Summary
Aquí, presentamos un protocolo para crear un defecto de cavidad de caja en el tejido de diáfisis femoral de rata. Este modelo puede evaluar el rendimiento de los biomateriales bajo estrés biomecánico y explorar los mecanismos de regeneración ósea relacionados con la osteogénesis intramembranosa.
Abstract
Los defectos óseos graves o las fracturas complejas pueden dar lugar a complicaciones graves, como la falta de consolidación o la cicatrización insuficiente del hueso. La ingeniería de tejidos, que implica la aplicación de células, andamios y citoquinas, se considera una solución prometedora para la regeneración ósea. En consecuencia, varios modelos animales que simulan defectos óseos desempeñan un papel crucial en la exploración del potencial terapéutico de la ingeniería de tejidos para la cicatrización ósea. En este estudio, establecimos un modelo de defecto óseo cortical en forma de caja en la parte media del fémur de ratas, que podría servir como modelo ideal para evaluar la función de los biomateriales en la promoción de la curación ósea. Este defecto óseo cortical en forma de caja se perforó con una pieza de mano oral de baja velocidad y se moldeó con una aguja de torno. Inmediatamente se realizó un análisis de micro-TC postoperatorio para confirmar el establecimiento exitoso del defecto óseo cortical de la cavidad de caja. Los fémures del lado operado de las ratas se recolectaron en múltiples puntos de tiempo después de la cirugía (0 días, 2 semanas, 4 semanas y 6 semanas). El proceso de cicatrización del área defectuosa de cada muestra se evaluó mediante micro-TC, tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y tinción con tricrómico de Masson. Estos resultados demostraron un patrón de cicatrización consistente con la osificación intramembranosa, con una curación esencialmente completa a las 6 semanas. La categorización del proceso de curación de este modelo animal proporciona un método in vivo eficaz para investigar nuevos biomateriales y fármacos que se dirigen a la osificación intramembranosa durante la cicatrización de defectos de tejido óseo.
Introduction
El hueso fracturado y defectuoso suele ser el resultado de traumatismos, tumores, inflamación y malformaciones congénitas 1,2. Aunque el tejido óseo en individuos jóvenes y sanos suele poseer capacidades regenerativas robustas3, los defectos que superan un tamaño crítico o los impedimentos de cicatrización debidos a enfermedades sistémicas (por ejemplo, diabetes, osteoporosis e infecciones) pueden provocar complicaciones como discontinuidad ósea o deterioro de la cicatrización4. Para abordar este desafío clínico, los injertos óseos o biomateriales se utilizan comúnmente para reemplazar hueso gravemente defectuoso o para reconstruir segmentos óseos grandes. Sin embargo, estos tratamientos tienen limitaciones. Por ejemplo, a pesar de ser considerado el estándar de oro, el injerto óseo autólogo sufre de un suministro restringido de donantes y de posibles complicaciones en el sitio donante 5,6. Los aloinjertos también presentan ciertos riesgos, como el rechazo inmunomediado, la posible transmisión de enfermedades y los impactos negativos en las propiedades biomecánicas y biológicas del injerto7.
En los últimos años se ha producido un aumento de la investigación centrada en los mecanismos de curación de los defectos óseos. El uso de biomateriales alternativos y los avances en la ingeniería de tejidos se han convertido en temas destacados dentro del dominio de la regeneración ósea8. Antes de que estos biomateriales puedan aplicarse a la terapia humana, deben ser probados in vitro e in vivo para garantizar su eficacia y seguridad. Sin embargo, la reducida complejidad de los entornos in vitro y la ausencia de respuestas inmunitarias e inflamatorias limitan la evaluación de diversos biomateriales in vitro. En consecuencia, es necesario el establecimiento de modelos animales para diversos tipos de defectos del tejido óseo9. Los modelos animales permiten la evaluación de biomateriales en diferentes condiciones de carga, facilitan la comprensión de las características óseas específicas de cada especie y proporcionan información sobre la similitud entre los modelos animales y las situaciones clínicas humanas. Estas ventajas son esenciales para estudiar las interacciones hueso-andamio y trasladar los hallazgos de la investigación a la práctica clínica 9,10.
En la actualidad, los modelos animales de defectos óseos mecánicos son ampliamente utilizados para validar el rendimiento de los biomateriales, siendo los modelos de defectos óseos craneales y los modelos de defectos óseos segmentarios los métodos más comúnmente aplicados11. Los modelos de defectos óseos segmentarios, a menudo utilizados para imitar un traumatismo grave de huesos largos o tibiales que terminan en pseudoartrosis ósea, son ventajosos debido a sus dimensiones uniformes y posiciones anatómicas definidas, lo que simplifica las evaluaciones radiológicas o histológicas de la formación de hueso nuevo y la revascularización. Sin embargo, estos modelos requieren implantes metálicos para estabilizar los segmentos de fractura bilateral y requieren un proceso de cicatrización complejo que involucra tanto la osificación endocondral como la intramembranosa12. Por otro lado, los modelos de defectos óseos en la pantorrilla se han convertido en una herramienta de cribado primaria para evaluar biomateriales debido a sus diámetros de defecto estandarizados, su cómodo acceso quirúrgico y la función de soporte de la duramadre y los tejidos blandos13. A pesar de que son ampliamente utilizados para modelar la formación de hueso intramembranoso en escenarios clínicamente relevantes, no son adecuados para evaluar la cicatrización ósea en condiciones de carga biomecánica debido a su naturaleza no portante durante el proceso de cicatrización14.
Para abordar estas limitaciones, establecimos un modelo de defecto óseo cortical de cavidad cuadrada en el tejido de diáfisis femoral de ratas. Utilizando microtomografía computarizada (TC), reconstrucción tridimensional (3D) y tinción histopatológica (hematoxilina y eosina [HE] y Masson), analizamos el proceso de curación de este modelo en condiciones de hemostasia. Nuestro objetivo es ofrecer nuevos conocimientos para evaluar el rendimiento de los biomateriales en condiciones de carga biomecánica y para estudiar la bioingeniería y el mecanismo de la regeneración ósea frente a la osificación intramembranosa.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales de este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Para el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (macho, peso corporal de 300 g).
1. Preparación prequirúrgica
- Preparación del instrumento
- Consulte la Figura 1A para ver los instrumentos quirúrgicos utilizados en este estudio: afeitadora eléctrica, tijeras de tejido, tijeras oftálmicas, pinzas oftálmicas, bisturí desechable, separador perióstico, pieza de mano oral de baja velocidad, sonda oral, aspiradora de irrigación desechable, portaagujas, sutura 3.0.
- Prepare una sonda oral y marque el extremo curvo grande de la sonda con un rotulador de acuerdo con el diámetro del defecto (Figura 1B). Úselo para determinar el tamaño del defecto durante la cirugía.
- Esterilice todos los materiales quirúrgicos e instrumentos utilizados para realizar el procedimiento antes de usarlos. Empaque los materiales deseados en un paño doblado o papel de regalo y séllelos con cinta de autoclave para esterilización por vapor (125-135 °C durante 20-25 min).
- Preparación del área quirúrgica: Desinfectar la mesa de operaciones y el ambiente alrededor de la mesa rociando con alcohol al 75%. Cree un área estéril de aproximadamente 60 cm x 90 cm con cortinas esterilizadas en autoclave en la mesa de operaciones.
- Preparación de la anestesia
- Anestesiar las ratas por vía intraperitoneal con clorhidrato de ketamina al 10% (50-100 mg/kg) y xilacina al 2% (2 mg/kg). Utilice la inyección subcutánea de carprofeno (5 mg/kg) para la analgesia preoperatoria e intraoperatoria. Examine la profundidad de la anestesia mediante la prueba de pellizco de los dedos de los pies. Después de la anestesia, aplique ungüento ocular estéril en los ojos para prevenir la sequedad ocular y las lesiones en la córnea.
2. Procedimiento quirúrgico
- Coloque la rata en posición reclinada lateral sobre la mesa quirúrgica estéril y retire el vello de las extremidades inferiores con una afeitadora eléctrica.
- Use una solución de yodóforo al 5% y alcohol al 75% para desinfectar el tejido cutáneo en el área quirúrgica.
- Localiza el fémur proximal y distal y haz una incisión de 2,5 cm a lo largo del eje largo del fémur para cortar el tejido de la piel de la rata.
- Separe la capa de piel de la fascia con pinzas oftálmicas y tijeras de tejido, y exponga el abordaje lateral del fémur a través del bíceps femoral y los músculos femorales laterales.
- Localice la intersección de los dos tabiques musculares (una línea de tejido blanco) y sepárela cuidadosamente con una cuchilla quirúrgica desechable a lo largo del borde muscular hasta llegar a la superficie femoral.
NOTA: Cuando se utiliza una cuchilla desechable para separar el músculo, es importante separar a lo largo del tabique muscular y tener cuidado de no causar lesiones vasculares dentro del tejido blando. Los principiantes y los que no están familiarizados con la anatomía deben usar pinzas oftálmicas y separadores periósticos en la disección roma entre los dos volúmenes musculares.
- Aplique un separador perióstico para separar sin rodeos los músculos de la superficie femoral y exponer la mitad de la diáfisis femoral.
- Utilice un rotulador estéril para marcar el área del sitio del defecto en la superficie media de la diáfisis femoral, ubicada en la parte superior de la cresta oblicua lateral de 1/3 de la cabeza femoral.
- Utilice la pieza de mano oral de baja velocidad con un taladro de bola de cámara lenta de 1,2 mm de diámetro para perforar un pequeño orificio perpendicular a la superficie ósea en el sitio marcado, destruyendo el periostio y la corteza ósea con una profundidad lo suficientemente profunda como para llegar a la cavidad de la médula ósea. A este nivel de profundidad de perforación, expanda el tamaño del orificio paralelo a esta profundidad en todas las direcciones, recortando para lograr una forma de cavidad de caja.
- Utilice una sonda oral etiquetada paralela al borde del defecto para determinar el diámetro y la morfología del defecto durante y después de la preparación.
- Cerrar las capas muscular y cutánea con suturas absorbibles de monofilamento 3-0, respectivamente, y desinfectar la zona quirúrgica con yodóforo al 5% desde el interior.
3. Cuidados postoperatorios
- Después de la cirugía, administre carprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea y coloque a la rata en una almohadilla térmica de temperatura constante hasta la recuperación de la anestesia. Cuando la rata recupere la conciencia, muévala suavemente a una jaula que contenga ropa de cama seca y esterilizada en autoclave.
- Continuar con analgesia durante 24 h y seguimiento postoperatorio durante 1 semana después de la cirugía.
4. Recogida y análisis de muestras
- Sacrificar humanamente a la rata después de la cirugía inyectando pentobarbital sódico 100-200 mg/kg por vía intraperitoneal. Separe cuidadosamente el músculo y el tejido fascial de la superficie del fémur y extraiga completamente el fémur del lado operado. Recoja las muestras a los 0 días (Figura 2A, B), a las 2 semanas, 4 semanas y 6 semanas después de la operación.
- Fijar las muestras femorales en paraformaldehído al 4% durante 24 h. Analizar la estructura del fémur mediante microtomografía computarizada. Configure los parámetros de escaneo de la siguiente manera: potencial del tubo de rayos X, 70 kVp; filtro, AL 0,5 mm; Intensidad de rayos X, 0,2 mA; tamaño del vóxel, 17 μm; y tiempo de integración, 1 × 300 ms. Reconstruya imágenes de modelos 3D utilizando datos de mapa de bits.
- Descalcifique las muestras en EDTA al 10% durante 8 semanas antes de deshidratar las muestras femorales en una serie graduada de diluciones de etanol. A continuación, incruste las muestras en cera de parafina15.
- Corte las muestras incrustadas en secciones de parafina de 5 μm desde el plano sagital.
- Tiña las secciones con un kit de tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y un kit de tinción de Masson. Observar la cicatrización de la zona defectuosa mediante histopatología.
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Representative Results
En este protocolo, establecemos con éxito un modelo de defecto de caja femoral de rata con dimensiones de 4,5 mm x 1,5 mm mediante perforación. Con el fin de analizar el proceso de cicatrización, se recolectó el tejido femoral del lado operado a los 0 días, 2 semanas, 4 semanas y 6 semanas después de la cirugía, que son los puntos clave de la osificación endocondral, la osificación intramembranosa y el remodelado óseo durante el proceso de curación del trauma femoral en ratas2. En el día 0 postoperatorio, la reconstrucción del modelo 3D a partir de datos de mapa de bits de micro-CT mostró que modelamos con éxito un defecto de caja de cavidad en el fémur con un tamaño de 4,5 mm x 1,5 mm de profundidad en la cavidad de la médula ósea (Figura 3A). Los resultados de la micro-TC mostraron formación de hueso trabecular mineralizado en el espacio intersticial del defecto óseo cortical 2 semanas después de la creación del modelo (Figura 3B). La superficie del nuevo tejido óseo en el área defectuosa mostraba hueso cortical maduro y denso, y el tejido óseo trabecular aún era visible en el lado medular 4 semanas después de la operación (Figura 3C). Después de 6 semanas, el área del defecto estaba casi compuesta por hueso cortical maduro y denso, con solo una pequeña cantidad de tejido óseo trabecular restante cerca del lado medular, lo que indicaba que el área del defecto básicamente se había curado (Figura 3D).
También analizamos los especímenes recolectados mediante tinción H&E y tinción tricrómica de Masson (Figura 4). Los resultados mostraron que se formó tejido óseo trabecular previo en el área defectuosa 2 semanas después de la operación, y el periostio alrededor del área defectuosa se engrosó y se conectó con el tejido óseo trabecular del recién nacido en el área defectuosa (Figura 4A, A', B, B'). A las 4 semanas después de crear el defecto, se formó tejido óseo cortical denso en la superficie del área del defecto y se conectó con el hueso cortical a ambos lados del defecto; El tejido óseo de tipo trabecular se reabsorbió fuertemente en el lado medular (Figura 4C,C',D,D'). Se formó tejido óseo cortical maduro en el área del defecto, y el tejido óseo trabecular en el lado medular se reabsorbió casi por completo 6 semanas después de la operación (Figura 4E,E',F,F'), lo que indica que el proceso de curación del defecto estaba casi completo.
Figura 1: Instrumentos necesarios para la creación de defectos. (A) Instrumentos quirúrgicos. (1) Afeitadora eléctrica; (2) Pinzas oftálmicas; (3) Tijeras oftálmicas; (4) Bisturí desechable; (5) Separador perióstico; (6) Pieza de mano oral de baja velocidad; (7) Sonda oral modificada; (8) Aspiradora de riego desechable; (9) Portaagujas; (10) Tijeras de tejido; (11) Sutura 3.0. (B) Sondas orales etiquetadas con las dimensiones del diámetro del defecto. El gran extremo curvo de la sonda oral desechable estéril se marcó con una escala de 1,5 mm y 4,5 mm para la medición intraoperatoria del diámetro del área del defecto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología del defecto de la cavidad de la caja (Día 0). (A,B) Medición de muestras postoperatorias del día 0 utilizando una sonda oral modificada que se utilizó para crear el defecto de la cavidad de la caja (4,5 mm x 1,2 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis micro-CT del proceso de cicatrización de la zona defectuosa. Imágenes reconstruidas en 3D de la zona defectuosa a los 0 días, 14 días, 28 días y 42 días después de la cirugía. (A) Plano longitudinal . (B-D) Imágenes de microtomografía computarizada longitudinales (panel izquierdo), sagitales (centrales) y transversales (panel derecho) de la cicatrización del área defectuosa a los 14 días, 28 días y 42 días. El cuadro discontinuo amarillo en A, B, C y D representa el área del defecto. La línea discontinua amarilla representa los bordes del defecto y la flecha amarilla representa el nuevo tejido óseo en el área del defecto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Resultados histopatológicos. (De la A a la F) Tinción de H&E y Masson en el área defectuosa a los 14 días, 28 días y 42 días. (A'-F') Las imágenes ampliadas de las cajas rectangulares negras que se muestran en A-F. Se formó tejido óseo mineralizado de tipo trabecular en el área del defecto a los 14 días después de la cirugía; Se formó tejido óseo cortical en la superficie del área del defecto y se conectó a ambos extremos del área del defecto a los 28 días después de la cirugía; Se formó tejido óseo cortical maduro en el área del defecto a los 42 días después de la cirugía, y la cicatrización se completó básicamente. La línea punteada azul indica el borde del defecto; el área rodeada por la línea punteada roja es el nuevo tejido óseo en el área del defecto; la flecha negra es el periostio engrosado; el triángulo amarillo es el viejo hueso cortical; la flecha verde es el nuevo tejido óseo trabecular; las estrellas negras y amarillas son el nuevo tejido óseo cortical; Y la flecha roja es el nuevo periostio. Barras de escala: 500 μm (A-F), 200 μm (A'-F'). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los modelos animales preclínicos son vitales para examinar la cicatrización ósea y la influencia de los biomateriales en la regeneración ósea. Este protocolo ilustra un modelo de defecto de la cavidad femoral que replica el proceso de formación de hueso intramembranoso asociado con la regeneración ósea clínica. El área defectuosa se estandarizó intraoperatoriamente mediante una sonda oral premarcada. Los resultados de la micro-TC y de la tinción histopatológica mostraron una cicatrización progresiva a lo largo de 6 semanas, con engrosamiento del periostio y formación de nuevo hueso trabecular, seguido de formación de hueso cortical denso. No se observó tejido cartilaginoso durante el proceso de cicatrización, lo que indica osteogénesis intramembranosa. Este hallazgo presenta nuevas perspectivas para estudiar el papel de los biomateriales o fármacos en la regeneración ósea clínica.
Este protocolo requiere una atención cuidadosa a varios factores: (i) La anestesia profunda es un requisito previo para prevenir el sufrimiento de los animales y garantizar la localización precisa de los defectos. La profundidad de la anestesia y los signos vitales deben ser monitoreados atentamente. (ii) Durante la separación muscular, se debe prestar una atención meticulosa para prevenir lesiones vasculares, que podrían dificultar la recuperación. (iii) Al preparar el orificio de defecto, mantenga el punto de apoyo derecho estable y siempre perpendicular a la superficie ósea para asegurarse de que el defecto de la caja esté a la misma profundidad. La profundidad de la fresa debe controlarse para eliminar el tejido óseo cortical sin profundizar demasiado. Esto evita retrasar la cicatrización ósea debido a la destrucción mecánica excesiva de la médula ósea, lo que resulta en la eliminación de células madre mesenquimales (MSC) y la interrupción de la respuesta inflamatoria16. (iv) La preparación de la cavidad requiere que un asistente irriga continuamente el área con solución salina para mitigar el daño tisular potencial causado por el calor durante la ablación ósea mientras se mantiene la visibilidad del campo quirúrgico.
Los modelos de fractura ósea, defecto óseo segmentario y defecto óseo craneal son los modelos animales más utilizados en la investigación de la regeneración ósea. El modelo de fractura ósea refleja el proceso real del traumatismo, pero los resultados pueden variar debido a las diferencias en las secciones transversales de fractura entre los animales de experimentación17. El modelo de defecto óseo segmentario simula eficazmente las complicaciones de la fractura, como la falta de consolidación o el retraso en la cicatrización. Debido a su posicionamiento anatómico, este modelo facilita la evaluación de la formación de hueso nuevo y la revascularización mediante métodos radiográficos o histológicos18. Sin embargo, este método presenta una variación considerable en el tamaño del defecto entre los sujetos; La necesidad de fijación con férula o fijación interna con implantes metálicos también limita su aplicación11. El modelo de defecto de la pantorrilla se caracteriza por la ausencia de fijación interna, la alta reproducibilidad en tamaño y posición anatómica, y un ambiente mecánico estable14, lo que también restringe la aplicación en la evaluación de la respuesta biológica a la carga fisiológica y biomecánica del material implantado13. Además, en ausencia de hueso de injerto, la invasión del defecto por la duramadre y el tejido blando suprayacente puede dificultar la regeneración ósea, lo que hace que estos modelos sean sensibles al rendimiento del material del andamio18. Por lo tanto, este protocolo propone el establecimiento de un defecto de caja-cavidad en la diáfisis femoral de rata, lo que permite la medición intraoperatoria del diámetro del defecto utilizando una herramienta simple18. Este enfoque ofrece un mejor control sobre la estandarización de defectos que los modelos de fracturas o defectos segmentarios y elimina la necesidad de fijación interna o externa. Además, este modelo es robusto contra el deterioro de la formación ósea debido a la erosión de los tejidos blandos. Este protocolo, sin embargo, presenta ciertas limitaciones: (i) La ejecución incorrecta o los diámetros excesivos de los defectos pueden provocar una hemorragia grave, un shock o incluso la muerte en ratas. Por lo tanto, para garantizar la seguridad y el bienestar de los animales, es imperativo practicar cadáveres de ratas antes de realizar el procedimiento en sujetos vivos. (ii) Además, la ausencia del sistema de Havers en la corteza de los roedores19 dificulta la reproducción completa del proceso natural de curación clínica de la fractura/defecto óseo humano. Las ratas, al igual que los roedores, son rentables, requieren un mantenimiento mínimo y son seguras y fáciles de manejar, proporcionando una mayor reproducibilidad que los animales más grandes como conejos, perros y cabras20.
En resumen, desarrollamos un modelo de defecto de cavidad de caja de diáfisis femoral en ratas y rastreamos el proceso de curación utilizando técnicas de micro-TC y tinción histopatológica. Este protocolo proporciona un método completo y generalizable para examinar la formación de hueso intramembranoso dentro de modelos de regeneración ósea clínicamente significativos. Además, propone perspectivas innovadoras para la evaluación del rendimiento biológico de biomateriales sustitutivos, fármacos asociados a la regeneración ósea, andamios, etcétera. También facilita la validación preclínica de estrategias terapéuticas emergentes para la ingeniería de tejidos óseos.
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Disclosures
Todos los datos e imágenes originales están incluidos en este documento. Los autores declaran no tener conflicto de intereses
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) y 82100982 (F. L.), y respaldado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan 2023NSFSC1499 (H. W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
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