Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת פגם בחלל הקופסה ברקמת דיאפיזה של עצם הירך של חולדה. מודל זה יכול להעריך ביצועים ביו-חומריים תחת לחץ ביומכני ולחקור מנגנונים של התחדשות עצם הקשורים לאוסטאוגנזה תוך-ממברנית.
Abstract
פגמים חמורים בעצמות או שברים מורכבים עלולים לגרום לסיבוכים חמורים כגון אי איחוד או ריפוי עצם לא מספיק. הנדסת רקמות, הכוללת יישום של תאים, פיגומים וציטוקינים, נחשבת לפתרון מבטיח להתחדשות עצם. כתוצאה מכך, מודלים שונים של בעלי חיים המדמים פגמים בעצמות ממלאים תפקיד מכריע בחקר הפוטנציאל הטיפולי של הנדסת רקמות לריפוי עצם. במחקר זה ביססנו מודל של פגם עצם קליפת המוח בצורת קופסה באמצע עצם הירך של חולדות, שיכול לשמש כמודל אידיאלי להערכת תפקידם של ביו-חומרים בקידום ריפוי עצם. פגם זה בצורת קופסה נקדח באמצעות ידית אוראלית במהירות נמוכה ועוצב על ידי מחט מחרטה. ניתוח מיקרו-CT לאחר הניתוח נערך מיד כדי לאשר את ההקמה המוצלחת של הפגם בעצם קליפת המוח בחלל הקופסה. עצם הירך בצד המנותח של החולדות נקטפה במספר נקודות זמן לאחר הניתוח (0 ימים, שבועיים, 4 שבועות ו-6 שבועות). תהליך הריפוי של אזור הפגמים של כל דגימה הוערך באמצעות צביעת מיקרו-CT, המטוקסילין ואוזין (H&E) וצביעת טריכרום מאסון. תוצאות אלה הדגימו דפוס ריפוי העולה בקנה אחד עם ossification intramembranous, עם ריפוי למעשה להשלים על ידי 6 שבועות. הסיווג של תהליך הריפוי של מודל בעלי חיים זה מספק שיטת in vivo יעילה לחקר ביו-חומרים ותרופות חדשניים המכוונים לאוסיפיקציה תוך-ממברנית במהלך ריפוי פגמים ברקמת העצם.
Introduction
עצם שבורה ופגומה נובעת לעיתים קרובות מטראומה, גידולים, דלקות ומומים מולדים 1,2. למרות שרקמת עצם אצל אנשים צעירים ובריאים היא בדרך כלל בעלת יכולות התחדשות חזקות3, פגמים העולים על גודל קריטי או מכשולי ריפוי עקב מחלות מערכתיות (למשל, סוכרת, אוסטאופורוזיס וזיהומים) עדיין עלולים להוביל לסיבוכים כגון חוסר רציפות עצם או ריפוי לקוי4. כדי להתמודד עם אתגר קליני זה, השתלת עצם או ביו-חומרים משמשים בדרך כלל להחלפת עצם פגומה חמורה או לשחזור מקטעי עצם גדולים. עם זאת, טיפולים אלה יש מגבלות. לדוגמה, למרות שנחשב לתקן הזהב, השתלת עצם אוטולוגית סובלת מאספקת תורמים מוגבלת וסיבוכים פוטנציאלייםבאתר התורם 5,6. Allografts גם להציג סיכונים מסוימים, כגון דחייה בתיווך החיסון, העברה פוטנציאלית של מחלות, והשפעות שליליות על התכונות הביומכניות והביולוגיות של השתל7.
בשנים האחרונות אנו עדים לעלייה במחקר המתמקד במנגנוני ריפוי פגמים בעצמות. השימוש בביו-חומרים חלופיים וההתקדמות בהנדסת רקמות התגלו כנושאים בולטים בתחום התחדשות העצם8. לפני שניתן יהיה ליישם ביו-חומרים אלה בטיפול בבני אדם, יש לבדוק אותם במבחנה ו-in vivo כדי להבטיח את יעילותם ובטיחותם. עם זאת, המורכבות המופחתת של סביבות חוץ גופיות והיעדר תגובות חיסוניות ודלקתיות מגבילות את ההערכה של ביו-חומרים שונים במבחנה. כתוצאה מכך, יש צורך בהקמת מודלים של בעלי חיים לסוגים שונים של פגמים ברקמת העצם9. מודלים של בעלי חיים מאפשרים הערכה של ביו-חומרים בתנאי העמסה שונים, מאפשרים הבנה של מאפייני עצם ספציפיים למין ומספקים תובנה לגבי הדמיון בין מודלים של בעלי חיים לבין מצבים קליניים אנושיים. יתרונות אלה חיוניים לחקר אינטראקציות בין פיגומים לעצם ולתרגום ממצאי המחקר לפרקטיקה קלינית 9,10.
נכון לעכשיו, מודלים של בעלי חיים עם פגמי עצם מכניים נמצאים בשימוש נרחב כדי לאמת את הביצועים של ביו-חומרים, כאשר מודלים של פגמים בעצם הגולגולת ומודלים של פגם עצם סגמנטלי הם השיטות הנפוצות ביותר המיושמות11. מודלים של פגם עצם סגמנטלי, המשמשים לעתים קרובות לחיקוי טראומה חמורה של עצם ארוכה או טיביאלית המסתיימת באי-איחוד עצם, הם בעלי יתרון בשל ממדיהם האחידים ומיקומם האנטומי המוגדר, המפשטים הערכות רדיולוגיות או היסטולוגיות של היווצרות עצם חדשה ורה-וסקולריזציה. עם זאת, מודלים אלה דורשים שתלי מתכת כדי לייצב מקטעי שבר דו צדדיים ומחייבים תהליך ריפוי מורכב הכולל הן אוסיפיקציה אנדוכונדרלית והן תוך ממברנית12. מצד שני, מודלים של פגמי עצם קלווריאלית הפכו לכלי סינון עיקרי להערכת ביו-חומרים בשל קוטר הפגם הסטנדרטי שלהם, הגישה הניתוחית הנוחה והתפקוד התומך של דורה מאטר ורקמות רכות13. למרות שהם נמצאים בשימוש נרחב למידול היווצרות עצם תוך ממברנית בתרחישים רלוונטיים מבחינה קלינית, הם אינם מתאימים להערכת ריפוי עצם בתנאי עומס ביומכני בשל אופיים שאינו נושא עומס במהלך תהליך הריפוי14.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה, הקמנו מודל של פגם עצם קליפת המוח בחלל הקופסה ברקמת דיאפיזה של עצם הירך של חולדות. תוך שימוש בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT), שחזור תלת-ממדי (תלת-ממדי) וצביעה היסטופתולוגית (Hematoxylin ו-eosin [HE] ו-Masson), ניתחנו את תהליך הריפוי של מודל זה בתנאי המוסטזיס. אנו שואפים להציע תובנות חדשות להערכת ביצועי חומרים ביולוגיים בתנאי עומס ביומכני וללימוד הביו-הנדסה והמנגנון של התחדשות עצם מול אוסיפיקציה תוך-ממברנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה במערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2021-597). חולדות Sprague-Dawley (זכר, משקל גוף 300 גרם) שימשו במחקר הנוכחי.
1. הכנה טרום ניתוחית
- הכנת מכשירים
- עיינו באיור 1A עבור כלי הניתוח ששימשו במחקר זה: מכונת גילוח חשמלית, מספריים רקמות, מספריים עיניים, מלקחיים עיניים, אזמל חד פעמי, מפריד פריאוסטאלי, ידית אוראלית במהירות נמוכה, בדיקה אוראלית, vac השקיה חד פעמי, מחזיק מחט, תפר 3.0.
- הכינו בדיקה בעל פה וסמנו את הקצה הגדול והמעוקל של הגשושית בעט טוש בהתאם לקוטר הפגם (איור 1B). השתמש באפשרות זו כדי לקבוע את גודל הפגם במהלך הניתוח.
- יש לעקר את כל חומרי הניתוח והמכשירים המשמשים לביצוע ההליך לפני השימוש. ארזו את החומרים הרצויים בבד מקופל או בנייר עטיפה ואטמו אותם בסרט אוטומטי לעיקור בקיטור (125-135 מעלות צלזיוס למשך 20-25 דקות).
- הכנת אזור הניתוח: יש לחטא את שולחן הניתוחים והסביבה סביב השולחן על ידי ריסוס באלכוהול 75%. צרו אזור סטרילי בגודל של כ-60X90 ס"מ עם וילונות אוטוקלאביים על שולחן הניתוחים.
- הכנה להרדמה
- מרדימים את החולדות תוך צפקית עם 10% קטמין הידרוכלוריד (50-100 מ"ג/ק"ג) ו-2% קסילזין 2 מ"ג/ק"ג). השתמש בהזרקה תת עורית של קרפרופן (5 מ"ג / ק"ג) לשיכוך כאבים לפני הניתוח ותוך ניתוחי. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת צביטת בוהן. לאחר ההרדמה, יש למרוח משחת עיניים סטרילית על העיניים כדי למנוע יובש בעיניים ופגיעה בקרנית.
2. הליך כירורגי
- הניחו את החולדה בתנוחת שכיבה רוחבית על שולחן הניתוחים הסטרילי והסירו את שערות הגפיים התחתונות בעזרת מכונת גילוח חשמלית.
- השתמש בתמיסת יודופור 5% ואלכוהול 75% לחיטוי רקמת העור באזור הניתוח.
- אתר את עצם הירך הפרוקסימלית והדיסטלית ובצע חתך של 2.5 ס"מ לאורך הציר הארוך של עצם הירך כדי לחתוך דרך רקמת העור של החולדה.
- יש להפריד את שכבת העור מהפאשיה בעזרת מלקחיים עיניים ומספריים רקמתיים, ולחשוף את הגישה הצידית לעצם הירך דרך שרירי הירך הדו-ראשיים ושרירי הירך הצדיים.
- יש לאתר את ההצטלבות של שתי מחיצות השרירים (קו רקמה לבן) ולהפריד בזהירות בעזרת להב כירורגי חד פעמי לאורך גבול השריר עד להגעה למשטח הירך.
הערה: בעת שימוש בלהב חד פעמי להפרדת השריר, חשוב להפריד לאורך מחיצת השריר ולהיזהר מגרימת פגיעה בכלי הדם בתוך הרקמה הרכה. מתחילים ואלה שאינם מכירים את האנטומיה חייבים להשתמש במלקחיים אופתלמיים ומפרידים פריאוסטיאליים בדיסקציה קהה בין שני נפחי השרירים.
- החל מפריד periosteal כדי להפריד בבוטות את שרירי פני הירך ולחשוף את אמצע diaphysis הירך.
- השתמש בעט סמן סטרילי כדי לסמן את האזור של אתר הפגם על פני השטח האמצעיים של דיאפיזה הירך, הממוקם בחלק העליון של 1/3 הפסגה האלכסונית הצידית של ראש הירך.
- השתמש בידית האוראלית במהירות נמוכה עם מקדח כדור בהילוך איטי בקוטר 1.2 מ"מ כדי לקדוח חור קטן בניצב לפני השטח של העצם באתר המסומן, להרוס את periosteum ואת קליפת העצם עם עומק עמוק מספיק כדי להגיע לחלל מח העצם. ברמת עומק קידוח זו, הרחיבו את גודל החור במקביל לעומק זה לכל הכיוונים, וגזמו כדי להשיג צורת חלל תיבה.
- השתמש בבדיקה אוראלית מסומנת במקביל לקצה הפגם כדי לקבוע את קוטר הפגם ואת המורפולוגיה במהלך ולאחר ההכנה.
- סגרו את שכבות השרירים והעור עם 3-0 תפרים נספגים מונופילמנט, בהתאמה, וחיטאו את אזור הניתוח עם 5% יודופור מבפנים החוצה.
3. טיפול לאחר הניתוח
- לאחר הניתוח, יש לתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית ולשים את החולדה על כרית חימום בטמפרטורה קבועה עד להחלמה מההרדמה. כאשר החולדה חוזרת להכרה, העבירו אותה בעדינות לכלוב המכיל מצעים יבשים ואוטוקלאביים.
- המשך שיכוך כאבים במשך 24 שעות ומעקב לאחר הניתוח במשך שבוע לאחר הניתוח.
4. איסוף וניתוח דגימות
- המתת חסד אנושית של החולדה לאחר ניתוח על ידי הזרקת נתרן pentobarbital 100-200 מ"ג / ק"ג intraperitoneally. יש להפריד בזהירות את השריר והרקמה הפאשיאלית על פני עצם הירך ולהסיר את עצם הירך בצד המנותח לחלוטין. אספו דגימות לאחר 0 ימים (איור 2A, B), שבועיים, 4 שבועות ו-6 שבועות לאחר הניתוח.
- תקן את דגימות עצם הירך ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות. לנתח את המבנה של עצם הירך באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. הגדר את פרמטרי הסריקה כדלקמן: פוטנציאל צינור רנטגן, 70 kVp; מסנן, AL 0.5 מ"מ; עוצמת רנטגן, 0.2 mA; גודל ווקסל, 17 מיקרומטר; וזמן אינטגרציה, 1 × 300 אלפיות השנייה. בנה מחדש תמונות מודל תלת-ממדי באמצעות נתוני מפת סיביות.
- יש לסלק את הדגימות ב-10% EDTA למשך 8 שבועות לפני ייבוש דגימות עצם הירך בסדרה מדורגת של דילולי אתנול. לאחר מכן, הטמיעו את הדגימות בשעוות פרפין15.
- חותכים את הדגימות המשובצות לקטעי פרפין בגודל 5 מיקרומטר ממישור הסגיטל.
- מקטעי צביעה עם ערכת צביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) וערכת צביעה של מאסון. שימו לב לריפוי אזור הפגם על ידי היסטופתולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, אנו מבססים בהצלחה מודל פגם בחלל הירך של חולדה במידות של 4.5 מ"מ x 1.5 מ"מ על ידי קידוח. על מנת לנתח את תהליך הריפוי, אספנו את רקמת הירך בצד המנותח ב-0 ימים, שבועיים, 4 שבועות ו-6 שבועות לאחר הניתוח, שהן נקודות הזמן העיקריות של אוסיפיקציה אנדוכונדרלית, אוסיפיקציה תוך-ממברנית ועיצוב מחדש של העצם במהלך תהליך הריפוי של טראומה פמורלית בחולדות2. ביום 0 שלאחר הניתוח, שחזור של המודל התלת-ממדי מנתוני מפת סיביות של מיקרו-CT הראה שמידלנו בהצלחה פגם בחלל הקופסה בעצם הירך בגודל של 4.5 מ"מ x 1.5 מ"מ עומק לחלל מח המוח (איור 3A). תוצאות של מיקרו-CT הראו היווצרות עצם טרבקולרית מינרלית בחלל הבין-תאי של הפגם בעצם קליפת המוח שבועיים לאחר יצירת המודל (איור 3B). פני השטח של רקמת העצם החדשה באזור הפגמים הראו עצם קורטיקלית בוגרת וצפופה, ורקמת עצם טרבקולרית עדיין נראתה בצד המדולרי 4 שבועות לאחר הניתוח (איור 3C). לאחר 6 שבועות, אזור הפגמים היה מורכב כמעט מעצם קליפת המוח בוגרת וצפופה, כאשר רק כמות קטנה של רקמת עצם טרבקולרית נותרה ליד הצד המדולרי, מה שמצביע על כך שאזור הפגם נרפא באופן בסיסי (איור 3D).
אנו גם מנתחים את הדגימות שנאספו על-ידי צביעת H&E וצביעה של Masson trichrome (איור 4). התוצאות הראו שרקמת עצם נאיבית דמוית טרבקולר נוצרה באזור הפגם שבועיים לאחר הניתוח, והפריאוסטאום סביב אזור הפגם התעבה והתחבר לרקמת העצם הטרבקולרית של היילוד באזור הפגמים (איור 4A,A',B,B'). ב 4 שבועות לאחר יצירת הפגם, רקמת עצם קליפת המוח צפופה נוצרה על פני השטח של אזור הפגם ומחוברת עם עצם קליפת המוח משני צידי הפגם; רקמת עצם דמוית טרבקולרית נספגה מחדש בכבדות בצד המדולרי (איור 4C,C',D,D'). רקמת עצם קליפת המוח הבוגרת נוצרה באזור הפגם, ורקמת העצם הטרבקולרית בצד המדולרי נספגה כמעט לחלוטין 6 שבועות לאחר הניתוח (איור 4E,E',F,F'), מה שמצביע על כך שתהליך הריפוי של הפגם כמעט הושלם.
איור 1: מכשירים הדרושים ליצירת פגמים. (א) כלי ניתוח. (1) מכונת גילוח חשמלית; (2) מלקחיים עיניים; (3) מספריים עיניים; (4) אזמל חד-פעמי; (5) מפריד פריוסטל; (6) ידית אוראלית במהירות נמוכה; (7) בדיקה בעל פה מתוקנת; (8) שקיה חד-פעמית; (9) מחזיק מחט; (10) מספריים לרקמות; (11) תפר 3.0. (B) בדיקות אוראליות המסומנות במידות קוטר הפגם. הקצה המעוגל הגדול של הבדיקה האוראלית החד פעמית הסטרילית סומן בקנה מידה של 1.5 מ"מ ו -4.5 מ"מ למדידה תוך ניתוחית של קוטר אזור הפגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מורפולוגיה של הפגם בחלל התיבה (יום 0). (A,B) מדידת דגימות יום 0 לאחר הניתוח באמצעות בדיקה אוראלית שונה ששימשה ליצירת הפגם בחלל הקופסה (4.5 מ"מ x 1.2 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח מיקרו-CT של תהליך הריפוי של אזור הפגם. תמונות משוחזרות תלת-ממדיות של אזור הפגמים ב-0 ימים, 14 ימים, 28 ימים ו-42 ימים לאחר הניתוח. (A) מישור אורכי . (ב-ד) צילומי מיקרו-CT אורכיים (פאנל שמאלי), סגיטלי (אמצעי) וחתך רוחב (פאנל ימני) של ריפוי אזור הפגם לאחר 14 ימים, 28 ימים ו-42 ימים. התיבה המקווקו הצהובה ב- A, B, C ו- D מייצגת את אזור הפגם. הקו המקווקו הצהוב מייצג את קצוות הפגם, והחץ הצהוב מייצג את רקמת העצם החדשה באזור הפגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. תוצאות היסטופתולוגיות. (א-ו) H&E ו Masson צביעה של אזור הפגם ב 14 ימים, 28 ימים, ו 42 ימים. (א'-ו') התמונות המוגדלות של התיבות המלבניות השחורות המוצגות ב- A-F. רקמת עצם מינרלית דמוית טרבקולר נוצרה באזור הפגם ב -14 יום לאחר הניתוח; רקמת עצם קליפת המוח נוצרה על פני השטח של אזור הפגם ומחוברת לשני הקצוות של אזור הפגם ב -28 ימים לאחר הניתוח; רקמת עצם קליפת המוח הבוגרת נוצרה באזור הפגם ב -42 יום לאחר הניתוח, והריפוי הושלם למעשה. הקו הכחול המקווקו מציין את קצה הפגם; האזור המוקף בקו המקווקו האדום הוא רקמת העצם החדשה באזור הפגם; החץ השחור הוא periosteum מעובה; המשולש הצהוב הוא עצם קליפת המוח הישנה; החץ הירוק הוא רקמת העצם החדשה דמוית הטרבקולרית; הכוכבים השחורים והצהובים הם רקמת העצם החדשה בקליפת המוח; והחץ האדום הוא הפריאוסטאום החדש. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר (A-F), 200 מיקרומטר (A'-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים חיוניים לבחינת ריפוי עצם והשפעת ביו-חומרים על התחדשות העצם. פרוטוקול זה מדגים מודל פגם בחלל הירך המשכפל את תהליך היווצרות העצם התוך ממברנית הקשור להתחדשות עצם קלינית. אזור הפגם עבר סטנדרטיזציה תוך ניתוחית באמצעות בדיקה אוראלית מסומנת מראש. תוצאות מיקרו-CT וצביעה היסטופתולוגית הראו ריפוי הדרגתי במשך 6 שבועות, עם פריאוסטאום מעובה והיווצרות עצם טרבקולרית חדשה, ואחריה היווצרות עצם קליפת המוח צפופה. לא נצפתה רקמת סחוס במהלך תהליך הריפוי, דבר המצביע על אוסטאוגנזה תוך ממברנית. ממצא זה מציג פרספקטיבות חדשות לחקר תפקידם של ביו-חומרים או תרופות בהתחדשות עצם קלינית.
פרוטוקול זה דורש תשומת לב קפדנית למספר גורמים: (i) הרדמה עמוקה היא תנאי מוקדם למניעת מצוקה של בעלי חיים ולהבטחת מיקום פגמים מדויק. יש לעקוב בדריכות אחר עומק ההרדמה וסימנים חיוניים. (ii) במהלך היפרדות שרירים יש להקפיד על מניעת פגיעה בכלי הדם, העלולה לעכב את ההחלמה. (iii) בהכנת חור הפגם, יש לשמור על נקודת המשען הימנית יציבה ותמיד בניצב לפני השטח של העצם כדי לוודא שפגם הקופסה נמצא באותו עומק. עומק המקדחה צריך להיות נשלט כדי להסיר רקמת עצם קליפת המוח מבלי להיכנס עמוק מדי. זה מונע עיכוב ריפוי העצם עקב הרס מכני מוגזם של מח העצם, וכתוצאה מכך הסרת תאי גזע מזנכימליים (MSC) ושיבוש התגובה הדלקתית16. (iv) הכנת החלל מחייבת עוזר להשקות ברציפות את האזור במי מלח כדי להפחית נזק פוטנציאלי לרקמות הנגרם מחום במהלך אבלציה של העצם, תוך שמירה על נראות שדה הניתוח.
מודלים של שבר עצם, פגם עצם סגמנטלי ופגם בעצם גולגולתית הם המודלים הנפוצים של בעלי חיים בחקירת התחדשות עצם. מודל שבר העצם משקף את תהליך הטראומה בפועל, אך התוצאות עשויות להשתנות עקב הבדלים בחתכי השבר בקרב חיות ניסוי17. מודל פגם העצם המקטעים מדמה ביעילות סיבוכי שבר כגון אי-איחוד או ריפוי מאוחר. בשל המיקום האנטומי שלה, מודל זה מאפשר הערכה של היווצרות עצם חדשה revascularization באמצעות שיטות רדיוגרפיות או היסטולוגיות18. עם זאת, שיטה זו מציגה שונות ניכרת בגודל הפגם בין הנבדקים; הדרישה לקיבוע סד או קיבוע פנימי עם שתלי מתכת מגבילה גם את יישומו11. מודל הפגם הקלוואריאלי מאופיין ללא קיבוע פנימי, יכולת שחזור גבוהה בגודל ובמיקום אנטומי, וסביבה מכנית יציבה14, המגבילה גם את היישום בהערכת התגובה הביולוגית להעמסה פיזיולוגית, ביומכנית של חומר מושתל13. יתר על כן, בהיעדר עצם שתל, פלישת הפגם על ידי הדורה מאטר והרקמה הרכה שמעליה עלולה לעכב את התחדשות העצם, מה שהופך מודלים אלה לרגישים לביצועי חומר הפיגום18. לכן, פרוטוקול זה מציע קביעת פגם בחלל התיבה בדיאפיזה של עצם הירך של החולדה, המאפשר מדידה תוך ניתוחית של קוטר הפגם באמצעות כלי פשוט18. גישה זו מציעה שליטה טובה יותר על סטנדרטיזציה של פגמים מאשר מודלים של שבר או פגם סגמנטאלי ומבטלת את הצורך בקיבוע פנימי או חיצוני. יתר על כן, מודל זה עמיד מפני פגיעה בהיווצרות עצם עקב שחיקת רקמות רכות. עם זאת, פרוטוקול זה מציג מגבלות מסוימות: (i) ביצוע לא תקין או קוטר פגם מוגזם יכולים להוביל לדימום חמור, הלם או אפילו מוות בחולדות. לכן, כדי להבטיח את שלומם ורווחתם של בעלי החיים, חובה לתרגל גופות חולדות לפני ביצוע ההליך על נושאים חיים. (ii) יתר על כן, היעדר המערכת ההברסיאנית בקליפת המוח של מכרסם19 מקשה על שחזור מלא של תהליך הריפוי הקליני הטבעי של שבר/פגם בעצמות האדם. חולדות, כמו מכרסמים, הן חסכוניות, דורשות תחזוקה מינימלית, והן בטוחות וקלות לטיפול, ומספקות יכולת רבייה גבוהה יותר מאשר בעלי חיים גדולים יותר כמו ארנבות, כלבים ועזים20.
לסיכום, פיתחנו מודל פגם בחלל הירך של חולדה ועקבנו אחר תהליך הריפוי תוך שימוש בטכניקות מיקרו-CT וצביעה היסטופתולוגית. פרוטוקול זה מספק שיטה מקיפה וניתנת להכללה לבחינת היווצרות עצם תוך ממברנית במודלים משמעותיים מבחינה קלינית של התחדשות עצם. יתר על כן, הוא מציע פרספקטיבות חדשניות להערכת ביצועים ביולוגיים של ביו-חומרים חלופיים, תרופות הקשורות להתחדשות עצם, פיגומים וכו '. זה גם מקל על אימות פרה-קליני של אסטרטגיות טיפוליות מתפתחות להנדסת רקמת עצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל הנתונים והתמונות המקוריים כלולים במאמר זה. המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) ו- 82100982 (F. L.), ונתמך על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן 2023NSFSC1499 (H. W).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193 (2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66 (2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084 (2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977 (2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
