klemmmechanismus zum Halten der Organoidkanten zu entwickeln, der nicht nur zu einer Standardisierung dieses Schritts führen kann, sondern auch ein dynamisches Strecken der Organoide ermöglichen kann. Im Allgemeinen wird es von Interesse sein, zwei Möglichkeiten der Modifikation von Organoidmodellen zu untersuchen, eine Downscaling - um die Anzahl der Zellen pro Organoid und die Eingriffszeit zu reduzieren und damit die Benutzerfreundlichkeit zu erhöhen, insbesondere für In-vitro-Studien ; und das zweite Upscaling - um die Dimensionen der Organoide zu vergrößern, um ihr Verhalten in Großtiermodellen als potenzielle Sehnenersatzstrategie zu testen.
Das hier demonstrierte Modell kann eine Plattform bieten, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Sehnenentwicklung, der Pathophysiologie und möglicherweise der Reparatur und Regeneration zugrunde liegen, wenn die Organoide mit verschiedenen Zelltypen kombiniert und Mikrorupturen ausgesetzt werden. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Studie von Kroner-Weigl et al. 20237 mehrere Einschränkungen in Bezug auf den NHDF-Zelltyp identifizierte, nämlich dass die von NHDFs gebildeten Organoide größer und zellulärer sind als solche, die von T/L-Zellen abgeleitet werden, was es schwierig macht, die Zellproliferation und das Zellverhalten zu kontrollieren. In Bezug auf die Zellapoptose zeigte der auf terminaler Desoxynukleotidyltransferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) basierende Assay an Tag 147 keine Hinweise auf tote Zellen im gesamten Organoid, was auf eine angemessene Diffusion von Nährstoffen, Abfallstoffen und Sauerstoff während des 3D-Reifungsschritts hindeutet. Interessanterweise deutete trotz der morphologischen Unterschiede ein Pilot-Screening durch quantitative PCR einer Reihe von T/L-verwandten Genen (einschließlich verschiedener Kollagentypen, Skleraxis (SCX), Mohawk (MKX) usw.) auf eine vergleichbare Genexpression zwischen NHDF- und T/L-Organoidenhin 7, ein Befund, der weiter untersucht und auf Proteinebene validiert werden sollte. Daher sind für diesen Zelltyp weitere Optimierungen erforderlich, um die T/L-Differenzierung zu unterstützen, und können auf der Anpassung des in 2D-Stimulations- und 3D-Reifungsschritten verwendeten Mediums (z. B. Serumkonzentration, Wachstumsfaktoren, Vitamine), der Verlängerung der Reifungszeit oder sogar der dynamischen mechanischen Dehnung der Organoide basieren. Die Weiterentwicklung des Protokolls könnte die Zusammensetzung, die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Organoide weiter verbessern, wodurch das Modell in die Lage versetzt wird, die komplexe In-vivo-T /L-Gewebenische besser nachzuahmen. Darüber hinaus können alternative Zellquellen auf ihre Fähigkeit zur Bildung von T/L-Organoiden und ihre Fähigkeit zur T/L-Differenzierung untersucht werden. Yan et al. 2020 9 verwendeten das 3D-Organoidmodell, indem sie junge/gesunde und gealterte/degenerative Sehnenstamm-/Vorläuferzellen (Y-TSPCs und A-TSPCs) verwendeten, um das zelluläre Verhalten in 3D zu untersuchen und zu untersuchen, ob sich die Sehnenbildungskapazität mit der T/L-Alterung ändert. Sie berichteten, dass A-TSPC-3D-Organoide eine schlechte Gewebemorphologie aufweisen und die Zellen darin eine niedrigere Proliferationsrate, aber eine höhere Apoptose aufweisen, die mit einem erhöhten Gehalt an Seneszenzmarkern einhergeht9. Daher ist das T/L-3D-Organoidmodell eine vielversprechende Plattform für die Untersuchung molekularer und zellulärer Mechanismen, die an der Sehnenalterung beteiligt sind, und kann darüber hinaus zur Erprobung neuartiger pharmakologischer Therapien für die Sehnenreparatur und -regeneration verwendet werden. In einem anderen Ansatz implementierten Chu et al. 2021 Zahnfollikelzellen (DFCs) in das 3D-Organoidmodell, um ihre ligamentogene Differenzierung zu beurteilen. Dieser Zelltyp bildete sehr gut organisierte Organoide, was auf DFCs als attraktive Zellquelle zur Differenzierung im parodontalen Ligamentgewebe (PDL) hindeutet, was wiederum eine vielversprechende therapeutische Strategie für Parodontitis entwickeln könnte8.
In Zukunft könnte das Modell durch die Einbeziehung verschiedener Zelltypen (z.B. Myofibroblasten, Makrophagen) noch komplexer werden, was neue Einblicke in zellspezifische Verhaltensweisen und zelluläre Wechselwirkungen innerhalb von Organoiden bieten und zu einem umfassenderen Verständnis der T/L-Biologie, Physiologie und Pathophysiologie beitragenkönnte 8,9,16,26.
Die 3D-Organoidmodelle bieten mehrere Vorteile für Anwendungen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin. Sie ahmen die zelluläre Zusammensetzung und Organisation sowie die Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Matrix-Wechselwirkungen menschlicher Gewebe genau nach und bieten damit eine physiologisch relevante Plattform für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Arzneimittelreaktionen27. Organoide können als Hochdurchsatz-Screening-Plattform eingesetzt werden, um die Wirksamkeit, aber auch mögliche Nebenwirkungen verschiedener Medikamente zu beurteilen und eine zuverlässige und kostengünstige Alternative zu Tierversuchen zu bieten. Darüber hinaus ermöglichen sie direkte Vergleiche zwischen gesunden und kranken Zuständen und ermöglichen die Entdeckung wichtiger molekularer und zellulärer Veränderungen, die mit verschiedenen Pathologien verbunden sind, die Identifizierung von Biomarkern für die Früherkennung von Krankheiten sowie die Erleichterung eines besseren Verständnisses von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung zielgerichteter Therapien28,29.
Insgesamt haben wir die Schritte des zuvor etablierten 3D-T/L-Organoidmodells sehr detailliert demonstriert, das eine vielversprechende Plattform für die Untersuchung der T/L-Gewebebiologie und der in vitro tenogenen Prozesse verschiedener Zelltypen bietet. Die weitere Implementierung, Optimierung und Erforschung dieses Modells wird dringend empfohlen, da sie zur Weiterentwicklung gerüstfreier T/L-Engineering-Strategien führen können, die wiederum zur Verbesserung der T/L-Therapie beitragen können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Acknowledgments
D.D. und S.M.-D. Würdigung der BMBF-Förderung "CellWiTaL: Reproduzierbare Zellsysteme für die Wirkstoffforschung - Transferschichtfreier Laserdruck hochspezifischer Einzelzellen in dreidimensionalen zellulären Strukturen" Antrag Nr. 13N15874. D.D. und V.R.A. würdigen das EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS "Holistic training of next-generation Osteoarthritis researches" GA Nr. 101034412. Alle Autoren danken Frau Beate Geyer für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
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