Summary
여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.
Abstract
힘줄과 인대(T/L)는 근골격계를 하나로 묶는 강력하고 계층적으로 조직된 구조입니다. 이 조직에는 주로 평행한 줄에 위치한 콜라겐 유형 I-rich 세포외 기질(ECM)과 T/L-계통 세포가 엄격하게 배열되어 있습니다. 부상 후 T/L은 고장 위험이 높고 종종 만족스럽지 않은 수리 결과로 재활에 오랜 시간이 필요합니다. 최근 T/L 생물학 연구의 발전에도 불구하고 남아 있는 과제 중 하나는 T/L 분야에는 여전히 체외에서 T/L 형성 과정을 재현할 수 있는 표준화된 분화 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 예를 들어, 중간엽 전구체 세포의 뼈 및 지방 분화에는 표준 2차원(2D) 세포 배양과 특정 자극 매체의 추가만 필요합니다. 연골을 분화하기 위해서는 3차원(3D) 펠릿 배양 및 TGFß 보충이 필요합니다. 그러나 힘줄에 대한 세포 분화에는 매우 질서 정연한 3D 배양 모델이 필요하며, 이상적으로는 동적 기계적 자극도 받을 수 있어야 합니다. 3-step (Expansion, Stimulation, and Maturation) 오가노이드 모델을 구축하여 자체 조립된 세포장에서 3D 막대 형태의 구조를 형성하였으며, 이를 통해 자체 ECM, 자가분비, 측분비 인자를 가진 자연스러운 미세환경을 구현하였습니다. 이러한 막대 모양의 오가노이드는 풍부한 ECM 내에서 다층 세포 구조를 가지고 있으며 정전기적인 기계적 변형에 노출될 경우 매우 쉽게 처리할 수 있습니다. 여기에서는 시판되는 진피 섬유아세포를 사용하여 3단계 프로토콜을 시연했습니다. 우리는 이 세포 유형이 견고하고 ECM이 풍부한 오가노이드를 형성한다는 것을 보여줄 수 있습니다. 설명된 절차는 배양 배지 측면에서 더욱 최적화될 수 있고 동적 축방향 기계적 자극에 대해 최적화될 수 있습니다. 같은 방식으로, 대체 세포 소스가 T/L 오가노이드를 형성할 수 있는 잠재력을 테스트하여 T/L 분화를 거칠 수 있습니다. 요컨대, 확립된 3D T/L 오가노이드 접근 방식은 힘줄 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링의 모델로 사용할 수 있습니다.
Introduction
힘줄과 인대(T/L)는 신체에 필수적인 지지와 안정성을 제공하는 근골격계의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 결합 조직은 중요한 역할에도 불구하고 퇴화와 손상이 발생하기 쉬워 통증과 이동성 장애를 유발합니다1. 더욱이, 제한된 혈액 공급과 느린 치유 능력은 만성 부상으로 이어질 수 있으며, 노화, 반복적인 움직임 및 부적절한 재활과 같은 요인은 퇴행 및 부상의 위험을 더욱 증가시킨다2. 휴식, 물리치료, 외과적 치료와 같은 기존의 치료법으로는 T/L 구조와 기능을 완전히 회복할 수 없습니다. 지난 몇 년 동안 연구자들은 T/L 장애에 대한 효과적인 치료법을 찾기 위해 T/L의 복잡한 특성을 더 잘 이해하기 위해 노력해 왔습니다 3,4,5. T/L은 주로 I형 콜라겐 섬유와 프로테오글리칸으로 구성된 계층적으로 조직화된 세포외 기질(ECM) 지배 구조로 구별되며, 이러한 특징은 시험관 내에서 복제하기 어려운 특징입니다 6. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 모델은 T/L 조직의 특징적인 3차원(3D) 조직을 포착하지 못하여 번역 잠재력을 제한하고 T/L 재생 분야의 혁신적인 발전을 저해합니다.
최근 3D 오가노이드 모델의 개발은 다양한 조직 유형 7,8,9,10,11,12,13의 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 조직 공학을 발전시킬 수 있는 새로운 가능성을 제공했습니다. 예를 들어, 근건성 접합부를 조사하기 위해 Larkin et al. 2006은 쥐 꼬리 힘줄10에서 파생된 자체 조직화된 힘줄 분절과 함께 3D 골격근 구조를 개발했습니다. 또한, Schiele et al. 2013은 미세 가공된 피브로넥틴 코팅 성장 채널을 사용하여 배아 힘줄 발달의 주요 특성을 포착할 수 있는 접근 방식인 3D 스캐폴드의 도움 없이 인간 피부 섬유아세포의 자가 조립을 지시하여 세포 섬유를 형성하도록 지시했습니다11. Florida et al. 2016의 연구에 따르면, 골수 기질 세포는 먼저 뼈 및 인대 계통으로 확장되었고, 그 다음에는 자가 조립 단층 세포 시트를 생성하는 데 사용되었으며, 그런 다음 인대 재생에 대한 이해를 향상시키는 것을 목표로 하는 모델인 천연 전방 십자인대를 모방한 다상 뼈-인대-뼈 구조를 만들기 위해 구현되었습니다12. 힘줄 기계전달 과정을 설명하기 위해 Mubyana et al. 2018은 단일 힘줄 섬유를 생성하고 기계적 하중 프로토콜13을 적용하는 스캐폴드가 없는 방법론을 활용했습니다. 오가노이드는 조직의 기본 아키텍처, 미세환경 및 기능을 모방하는 자체 조직화된 3D 구조입니다. 3D 오가노이드 배양은 조직 및 장기 생물학과 병태생리학을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 모델을 제공합니다. 이러한 모델은 또한 상이한 줄기/전구 세포 유형의 조직 특이적 분화를 유도하는 데 사용될 수있다 14,15. 따라서 T/L 생물학 및 조직 공학 분야에서 3D 오가노이드 모델을 구현하는 것은 매우 매력적인 접근 방식이 됩니다 9,16. 대체 세포 소스는 오가노이드 어셈블리를 위해 구현될 수 있으며 tenogenic differentiation을 향해 자극될 수 있습니다. 이 연구에서 시연에 사용된 한 가지 관련 세포 유형은 피부 섬유아세포 7,17,18입니다. 이 세포는 피부 생검 절차를 통해 쉽게 접근할 수 있으며, 이는 골수 천자나 지방 흡입에 비해 덜 침습적이며 우수한 증식 능력으로 인해 상당히 빠르게 증식할 수 있습니다. 반면, T/L-상주 섬유아세포와 같은 보다 전문화된 세포 유형은 분리 및 확장이 더 까다롭습니다. 따라서, 피부 섬유아세포는 유도만능배아줄기세포(induced pluripotent embryonic stem cells)를 향한 세포 재프로그래밍 기술의 출발점으로도 사용되었다19. T/L의 형성 및 유지를 포함한 다양한 세포 과정의 핵심 조절자 역할을 하는 것으로 보고된 형질전환 성장 인자-베타 3(TGFß3)와 같은 특정 3D 배양 조건 및 신호 전달 신호에 피부 섬유아세포를 적용하면 힘줄 특이적 유전자의 발현 및 T/L-전형적인 ECM의 침착으로 이어지는 시험관 내 테노겐 분화를 강화할 수 있습니다.20, 21.
여기에서는 상업적으로 이용 가능한 정상적인 성인 인간 피부 섬유아세포(NHDF)를 세포 소스로 사용하여 이전에 확립 및 구현된 3단계(2D 확장, 2D 자극 및 3D 성숙) 오가노이드 프로토콜을 설명하고 시연하여 체외 건형성7을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다. 이 모델이 in vivo T/L 조직과 동일하지 않다는 사실에도 불구하고 세포 분화 메커니즘을 조사하고, in vitro에서 T/L 병태생리학을 모방하고, T/L 맞춤형 의료 및 약물 스크리닝 플랫폼을 구축하는 데 사용할 수 있는 생리학적으로 더 관련성 있는 시스템을 제공합니다. 또한, 향후 연구를 통해 3D 오가노이드가 추가 최적화를 통해 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링에 적합한지, 그리고 천연 T/L 조직의 치수와 구조적 및 생물물리학적 특성을 밀접하게 유사한 기계적으로 견고한 구조 개발에 활용할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.
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Protocol
알림: 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.
1. NHDF의 문화와 사전 확장
- 성인 냉동 보존된 정상적인 인간 피부 섬유아세포(NHDF, 1 x 106 세포)가 들어 있는 cryo-vial을 거의 해동될 때까지 37°C에서 빠르게 해동합니다.
- 37°C에서 예열된 1% 페니실린/스트렙토마이신(펜/연쇄상구균)(NHDF 배지)이 보충된 예열된 섬유아세포 성장 배지 2(기저 배지, 2% 태아 송아지 혈청(FCS), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 인슐린을 포함한 즉시 사용 가능한 키트) 1mL를 세포에 천천히 추가합니다.
- 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g 에서 셀을 원심분리합니다.
- 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 12mL의 예열된 NHDF 배지에 재현탁시킵니다.
- 세포를 T-75 플라스크에 옮기고 십자형으로 짧게 흔듭니다. T-75 플라스크를 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에 넣습니다.
- 2일마다 매체를 교체하십시오. NHDF가 70% - 80%의 밀도에 도달할 때까지 현미경으로 관찰합니다.
2. 2D 확장
- 인큐베이터의 T-75 플라스크를 꺼내고 NHDF 배지를 제거합니다. 미리 따뜻해진 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
- 0.05% 트립신-EDTA 3mL를 세포에 추가합니다. 세포가 플라스크에서 분리될 때까지(약 3분) 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
- 트립신 작용을 중화하기 위해 미리 따뜻해진 NHDF 배지 6mL를 추가합니다. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- RT에서 5분 동안 300 x g 에서 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
- 37°C에서 예열된 10% 소 태아 혈청(FBS), 1x MEM 아미노산, 1% 펜/연쇄상구균이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagles Medium) 저포도당에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 8 x 103 NHDFs/cm2 (총 10 cm 접시당 4.4 x 105 NHDFs)의 밀도로 10cm 부착 세포 배양 접시에 NHDF를 플레이트합니다. 십자형으로 부드럽게 흔듭니다.
- 37°C에서 10cm 세포 배양 접시를 5%CO2 가습 인큐베이터에 넣습니다. 2일마다 매체 교체
- 100% 밀도(약 5일)에 도달할 때까지 현미경으로 세포를 모니터링합니다.
3. 2D 자극
- 인큐베이터에서 NHDFs가 들어있는 10cm 세포 배양 접시를 꺼냅니다(단계 2.6 및 2.7에서). 배양 배지를 제거하고 미리 따뜻해진 PBS로 세포를 세척합니다.
- 37°C에서 예열된 10% FBS, 50μg/mL 아스코르브산 및 1% 펜/연쇄상구균이 보충된 DMEM 고포도당 배지 10mL를 추가합니다.
- 페트리 접시를 37% CO5 가습 분위기에서 2°C로 놓습니다. 2일마다 매체를 교체하십시오.
- 14일 동안 현미경으로 NHDF를 모니터링합니다.
4. 3D 성숙
- 인큐베이터에서 10cm 세포 배양 접시를 꺼내고 DMEM 고포도당 배지를 제거합니다.
- 셀 스크레이퍼로 형성된 셀 시트를 접시에서 부드럽고 빠르게 분리합니다. 분리하는 동시에 세포장을 3D 막대 모양의 오가노이드로 롤링합니다.
- NHDF 오가노이드를 집어 10cm 비부착(세포용) 페트리 접시에 넣습니다. 이 접시 유형은 오가노이드에서 플라스틱으로의 세포 유출을 방지하는 데 사용됩니다.
- 이 시점 또는 다음 날(3D 성숙 0일 또는 1일차)에 습식 중량, 조직학적 평가(1일차 오가노이드는 더 컴팩트해짐에 따라 바람직함), RNA 및 단백질 분리와 같은 추가 분석을 위해 일부 오가노이드를 수집합니다.
- 다음과 같이 금속 핀으로 오가노이드의 가장자리를 고정합니다.
- 핀셋으로 오가노이드의 한쪽을 조심스럽게 잡고 다른 핀셋으로 약 10%의 축 신장을 수동으로 부드럽게 늘립니다. 10% 축 신장을 추정하려면 밀리미터 용지 또는 자를 사용합니다.
- 그런 다음 핀셋으로 금속 핀 하나를 잡고 오가노이드 가장자리를 통해 플라스틱 접시에 수동으로 눌러 고정합니다. 오가노이드의 두 번째 가장자리에 두 번째 핀을 사용하여 이 절차를 반복합니다.
- 37°C에서 예열된 10% FBS, 1x MEM 아미노산 1개, 50μg/mL 아스코르브산, 10ng/mL TGFß3 및 1% 펜/연쇄상구균이 보충된 DMEM 고포도당 배지 10mL를 추가합니다.
- 10cm 접시를 37% CO 37의 가습 분위기에서 5°C로 놓습니다. 2일마다 매체를 교체하십시오.
- 14일 동안 정기적으로 오가노이드를 모니터링합니다.
알림: 핀이 느슨해질 수 있으므로 4.5단계에서 설명한 것과 동일한 기술을 사용하여 다시 수정하십시오. - 14일 후 오가노이드에서 DMEM 고포도당 배지를 제거합니다. 미리 예열된 PBS로 오가노이드를 세척합니다.
- 정밀 저울을 사용하여 0일째와 14일에 습윤 중량에 대한 오가노이드를 측정합니다.
- 저울에 빈 10cm 접시를 놓고 무게를 0으로 측정하여 오가노이드의 무게만 측정되도록 합니다. 10cm 접시에서 배양액을 완전히 제거하고 오가노이드 습윤 중량을 하나씩 측정합니다.
참고: 이 연구에서는 0일차에 공여체당 3개의 오가노이드, 14일차에 공여체당 2개의 오가노이드의 무게를 측정했습니다.
- 저울에 빈 10cm 접시를 놓고 무게를 0으로 측정하여 오가노이드의 무게만 측정되도록 합니다. 10cm 접시에서 배양액을 완전히 제거하고 오가노이드 습윤 중량을 하나씩 측정합니다.
- 연구 목적에 따라 추가 조직학적 분석에서 일부 NHDF 오가노이드를 구현하거나 후속 DNA, RNA 및 단백질 분리를 위해 멸균 DNA/RNA-free 튜브를 사용하여 액체 질소에 즉시 동결한 다음 -80°C에서 보관합니다.
- 조직학적 조사를 위해 각 오가노이드를 예냉(4°C) 4% 파라포름알데히드 5mL의 PBS(중성 pH로 조정)에 얼음에서 45분 동안 고정한 다음 RT(각각 2 x 5분)에서 PBS 세척합니다.
- 조직학을 위해 오가노이드를 유리병에 넣어 자당 그래디언트를 사용하여 고정 오가노이드를 냉동 보호합니다. 오가노이드를 PBS 용액의 10% 자당에 4°C에서 2시간 동안 배양한 후 4°C에서 2시간 동안 20% 자당/PBS를 배양한 후 마지막으로 4°C에서 30% 자당/PBS를 하룻밤 동안 배양합니다. 먼저 피펫팅을 한 다음 새 용액으로 채워 자당 용액을 교체하십시오.
- 오가노이드를 cryo-medium에 삽입합니다.
- 스티로폼 상자의 드라이아이스 위에 동판을 놓고 10분 동안 식힙니다.
- 다음으로, 극저온 매체로 미리 채워진 플라스틱 극저온 주형을 동판에 놓고 핀셋을 사용하여 오가노이드를 극저온 금형 바닥으로 부드럽게 누릅니다. 극저온질이 완전히 얼 때까지 기다리십시오.
- 긴 오가노이드의 경우 먼저 메스로 반으로 자르고 두 반쪽을 cryomold에 서로 평행하게 넣습니다. 조직학적 분석을 받으려는 각 오가노이드에 대해 절차를 반복합니다.
- 냉동 절제술 전까지 -20 °C에서 샘플을 보관합니다.
- 크라이오토톰을 사용하여 오가노이드를 10μm 두께의 절편으로 세로로 절단하고 표준 프로토콜8을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 같은 조직학적 염색을 실시합니다.
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Representative Results
3D T/L 오가노이드 모델은 이전에 상업적으로 구매한 NHDF(n=3, 공여체당 3개의 오가노이드, NHDF는 5-8절에서 사용됨)를 구현하여 확립되고 시연되었습니다. 모델 워크플로는 그림 1에 요약되어 있습니다. 그림 2 는 T-75 플라스크의 사전 팽창 중(그림 2A)과 10cm 세포 배양 접시의 2D 확장 단계에서 5일 동안의 배양 시작 및 후 NHDF 배양의 대표적인 위상차 이미지를 보여줍니다(그림 2B). 그림 2C (대표적인 위상차 이미지)는 10cm 세포 배양 접시에서 14일 배양 후 2D 자극 중 NHDF의 합류도를 보여줍니다. 그 후, 세포 시트를 수동으로 분리하고 동시에 3D 막대 모양의 오가노이드(0일째, 오가노이드 길이는 약 6cm, 너비는 약 0.4cm)로 말았으며, 14일 동안 10% 정적 장력 하에서 배양했습니다(그림 3, 0일차 및 14일차, 대표적인 거시적 이미지). 3D 성숙 과정의 14일째가 되자 오가노이드는 반짝이는 흰색 외관을 보였고 수축되어 초기 오가노이드보다 더 조밀하게 나타났습니다. 오가노이드의 습식 중량은 형성 시점(0일)과 3D 성숙 단계의 14일째에 다시 측정되었습니다(그림 4). 습식 중량의 현저한 감소가 관찰되었으며, 이는 이 프로토콜 단계의 시간 범위 동안 오가노이드 내에서 수축 및 ECM 구조적 재구성을 나타냅니다. 체중 변화 외에도 수축으로 인해 오가노이드 길이도 감소했습니다(14일째 오가노이드 길이는 약 3.5cm, 너비는 약 0.3cm). 이 과정에서 금속 핀이 헐거워져 다시 고정해야 했습니다. 따라서 3D 성숙 14일 동안에는 오가노이드를 자주 모니터링하는 것이 좋습니다. 오가노이드의 형태를 평가하기 위해 3D 성숙 단계의 1일차와 14일차에 수집된 NHDF 오가노이드에서 세로 절편을 얻고 H&E 염색을 수행했습니다(그림 5). 1일차에 오가노이드는 주로 적은 양의 ECM으로 둘러싸인 세포로 구성된 연결되지 않은 층을 나타냈습니다. 또한, 오가노이드 층 내의 셀은 적용된 정적 인장 하중의 방향으로 사용되는 종방향 오가노이드 축을 따라 정렬되지 않았습니다. NHDF 핵은 다양한 크기와 모양의 둥근 모양을 나타냈다. 14일차 오가노이드의 H&E 분석에서는 에오신 신호가 눈에 띄게 증가했으며, 이는 3D 성숙 과정에서 ECM 증착이 이루어졌음을 나타냅니다. 이 시점에서 오가노이드는 정렬된 세포를 포함하는 영역과 함께 융합된 층을 나타냈습니다. 세포는 종종 집단으로 나뉘었다. 그러나 일부 지역에서는 셀 행으로 조직되기도 했습니다. 대부분의 핵은 비슷한 크기를 가졌고 때때로 길쭉했습니다.
그림 1: 2D 확장, 2D 자극, 3D 성숙의 3단계로 구성된 3D T/L 오가노이드 모델의 만화. 처음에 NHDF는 70%-80% 합류점에 도달할 때까지 T-75 플라스크에서 사전 팽창되었습니다. 그 후, NHDF를 10cm 세포 배양 접시에 5일 동안 Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM) 저포도당 배지를 사용하여 배양했습니다(2D 확장). 그런 다음 세포를 14일 배양(2D 자극)을 위해 아스코르브산이 보충된 DMEM 고포도당 배지로 자극했습니다. 그 후, NHDF를 10cm 부착 접시에서 분리하여 3D 막대 모양의 오가노이드로 롤링한 후 옮기고 아스코르브산과 TGFß3(Transforming Growth Factor beta 3)가 보충된 DMEM 고포도당 배지로 채워진 10cm 비부착 세포 배양 접시에 14일(3D 성숙)동안 고정했습니다. 형성된 3D 오가노이드는 0일, 1일, 14일과 같은 다양한 시점에서 습식 중량 평가, 조직학적 평가, RNA 및 단백질 분리, 기타 분석(예: 투과 전자 현미경, 생체 역학 측정)을 수행할 수 있습니다. 이 만화는 BioRender 소프트웨어로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 사전 팽창, 2D 확장 및 2D 자극 단계 중 NHDF의 대표적인 위상차 이미지. (A) T-75 플라스크의 사전 팽창 중 NHDF. (B) 10cm 세포 배양 접시에서 2D 확장 단계의 1일 및 5일째의 NHDF. (C) 10cm 세포 배양 접시에서 2D 자극 단계의 1일차 및 14일차의 NHDF. 스케일 바: 200 μm. 이미지는 고해상도 카메라가 장착된 도립 현미경으로 촬영했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NHDF 3D 오가노이드의 총 형태. 3D 성숙 단계의 0일과 14일에서 NHDF 오가노이드의 대표적인 거시적 이미지. 눈금 막대: 1cm. 이미지는 휴대폰 카메라로 촬영했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NHDF 3D 오가노이드의 습식 중량 분석. 오가노이드의 습식 중량 측정은 3D 성숙 과정이 끝나는 0일째와 14일째에 이루어졌습니다. 그래프는 평균값과 표준 편차를 보여줍니다(NHDF n = 3, 0일에 3개의 오가노이드/공여체, 1일에 조직학을 위해 1개의 오가노이드/공여체를 채취하여 14일차에 2개의 오가노이드/공여체), 각 점은 개별 오가노이드를 나타내고 각 색상의 모양은 다른 개별 공여체를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되며 쌍을 이루지 않은 모수 t-검정이 사용되었습니다. 통계적 차이: **p ≤0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: NHDF 3D 오가노이드의 조직학적 분석. 1일과 14일째의 3D 성숙 과정에서 NHDF 오가노이드의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편의 대표 이미지. 오른쪽 이미지 - 저배율 이미지, 왼쪽 이미지 - 다음과 같은 표시기가 있는 확대보기: 노란색 화살표 - 연결이 끊어진 레이어; 노란색 화살촉 - 다양한 크기와 모양의 핵; 검은 색 화살표 - 융합 층 및 ECM 증착; 검은 화살촉 - 세포 열, 비슷한 크기와 신장을 가진 핵; 검은 별 - 그룹의 세포. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서 입증된 결과는 T/L 조직 연구를 위한 NHDF 3D 오가노이드 모델의 확립 및 특성화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 3단계 프로토콜은 T/L 틈새의 전형적인 특징을 나타내는 3D 막대 모양의 오가노이드를 형성했습니다. 이 모델은 이전에 Kroner-Weigl et al. 20237 에 보고되었으며 여기에서 매우 자세히 시연되었습니다.
그림 2에 제시된 위상차 이미지는 확장 및 자극 단계 동안 NHDF 합류 및 시트 형성의 진행을 보여주었습니다. 3D 성숙 과정은 세포 시트를 3D 막대 모양의 오가노이드로 수동으로 롤링하여 수행한 다음 14일 동안 정적 장력 하에서 배양했습니다. 오가노이드는 14일째까지 반짝이는 흰색 외관과 밀도 증가를 보였는데, 이는 오가노이드 내에서 수축 및 구조적 재구성이 있었음을 시사합니다. 이는 성숙 기간이 보다 조직화되고 T/L 조직을 모방하는 구조를 달성하는 데 중요하다는 것을 나타냅니다.
또한, 중량 분석 결과 0일에서 14일 사이에 오가노이드의 습식 중량이 크게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 성숙 과정에서 오가노이드 내에서 상당한 수축 및 ECM 재구성이 있음을 다시 한 번 나타냅니다. 중요한 것은 습식 중량 측정이 오가노이드 또는 접시 내의 취급 및 잔류 매체로 인해 실험마다 달라질 수 있다는 것입니다. 더욱이, 오가노이드는 초기에 더 많은 매체를 포함할 수 있는데, 이는 아래에서 논의된 바와 같이, 0일째에 세포판 압연에 의해 형성된 층이 분리되고 융합되지 않기 때문이다. 시간이 지남에 따라 층이 결합되어 더 조밀해졌으므로 매체가 압출될 수 있습니다.
H&E 염색에 의한 형태학적 평가는 오가노이드 구조적 특성에 대한 추가적인 통찰력을 제공했습니다. 1일째에 오가노이드는 주로 얇은 세포 주위 ECM으로 둘러싸인 둥근 핵을 가진 세포로 구성된 분리된 층을 나타냈습니다. 인장 하중의 축과 평행한 cell alignment의 부족은 오가노이드의 보다 조직화된 세포 및 ECM 아키텍처를 달성하기 위해 추가 성숙이 필요하다는 것을 시사합니다. 1일째와 14일 사이의 수축 및 오가노이드 중량 및 치수 감소에도 불구하고 H&E 염색은 에오신 양성 영역의 증가를 보였으며 이는 증강 ECM 침착을 시사합니다. 더욱이, 더 이상 눈에 띄는 층이 없었고, 때때로 세포는 길쭉한 핵을 가지고 있었고 평행한 세포 줄에 위치했습니다. 이는 오가노이드 내의 세포가 ECM 침착, 구조 및 정렬뿐만 아니라 자체 배열을 변경하여 자체 조직화를 거치므로 네이티브 T/L 조직 형성의 거동을 모방한다는 점을 지적했습니다.
전반적으로 이러한 발견은 T/L 생물학, 체외 건형성 연구, 심지어 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링의 추가 개발을 위한 귀중한 도구로서 NHDF 오가노이드 모델의 잠재력을 강조합니다. 그러나 3D 오가노이드 모델을 성공적으로 처리하기 위한 세 가지 중요한 단계가 있습니다: 1) 프로토콜의 2D 자극 단계에서 단단한 세포 시트의 형성. 일차 세포를 사용할 때, 이는 주로 공여 세포 특성에 따라 달라집니다. 따라서 여러 기증자를 동시에 평가하는 것이 중요합니다. 2) 셀 시트의 수동 롤링. 이를 위해서는 빠르게 롤링해야 하지만 동시에 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀 시트를 부드럽게 롤링해야 합니다. 따라서 이 절차를 먼저 훈련시키기 위해 초기 오가노이드를 계획하는 것이 좋습니다. 3) 오가노이드 가장자리에서 핀의 안정적인 고정. 이러한 고정은 오가노이드 축 신장을 보장하고 기형과 덩어리 같은 구조로 붕괴되는 것을 방지합니다. 또한, 3D 성숙 단계에서는 오가노이드가 ECM의 리모델링을 경험하기 때문에 핀이 갑자기 분리될 수 있으므로 각 오가노이드를 수시로 모니터링하고 핀을 다시 고정하는 것이 중요합니다.
현재 모델은 아직 T/L 조직에 대한 생체 내 모방 수준에 도달하지 못했으며 많은 한계를 내포하고 있습니다. 예를 들어, 오가노이드 당 많은 수의 세포가 필요하고 시술이 완료되는 데 35일이 소요되며, 3D 연골 펠릿 모델과 같은 대부분의 분화 프로토콜은 21일22일로 설정되어 있습니다. 프로토콜 절차의 세척 단계는 시험관내에서 배양된 일차 인간 세포에 대한 대사 결과를 초래할 수 있는 PBS보다는 생리학적으로 균형 잡힌 세척 완충액(예: Hanks Balanced Salt Solution(HBSS) 또는 Earles Balanced Salt Solution(EBSS))을 사용하여 수행하는 것이 바람직합니다. 오가노이드의 2D 자극 및 3D 성숙 단계에 사용되는 배양 배지와 관련하여, DMEM과 10% FBS 제형이 선택되었는데, 이는 널리 인정되는 분화 프로토콜의 기초일 뿐만 아니라 유기 형성 특성에 대해 서로 다른 세포 유형 간의 표준화 및 비교를 목적으로 하기 때문입니다23. 다양한 실험실 환경에서 3단계 오가노이드 프로토콜의 재현은 사용된 세포 유형, 세포 품질 및 통로, 공여체 의존성 세포 특성의 영향을 받을 수 있습니다. 장비에서의 변화, 특히 2D 자극 단계 동안에 사용되는 10 cm 세포 배양 접시(24 )의 품질에서의 변화는 세포 시트 형성의 강건성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있다. 또한 3D 성숙에 대한 ECM 수축으로 인해 핀을 통한 오가노이드의 축 방향 고정이 느슨해질 수 있습니다. 따라서 위에서 언급했듯이 자주 모니터링하는 것이 좋습니다. 직경과 강도 측면에서 다른 핀을 테스트하고 선택하는 것도 핀 분리의 위험을 줄일 수있습니다 25. 그러나 수동 스트레칭에 핀을 사용하는 것은 견고하지 않으며 가변성을 처리하는 경향이 있습니다. 따라서 후속 연구에서 오가노이드 가장자리를 고정하기 위한 클램핑 메커니즘을 개발하는 것이 매우 중요하며, 이는 이 단계의 표준화를 초래할 수 있을 뿐만 아니라 오가노이드의 동적 스트레칭을 허용할 수 있습니다. 일반적으로 오가노이드 모델을 수정하는 두 가지 방법, 즉 오가 노이드당 세포 수와 시술 시간을 줄여 특히 체외 연구에서 보다 사용자 친화적으로 만드는 다운스케일링을 조사하는 것이 흥미로울 것입니다. 그리고 두 번째 업스케일링 - 잠재적인 힘줄 교체 전략으로 대형 동물 모델에서 오가노이드의 거동을 테스트하기 위해 오가노이드의 크기를 늘리는 것입니다.
여기에서 시연된 모델은 힘줄 발달, 병태 생리학, 그리고 오가노이드가 다른 세포 유형과 결합되어 미세 파열을 겪는 경우 복구 및 재생의 기저를 조사하기 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. Kroner-Weigl et al. 20237 연구에서는 NHDF 세포 유형과 관련된 몇 가지 제한 사항, 즉 NHDF가 형성된 오가노이드가 T/L 세포에서 유래한 것보다 더 크고 더 세포적이어서 세포 증식 및 거동을 제어하기 어렵다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 세포 사멸과 관련하여, 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP nick end labeling(TUNEL) 기반 분석은 14 7일째에 오가노이드 전체에 걸쳐 죽은 세포의 증거를 보여주지않았으며, 이는 3D 성숙 단계에서 영양분, 폐기물 및 산소의 적절한 확산을 시사합니다. 흥미롭게도, 형태학적 차이에도 불구하고 여러 T/L 관련 유전자(다양한 콜라겐 유형, Scleraxis(SCX), Mohawk(MKX 등) 포함)에 대한 정량적 PCR에 의한 파일럿 스크리닝은 NHDF와 T/L 오가노이드 간의 유사한 유전자 발현을 시사했습니다7, 이는 단백질 수준에서 검증될 뿐만 아니라 추가 조사가 필요한 발견입니다. 따라서 이 세포 유형의 경우 T/L 분화를 지원하기 위해 추가 최적화가 필요하며, 이는 2D 자극 및 3D 성숙 단계(예: 혈청 농도, 성장 인자, 비타민)에 사용되는 배지를 조정하거나, 성숙 시간을 연장하거나, 오가노이드에 동적 기계적 스트레치를 적용하는 것을 기반으로 할 수 있습니다. 프로토콜을 발전시키면 오가노이드 구성, 구조 및 기능적 특성을 더욱 개선할 수 있으므로 모델이 복잡한 in vivo T/L 조직 틈새를 더 잘 모방할 수 있습니다. 또한, 대체 세포 공급원의 T/L 오가노이드 형성 능력과 T/L 분화 가능 여부를 조사할 수 있습니다. Yan et al. 20209, 3D 오가노이드 모델을 사용하여 젊은/건강한 및 노화/퇴행성 힘줄 줄기/전구 세포(Y-TSPC 및 A-TSPC)를 사용하여 3D에서 세포 거동과 T/L 노화에 따른 힘줄 형성 능력 변화 여부를 조사했습니다. 연구진은 A-TSPC 3D 오가노이드가 조직 형태가 불량하고, 내부 세포의 증식률은 낮지만 세포사멸이 높으며 노화 관련 마커 수치가 높다고 보고했다9. 따라서 T/L 3D 오가노이드 모델은 힘줄 노화와 관련된 분자 및 세포 메커니즘을 연구하기 위한 유망한 플랫폼이며 힘줄 복구 및 재생을 위한 새로운 약리학적 요법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 접근 방식으로, Chu et al. 2021은 리가멘토제닉 분화를 평가하기 위해 3D 오가노이드 모델에 치과 여포 세포(DFC)를 구현했습니다. 이 세포 유형은 매우 잘 조직화된 오가노이드를 형성하여 DFC를 치주 인대(PDL) 조직에서 분화하는 매력적인 세포 공급원으로 제안하며, 이는 차례로 치주염에 대한 유망한 치료 전략을 개발할 수 있습니다8.
미래에는 다양한 세포 유형(예: 근섬유아세포, 대식세포)을 포함하여 모델이 훨씬 더 복잡해질 수 있으며, 이는 오가노이드 내 세포 특이적 행동 및 세포 누화에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 T/L 생물학, 생리학 및 병태생리학에 대한 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있습니다 8,9,16,26.
3D 오가노이드 모델은 조직 공학 및 재생 의학 응용 분야에서 여러 가지 이점을 제공합니다. 그들은 세포 구성 및 조직뿐만 아니라 인간 조직의 세포 대 세포 및 세포 대 매트릭스 상호 작용을 밀접하게 모방하여 질병 메커니즘 및 약물 반응을 연구하기 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다27. 오가노이드는 다양한 약물의 효과뿐만 아니라 잠재적인 부작용을 평가하기 위한 고처리량 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있으며 동물 실험에 대한 신뢰할 수 있고 저렴한 대안을 제공할 수 있습니다. 또한, 건강한 상태와 질병에 걸린 상태를 직접 비교할 수 있으므로 다양한 병리학과 관련된 주요 분자 및 세포 변화를 발견하고, 조기 질병 발견을 위한 바이오마커를 식별하고, 질병 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고, 표적 치료제 개발을 촉진할 수 있습니다28,29.
종합하면, 우리는 다양한 세포 유형의 T/L 조직 생물학 및 체외 테노겐 과정을 연구하기 위한 유망한 플랫폼을 제공하는 이전에 확립된 3D T/L 오가노이드 모델의 단계를 매우 자세히 보여주었습니다. 이 모델의 추가 구현, 최적화 및 연구는 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링 전략을 발전시킬 수 있으며, 이는 차례로 T/L 요법 개선에 기여할 수 있으므로 강력히 권장됩니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
D.D. 및 S.M.-D. BMBF Grant "CellWiTaL: Reproducible cell systems for drug research - transfer layer-free laser printing of highly specific single cells in three-dimensional cellular structures" 제안 번호 13N15874를 인정합니다. D.D.와 V.R.A.는 EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS "Holistic training of next-generation Osteoarthritis researches", GA Nr. 101034412. 모든 저자는 기술 지원을 제공한 Mrs. Beate Geyer를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
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