Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att skapa en box-kavitetsdefekt i råtta femoral diafysvävnad. Denna modell kan bedöma biomaterials prestanda under biomekanisk stress och utforska mekanismer för benregenerering relaterad till intramembranös osteogenes.
Abstract
Allvarliga bendefekter eller komplexa frakturer kan leda till allvarliga komplikationer såsom utebliven läkning eller otillräcklig benläkning. Vävnadsteknik, som involverar applicering av celler, strukturer och cytokiner, anses vara en lovande lösning för benregenerering. Följaktligen spelar olika djurmodeller som simulerar bendefekter en avgörande roll för att utforska den terapeutiska potentialen för vävnadsteknik för benläkning. I denna studie etablerade vi en lådformad kortikal bendefektmodell i mitten av lårbenet hos råttor, som kan fungera som en idealisk modell för att bedöma biomaterials funktion för att främja benläkning. Denna lådformade kortikala bendefekt borrades med hjälp av ett oralt låghastighetshandstycke och formades av en svarvnål. Postoperativ mikro-CT-analys utfördes omedelbart för att bekräfta den framgångsrika etableringen av den kortikala bendefekten i boxkaviteten. Lårbenen på den opererade sidan av råttorna skördades sedan vid flera tidpunkter efter operationen (0 dagar, 2 veckor, 4 veckor och 6 veckor). Läkningsprocessen för varje provs defektområde utvärderades med hjälp av mikro-CT, hematoxylin och eosin (H&E) färgning och Masson trikromfärgning. Dessa resultat visade ett läkningsmönster som överensstämde med intramembranös förbening, med läkning i princip klar efter 6 veckor. Kategoriseringen av denna djurmodells läkningsprocess ger en effektiv in vivo-metod för att undersöka nya biomaterial och läkemedel som riktar sig mot intramembranös benbildning under läkning av benvävnadsdefekter.
Introduction
Frakturer och defekta ben är ofta ett resultat av trauma, tumörer, inflammation och medfödda missbildningar 1,2. Även om benvävnad hos unga friska individer vanligtvis har robusta regenerativa förmågor3, kan defekter som överstiger en kritisk storlek eller läkningshinder på grund av systemiska sjukdomar (t.ex. diabetes, osteoporos och infektioner) fortfarande leda till komplikationer som bendiskontinuitet eller försämrad läkning4. För att ta itu med denna kliniska utmaning används ofta bentransplantation eller biomaterial för att ersätta allvarligt defekt ben eller för att rekonstruera stora bensegment. Dessa behandlingar har dock begränsningar. Till exempel, även om autolog bentransplantation anses vara den gyllene standarden, lider den av begränsad tillgång på donatorer och potentiella komplikationer vid donatorstället 5,6. Alltransplantat medför också vissa risker, såsom immunmedierad avstötning, potentiell överföring av sjukdomar och negativa effekter på transplantatets biomekaniska och biologiska egenskaper7.
Under de senaste åren har det skett en ökning av forskning med fokus på mekanismer för läkning av bendefekter. Användningen av alternativa biomaterial och framsteg inom vävnadsteknik har dykt upp som framträdande ämnen inom området benregenerering8. Innan dessa biomaterial kan användas för behandling på människor måste de testas in vitro och in vivo för att säkerställa deras effektivitet och säkerhet. Den minskade komplexiteten i in vitro-miljöer och frånvaron av immunologiska och inflammatoriska svar begränsar dock utvärderingen av olika biomaterial in vitro. Följaktligen är det nödvändigt att etablera djurmodeller för olika typer av benvävnadsdefekter9. Djurmodeller gör det möjligt att utvärdera biomaterial under olika belastningsförhållanden, underlättar förståelsen av artspecifika benegenskaper och ger insikt i likheten mellan djurmodeller och kliniska situationer på människor. Dessa fördelar är viktiga för att studera interaktioner mellan ben och ställning och översätta forskningsresultat till klinisk praxis 9,10.
För närvarande används mekaniska bendefekta djurmodeller i stor utsträckning för att validera biomaterials prestanda, med kraniala bendefektmodeller och segmentella bendefektmodeller som de mest använda metoderna11. Segmentella bendefektmodeller, som ofta används för att efterlikna allvarligt långt ben- eller tibialtrauma som slutar med att benet inte är i union, är fördelaktiga på grund av deras enhetliga dimensioner och definierade anatomiska positioner, vilket förenklar radiologiska eller histologiska utvärderingar av ny benbildning och revaskularisering. Dessa modeller kräver dock metallimplantat för att stabilisera bilaterala fraktursegment och kräver en komplex läkningsprocess som involverar både endokondral och intramembranös förbening12. Å andra sidan har calvarial bendefektmodeller blivit ett primärt screeningverktyg för att utvärdera biomaterial på grund av deras standardiserade defektdiametrar, bekväm kirurgisk åtkomst och den stödjande funktionen av dura mater och mjukvävnad13. Även om de används i stor utsträckning för att modellera intramembranös benbildning i kliniskt relevanta scenarier, är de olämpliga för att utvärdera benläkning under biomekaniska belastningsförhållanden på grund av deras icke-bärande karaktär under läkningsprocessen14.
För att ta itu med dessa begränsningar etablerade vi en modell för kortikal bendefekt i box-kaviteten i lårbensdiafysvävnaden hos råttor. Med hjälp av mikrodatortomografi (CT), tredimensionell (3D) rekonstruktion och histopatologisk färgning (hematoxylin och eosin [HE] och Masson) analyserade vi läkningsprocessen för denna modell under hemostasförhållanden. Vi strävar efter att erbjuda nya insikter för att utvärdera biomaterials prestanda under biomekaniska belastningsförhållanden och för att studera biotekniken och mekanismen för benregenerering jämfört med intramembranös benbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer i denna studie granskades och godkändes av den etiska kommittén vid West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). Sprague-Dawley-råttor (hane, kroppsvikt 300 g) användes för den aktuella studien.
1. Preoperativ förberedelse
- Förberedelse av instrument
- Se figur 1A för de kirurgiska instrument som används i denna studie: elektrisk rakapparat, vävnadssax, oftalmisk sax, oftalmisk pincett, engångsskalpell, periosteal separator, oralt låghastighetshandstycke, oral sond, engångsspolningsdammsugare, nålhållare, 3.0 sutur.
- Förbered en oral sond och markera den stora böjda änden av sonden med en markörpenna beroende på defektens diameter (Figur 1B). Använd detta för att bestämma storleken på defekten under operationen.
- Sterilisera allt kirurgiskt material och instrument som används för att utföra ingreppet före användning. Packa önskade material i vikt tyg eller omslagspapper och försegla dem med autoklavtejp för ångsterilisering (125-135 °C i 20-25 min).
- Förberedelse av operationsområdet: Desinficera operationsbordet och miljön runt bordet genom att spraya med 75 % alkohol. Skapa ett cirka 60 cm x 90 cm sterilt område med autoklaverade draperier på operationsbordet.
- Förberedelse för anestesi
- Bedöva råttorna intraperitonealt med 10 % ketaminhydroklorid (50-100 mg/kg) och 2 % xylazin 2 mg/kg). Använd subkutan injektion av karprofen (5 mg/kg) för preoperativ och intraoperativ analgesi. Undersök djupet på anestesi genom att nypa ihop tårna. Efter narkos, applicera steril ögonsalva på ögonen för att förhindra torra ögon och hornhinneskada.
2. Kirurgiskt ingrepp
- Placera råttan i sidoläge på det sterila operationsbordet och ta bort hårstråna i nedre extremiteterna med en elektrisk rakapparat.
- Använd 5 % jodforlösning och 75 % alkohol för att desinficera hudvävnaden i det kirurgiska området.
- Lokalisera det proximala och distala lårbenet och gör ett 2,5 cm snitt längs lårbenets långa axel för att skära igenom råttans hudvävnad.
- Separera hudlagret från fascian med en oftalmisk pincett och vävnadssax, och exponera den laterala inflygningen till lårbenet genom biceps femoris och laterala lårbensmusklerna.
- Lokalisera skärningspunkten mellan de två muskelskiljeväggarna (en vit vävnadslinje) och separera försiktigt med ett kirurgiskt engångsblad längs muskelkanten tills lårbensytan nås.
OBS: När du använder ett engångsblad för att separera muskeln är det viktigt att separera längs muskelskiljeväggen och vara försiktig så att du inte orsakar kärlskador i mjukvävnaden. Nybörjare och de som inte är bekanta med anatomin måste använda oftalmisk pincett och periosteala separatorer i trubbig dissektion mellan de två muskelbulkarna.
- Använd en periosteal separator för att trubbigt separera lårbenets ytmuskler och exponera mitten av lårbensdiafysen.
- Använd en steril markörpenna för att markera området för det defekta stället på mitten av lårbensdiafysen, som ligger högst upp på den laterala 1/3 sneda kammen på lårbenshuvudet.
- Använd det orala låghastighetshandstycket med en slowmotion-kulborr med en diameter på 1,2 mm för att borra ett litet hål vinkelrätt mot benytan på den markerade platsen, vilket förstör periosteum och bencortex med ett djup som är tillräckligt djupt för att nå benmärgshålan. Vid denna borrdjupsnivå, expandera storleken på hålet parallellt med detta djup i alla riktningar, trimma för att uppnå en lådhålrumsform.
- Använd en märkt oral sond parallellt med kanten av defekten för att bestämma defektens diameter och morfologi under och efter beredning.
- Stäng muskel- och hudlagren med 3-0 monofilamentabsorberbara suturer respektive desinficera det kirurgiska området med 5 % jodfor inifrån och ut.
3. Postoperativ vård
- Efter operationen administreras karprofen (5 mg/kg) subkutant och råttan placeras på en värmedyna med konstant temperatur tills den återhämtat sig från anestesi. När råttan återfår medvetandet, flytta den försiktigt till en bur som innehåller torra, autoklaverade sängkläder.
- Fortsätt med smärtlindring i 24 timmar och postoperativ övervakning i 1 vecka efter operationen.
4. Provtagning och analys
- Avliva råttan på människa efter operationen genom att injicera pentobarbitalnatrium 100-200 mg/kg intraperitonealt. Separera försiktigt muskel- och fasciavävnaden på lårbenets yta och ta bort lårbenet på den opererade sidan helt. Samla prover vid 0 dagar (Figur 2A, B), 2 veckor, 4 veckor och 6 veckor postoperativt.
- Fixera lårbensproverna i 4% paraformaldehyd i 24 timmar. Analysera lårbenets struktur med hjälp av mikrodatortomografi. Ställ in skanningsparametrarna enligt följande: Röntgenrörspotential, 70 kVp; filter, AL 0,5 mm; Röntgenintensitet, 0,2 mA; voxel storlek, 17 μm; och integrationstid, 1 × 300 ms. Rekonstruera 3D-modellbilder med hjälp av bitmappsdata.
- Avkalka proverna i 10 % EDTA i 8 veckor innan lårbensproverna dehydreras i en graderad serie etanolutspädningar. Bädda sedan in proverna i paraffinvax15.
- Skär de inbäddade proverna i 5 μm paraffinsektioner från sagittalplanet.
- Betsningssektioner med både ett hematoxylin- och eosin (H&E) infärgningskit och ett Masson infärgningskit. Observera läkningen av det defekta området genom histopatologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll etablerar vi framgångsrikt en modell av en defekt på råttans lårbenslåda med dimensionerna 4,5 mm x 1,5 mm genom borrning. För att analysera läkningsprocessen samlade vi in lårbensvävnaden på den opererade sidan vid 0 dagar, 2 veckor, 4 veckor och 6 veckor efter operationen, vilka är de viktigaste tidpunkterna för endokondral benbildning, intramembranös benbildning och benremodellering under läkningsprocessen av lårbenstrauma hos råttor2. På postoperativ dag 0 visade rekonstruktion av 3D-modellen från mikro-CT bitmappsdata att vi framgångsrikt modellerade en box-kavitetsdefekt i lårbenet med en storlek på 4,5 mm x 1,5 mm djup till märghålan (Figur 3A). Resultaten av mikro-CT visade mineraliserad trabekulär benbildning i det interstitiella utrymmet av den kortikala bendefekten 2 veckor efter modellskapande (Figur 3B). Ytan på den nya benvävnaden i det defekta området visade mogen, tät kortikal benvävnad, och trabekulär benvävnad var fortfarande synlig på den medullära sidan 4 veckor postoperativt (Figur 3C). Efter 6 veckor var det defekta området nästan sammansatt av moget, tätt kortikalt ben, med endast en liten mängd trabekulär benvävnad kvar nära märgsidan, vilket indikerar att det defekta området i princip hade läkt (Figur 3D).
Vi analyserar också de insamlade proverna med H&E färgning och Masson trikromfärgning (Figur 4). Resultaten visade att naiv trabekulär benvävnad bildades i defektområdet 2 veckor postoperativt, och att periosteum runt defektområdet förtjockades och kopplades samman med den nyfödda trabekulära benvävnaden i defektområdet (Figur 4A,A',B,B'). Vid 4 veckor efter att defekten skapats bildades tät kortikal benvävnad på ytan av defektområdet och kopplades till det kortikala benet på båda sidor av defekten; trabekulär benvävnad resorberades kraftigt på den medullära sidan (Figur 4C,C',D,D'). Mogen kortikal benvävnad bildades i defektområdet, och den trabekulära benvävnaden på den medullära sidan resorberades nästan fullständigt 6 veckor postoperativt (Figur 4E,E',F,F'), vilket indikerar att defektens läkningsprocess var nästan fullständig.
Figur 1: Instrument som krävs för att skapa defekter. (A) Kirurgiska instrument. (1) Elektrisk rakapparat; (2) Oftalmisk pincett; (3) Oftalmisk sax; (4) Skalpell för engångsbruk; 5. Periosteal separator. 6. Oralt låghastighetsstycke. (7) Modifierad oral sond; (8) Dammsugare för engångsbevattning; (9) Nålhållare; 10. Vävnadssaxar. (11) 3.0 sutur. (B) Orala sonder märkta med måtten på defektens diameter. Den stora böjda änden av den sterila orala engångssonden märktes med en skala på 1,5 mm och 4,5 mm för intraoperativ mätning av diametern på det defekta området. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologi hos defekten i lådans kavitet (dag 0). (A,B) Mätning av dag 0 postoperativa prover med hjälp av en modifierad oral sond som användes för att skapa defekten i boxhåligheten (4,5 mm x 1,2 mm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Micro-CT-analys av läkningsprocessen i det defekta området. 3D-rekonstruerade bilder av det defekta området vid 0 dagar, 14 dagar, 28 dagar och 42 dagar efter operationen. A) Längsgående plan. (B-D) Längsgående (vänster panel), sagittal (mitten) och tvärsnitt (höger panel) mikro-CT-bilder av läkning av det defekta området vid 14 dagar, 28 dagar och 42 dagar. Den gula streckade rutan i A, B, C och D representerar det defekta området. Den gula streckade linjen representerar kanterna på defekten och den gula pilen representerar den nya benvävnaden i defektområdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Histopatologiska resultat. (A–F) H&E och Masson färgning av det defekta området efter 14 dagar, 28 dagar och 42 dagar. (A'-F') De inzoomade bilderna av de svarta rektangulära rutorna som visas i A-F. Trabekulärliknande mineraliserad benvävnad bildades i det defekta området 14 dagar efter operationen; kortikal benvävnad bildades på ytan av det defekta området och anslöts till båda ändarna av defektområdet 28 dagar efter operationen; Mogen kortikal benvävnad bildades i det defekta området 42 dagar efter operationen, och läkningen var i princip klar. Den blå prickade linjen indikerar kanten på defekten; Området som omges av den röda streckade linjen är den nya benvävnaden i det defekta området; Den svarta pilen är det förtjockade periosteum; Den gula triangeln är det gamla kortikala benet; Den gröna pilen är den nya trabekulära liknande benvävnaden; De svarta och gula stjärnorna är den nya kortikala benvävnaden; Och den röda pilen är det nya periosteum. Skalstreck: 500 μm (A-F), 200 μm (A'-F'). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prekliniska djurmodeller är viktiga för att undersöka benläkning och biomaterials påverkan på benregenerering. Detta protokoll illustrerar en modell för defekt i lårbensboxen som replikerar den intramembranösa benbildningsprocessen i samband med klinisk benregenerering. Det defekta området standardiserades intraoperativt med hjälp av en förmärkt oral sond. Mikro-CT och histopatologiska färgningsresultat visade progressiv läkning under 6 veckor, med förtjockad periosteum och ny trabekulär benbildning, följt av tät kortikal benbildning. Ingen broskvävnad observerades under läkningsprocessen, vilket tyder på intramembranös osteogenes. Fyndet ger nya perspektiv för att studera biomaterialens eller läkemedlens roll i klinisk benregenerering.
Detta protokoll kräver noggrann uppmärksamhet på flera faktorer: (i) Djup anestesi är en förutsättning för att förhindra djurs lidande och säkerställa korrekt lokalisering av defekter. Anestesidjup och vitala tecken bör övervakas noga. (ii) Under muskelseparation bör noggrann uppmärksamhet ägnas åt att förhindra kärlskador, vilket kan hindra återhämtningen. (iii) När du förbereder det defekta hålet, håll den högra stödpunkten stabil och alltid vinkelrät mot benytan för att säkerställa att låddefekten är på samma djup. Borrdjupet bör kontrolleras för att avlägsna kortikal benvävnad utan att gå för djupt. På så sätt undviker man att fördröja benläkningen på grund av överdriven mekanisk förstörelse av benmärgen, vilket leder till att mesenkymala stamceller (MSC) avlägsnas och att det inflammatoriskasvaret störs. (iv) Kavitetsförberedelsen kräver att en assistent kontinuerligt bevattnar området med koksaltlösning för att mildra potentiell vävnadsskada orsakad av värme under benablation samtidigt som det kirurgiska fältets synlighet bibehålls.
Modeller för benfrakturer, segmentella bendefekter och kraniala bendefekter är de vanligaste djurmodellerna för att undersöka benregenerering. Benfrakturmodellen speglar den faktiska traumaprocessen, men resultaten kan variera på grund av skillnader i frakturtvärsnitt mellan försöksdjur17. Den segmentella bendefektmodellen simulerar effektivt frakturkomplikationer såsom utebliven läkning eller fördröjd läkning. På grund av sin anatomiska positionering underlättar denna modell utvärderingen av ny benbildning och revaskularisering genom radiografiska eller histologiska metoder18. Denna metod uppvisar dock en betydande variation i defektstorlek mellan försökspersoner; Kravet på skenfixering eller intern fixering med metallimplantat begränsar också dess tillämpning11. Den calvariala defektmodellen kännetecknas av ingen intern fixering, hög reproducerbarhet i storlek och anatomisk position och en stabil mekanisk miljö14, vilket också begränsar tillämpningen vid utvärdering av det biologiska svaret på fysiologisk, biomekanisk belastning av implanterat material13. Dessutom, i frånvaro av ett transplantatben, kan invasionen av defekten av dura mater och överliggande mjukvävnad hindra benregenerering, vilket gör dessa modeller känsliga för ställningsmaterialets prestanda18. Därför föreslår detta protokoll att man fastställer en box-cavity-defekt i råttans lårbensdiafys, vilket möjliggör intraoperativ mätning av defektdiametern med hjälp av ett enkelt verktyg18. Detta tillvägagångssätt ger bättre kontroll över defektstandardisering än fraktur- eller segmentdefektmodellerna och eliminerar behovet av intern eller extern fixering. Dessutom är denna modell robust mot försämring av benbildning på grund av mjukvävnadserosion. Detta protokoll har dock vissa begränsningar: (i) Felaktigt utförande eller alltför stora defektdiametrar kan leda till allvarliga blödningar, chock eller till och med dödsfall hos råttor. Således, för att säkerställa djurens säkerhet och välbefinnande, är det absolut nödvändigt att öva råttkadaver innan du utför ingreppet på levande försökspersoner. (ii) Dessutom gör frånvaron av Haversian-systemet i gnagarecortex 19 det svårt att helt reproducera den naturliga kliniska läkningsprocessen av mänsklig benfraktur/defekt. Råttor, som gnagare, är kostnadseffektiva, kräver minimalt underhåll och är säkra och lätta att hantera, vilket ger högre reproducerbarhet än större djur som kaniner, hundaroch getter.
Sammanfattningsvis utvecklade vi en modell för defektdefekt hos råtta femoral diafys box-kavitet och spårade läkningsprocessen med hjälp av mikro-CT och histopatologiska färgningstekniker. Detta protokoll ger en omfattande och generaliserbar metod för att granska intramembranös benbildning inom kliniskt signifikanta benregenereringsmodeller. Dessutom föreslås innovativa perspektiv för biologisk prestandautvärdering av ersättningsbiomaterial, läkemedel som är förknippade med benregenerering, stödstrukturer etc. Det underlättar också den prekliniska valideringen av framväxande terapeutiska strategier för benvävnadsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla originaldata och bilder ingår i detta dokument. Författarna uppger att de inte är jäviga
Acknowledgments
Denna studie finansierades av bidrag från National Natural Science Foundation of China 82101000 (H. W.), U21A20368 (LY) och 82100982 (FL), och stöddes av Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193 (2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66 (2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084 (2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977 (2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
