Summary
ここでは、ラット大腿骨骨幹組織に箱腔欠損を作成するためのプロトコルを示します。このモデルは、生体力学的ストレス下での生体材料の性能を評価し、膜内骨形成に関連する骨再生のメカニズムを探ることができます。
Abstract
重度の骨欠損や複雑な骨折は、癒合不全や骨治癒の不十分さなどの重篤な合併症を引き起こす可能性があります。細胞、スキャフォールド、サイトカインを応用する組織工学は、骨再生の有望な解決策と考えられています。その結果、骨欠損をシミュレートするさまざまな動物モデルは、骨治癒のための組織工学の治療可能性を探求する上で重要な役割を果たします。本研究では、ラットの大腿骨中部に箱型の皮質骨欠損モデルを確立し、生体材料の骨治癒促進機能を評価するための理想的なモデルとなることが期待されます。この箱型の皮質骨欠損を口腔低速ハンドピースを用いて穿孔し、旋盤針で成形した。術後マイクロCT分析が直ちに実施され、箱腔皮質骨欠損の確立が成功したことを確認しました。その後、ラットの手術側の大腿骨を、手術後の複数の時点(0日後、2週間後、4週間後、6週間後)に採取しました。各サンプルの欠損領域の治癒過程は、マイクロCT、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、およびマッソントリクローム染色を使用して評価されました。これらの結果は、膜内骨化と一致する治癒パターンを示し、治癒は基本的に6週間で完了しました。この動物モデルの治癒過程を分類することで、骨組織欠損治癒中の膜内骨化を標的とする新規生体材料や薬剤をin vivo で研究するための効果的な方法が得られます。
Introduction
骨折や骨の欠損は、多くの場合、外傷、腫瘍、炎症、および先天性奇形に起因します1,2。若年健常者の骨組織は通常、強固な再生能力を持っていますが3、臨界サイズを超える欠損や全身性疾患(糖尿病、骨粗鬆症、感染症など)による治癒障害は、骨の不連続性や治癒障害などの合併症を引き起こす可能性があります4。この臨床上の課題に対処するために、骨移植または生体材料は、重度に欠損した骨の置換や大きな骨セグメントの再建に一般的に使用されます。ただし、これらの治療法には制限があります。例えば、ゴールドスタンダードと考えられているにもかかわらず、自家骨移植はドナーの供給が制限され、ドナー部位の合併症の可能性に悩まされています5,6。同種移植片はまた、免疫介在性拒絶反応、疾患の潜在的な伝染、移植片7の生体力学的および生物学的特性への悪影響など、特定のリスクも提示します。
近年、骨欠損の治癒メカニズムに着目した研究が盛んに行われています。代替生体材料の使用と組織工学の進歩は、骨再生の領域内で重要なトピックとして浮上しています8。これらの生体材料を人間の治療に適用する前に、その有効性と安全性を確認するために、in vitroおよびin vivoで試験する必要があります。しかし、in vitro環境の複雑さが軽減され、免疫応答や炎症反応がないため、in vitroではさまざまな生体材料の評価が制限されています。したがって、さまざまな種類の骨組織欠損に対する動物モデルの確立が必要です9。動物モデルは、さまざまな負荷条件下での生体材料の評価を可能にし、種固有の骨特性の理解を促進し、動物モデルとヒトの臨床状況との類似性についての洞察を提供します。これらの利点は、骨と足場の相互作用を研究し、研究結果を臨床実践に変換するために不可欠です9,10。
現在、生体材料の性能を検証するために機械的な骨欠損動物モデルが広く使用されており、頭蓋骨欠損モデルと分節骨欠損モデルが最も一般的に適用されている方法である 11。骨の非癒合で終わる重度の長骨または脛骨の外傷を模倣するためによく利用されるセグメント骨欠損モデルは、均一な寸法と定義された解剖学的位置により有利であり、新しい骨形成と血行再建術の放射線学的または組織学的評価を簡素化します。しかし、これらのモデルでは、両側の骨折部分を安定させるために金属製のインプラントが必要であり、軟骨内骨化と膜内骨化の両方を含む複雑な治癒プロセスが必要です12。一方、頭蓋骨欠損モデルは、標準化された欠損直径、便利な外科的アクセス、および硬膜と軟組織の支持機能により、生体材料を評価するための主要なスクリーニングツールになっています13。それらは、臨床的に関連性のあるシナリオで膜内骨形成をモデル化するために広く使用されていますが、治癒過程14での非負荷負荷特性のため、生体力学的負荷条件下での骨治癒を評価するには適していません。
これらの制限に対処するために、ラットの大腿骨幹組織における箱腔皮質骨欠損モデルを確立しました。マイクロコンピュータ断層撮影法(CT)による三次元(3D)再構成、病理組織学的染色(ヘマトキシリンとエオシン[HE]およびマッソン)を用いて、止血条件下でのこのモデルの治癒過程を解析した。私たちは、生体力学的負荷条件下での生体材料の性能を評価し、膜内骨化に対する骨再生の生物工学とメカニズムを研究するための新たな洞察を提供することを目指しています。
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Protocol
この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会(WCHSIRB-D-2021-597)によってレビューされ、承認されました。本研究では、Sprague-Dawleyラット(雄、体重300g)を使用しました。
1. 術前準備
- 機器の準備
- この研究で使用された手術器具については、 図 1A を参照してください: 電気シェーバー、組織ハサミ、眼科用ハサミ、眼用鉗子、使い捨てメス、骨膜セパレーター、経口低速ハンドピース、経口プローブ、使い捨て灌漑用真空、ニードルホルダー、3.0 縫合糸。
- 経口プローブを準備し、欠陥の直径に応じてマーカーペンでプローブの大きな湾曲した端に印を付けます(図1B)。これを使用して、手術中の欠陥のサイズを決定します。
- 使用前に、手順を実行するために使用したすべての手術材料と器具を滅菌してください。折りたたんだ布または包装紙に目的の材料を詰め、オートクレーブテープで密封して蒸気滅菌します(125〜135°Cで20〜25分間)。
- 手術領域の準備:75%アルコールを噴霧して、手術台と手術台周辺の環境を消毒します。手術台の上にオートクレーブドドで約60cm×90cmの無菌領域を作成します。
- 麻酔の準備
- ラットを10%塩酸ケタミン(50-100 mg / kg)および2%キシラジン2 mg / kg)で腹腔内に麻酔します。術前および術中の鎮痛には、カルプロフェン(5 mg / kg)の皮下注射を使用します。.つま先つま先つまみテストで麻酔の深さを調べます。麻酔後、ドライアイや角膜損傷を防ぐために、滅菌眼軟膏を目に塗布します。
2.外科的処置
- ラットを滅菌手術台の横臥位に置き、電気シェーバーで下肢の毛を取り除きます。
- 5%ヨードフォア溶液と75%アルコールを使用して、手術部位の皮膚組織を消毒します。
- 大腿骨の近位部と遠位部の位置を特定し、大腿骨の長軸に沿って2.5cmの切開を行い、ラットの皮膚組織を切断します。
- 眼科用鉗子と組織ハサミで皮膚層を筋膜から分離し、上腕二頭筋と外側大腿筋を介して大腿骨への横方向のアプローチを露出させます。
- 2つの筋中隔(白い組織線)の交点を見つけ、大腿骨表面に到達するまで筋肉の境界に沿って使い捨ての外科用ブレードで慎重に分離します。
注意: 使い捨てブレードを使用して筋肉を分離する場合は、筋肉中隔に沿って分離し、軟部組織内で血管損傷を引き起こすことに注意することが重要です。初心者や解剖学に不慣れな人は、2つの筋肉バルクの間の鈍い解剖に眼科用鉗子と骨膜セパレーターを使用する必要があります。
- 骨膜セパレーターを適用して、大腿骨表面の筋肉を鈍く分離し、大腿骨筋幹の中央を露出させます。
- 滅菌マーカーペンを使用して、大腿骨頭の外側1/3斜め頂の上部にある大腿骨骨幹骨幹の中面上の欠損部位の領域をマークします。
- 直径1.2mmのスローモーションボールドリルを備えた口腔低速ハンドピースを使用して、マークされた部位の骨表面に垂直な小さな穴を開け、骨髄腔に達するのに十分な深さで骨膜と骨皮質を破壊します。この穴あけ深さレベルで、この深さに平行な穴のサイズをすべての方向に拡大し、ボックスキャビティ形状になるようにトリミングします。
- 欠陥の端に平行に標識された経口プローブを使用して、調製中および調製後の欠陥の直径と形態を決定します。
- 筋肉層と皮膚層をそれぞれ3-0モノフィラメント吸収性縫合糸で閉じ、手術部位を5%ヨードフォアで内側から外側に消毒します。
3. 術後のケア
- 手術後、カルプロフェン(5 mg / kg)を皮下投与し、麻酔から回復するまでラットを恒温加熱パッドに置きます。.ラットが意識を取り戻したら、乾燥したオートクレーブ入りの寝具が入ったケージにそっと動かします。
- 24時間鎮痛を継続し、手術後1週間は術後モニタリングを継続します。
4. サンプルの収集と分析
- 手術後にラットを人間に安楽死させます ペントバルビタールナトリウム100-200 mg / kgを腹腔内に注射します。大腿骨の表面にある筋肉と筋膜組織を慎重に分離し、手術側の大腿骨を完全に取り除きます。術後0日(図2A、B)、2週間、4週間、および6週間で検体を採取します。
- 大腿骨標本を4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。マイクロコンピュータ断層撮影法を使用して大腿骨の構造を分析します。スキャンパラメータを次のように設定します:X線管電位、70 kVp;フィルター、AL 0.5 mm;X線強度、0.2mA;ボクセルサイズ、17μm;積分時間、1 × 300 ミリ秒。ビットマップデータを使用して3Dモデル画像を再構築します。
- 大腿骨標本を段階的な一連のエタノール希釈で脱水する前に、10% EDTAで標本を8週間脱灰します。次いで、サンプルをパラフィンワックス15に埋め込む。
- 埋め込まれたサンプルを矢状面から5 μmのパラフィン切片にカットします。
- ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色キットとMasson染色キットの両方で切片を染色します。病理組織学による欠損領域の治癒を観察します。
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Representative Results
このプロトコールでは、穴あけにより4.5mm×1.5mmの寸法のラット大腿骨箱腔欠損モデルを確立することに成功しました。治癒過程を解析するために、ラット2の大腿骨外傷の治癒過程における軟骨内骨化、膜内骨化、骨リモデリングのキーポイントである術後0日、2週間後、4週間後、6週間後の手術側の大腿組織を採取しました。術後0日目に、マイクロCTビットマップデータから3Dモデルを再構築したところ、骨髄腔までの深さ4.5 mm x 1.5 mmのサイズで大腿骨の箱腔欠損をモデル化することに成功しました(図3A)。マイクロCTの結果は、モデル作成から2週間後に皮質骨欠損部の間質空間に石灰化した海綿骨形成を示しました(図3B)。欠損部の新しい骨組織の表面は、成熟した高密度の皮質骨を示し、術後4週間で髄側にはまだ海綿骨組織が見られました(図3C)。6週間後、欠損部はほぼ成熟した密集した皮質骨で構成され、髄側付近には少量の海綿骨組織が残っているだけであり、欠損部が基本的に治癒したことを示しています(図3D)。
また、採取した標本をH&E染色とマッソントリクローム染色で分析します(図4)。その結果、術後2週間で欠損部にナイーブな海綿状の骨組織が形成され、欠損部周辺の骨膜が肥厚し、欠損部の新生児海綿骨組織とつながっていることが示された(図4A,A',B,B')。欠損を作成してから4週間後に、緻密な皮質骨組織が欠損領域の表面に形成され、欠損の両側の皮質骨と接続されました。海綿状の骨組織は、髄質側で大きく吸収されました(図4C、C'、D、D')。欠損部には成熟した皮質骨組織が形成され、術後6週間で髄側の海綿骨組織がほぼ完全に吸収され(図4E,E',F,F')、欠損の治癒過程がほぼ完了したことが示された。
図1:欠陥の作成に必要な器具(A)手術器具。(1)電気シェーバー;(2)眼科用鉗子;(3)眼科用ハサミ。(4)使い捨てメス;(5)骨膜セパレーター;(6)経口低速ハンドピース。(7)修正された経口プローブ。(8)使い捨て灌漑用真空。(9)ニードルホルダー;(10)ティッシュハサミ;(11)3.0縫合糸。(B)欠陥直径の寸法でラベル付けされた経口プローブ。滅菌使い捨て経口プローブの大きな湾曲した端には、欠損領域の直径の術中測定のために 1.5 mm と 4.5 mm の目盛りが付けられました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 箱腔欠損(0日目)の形態 (A,B) 術後0日目のサンプルを、箱腔欠損(4.5 mm x 1.2 mm)の作成に使用した改良経口プローブを用いた測定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:欠損部の治癒過程のマイクロCT解析 手術後0日、14日後、28日後、42日後の欠損部の画像を3D再構成。(A)縦方向の平面。(B-D)14日後、28日後、42日後の欠損部の治癒の縦方向(左パネル)、矢状方向(中央)、断面(右パネル)のマイクロCT画像。A、B、C、Dの黄色の破線ボックスは、欠陥領域を表しています。黄色の破線は欠損部のエッジを表し、黄色の矢印は欠損部の新しい骨組織を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.組織病理学的結果。 (A-F)14日、28日、および42日での欠損領域のH&EおよびMasson染色。(A'-F')A-Fに示されている黒い長方形のボックスを拡大した画像。小柱状の石灰化骨組織は、手術後14日で欠損領域に形成されました。皮質骨組織は、手術後28日で欠損領域の表面に形成され、欠損領域の両端に接続されました。手術後42日目に欠損部に成熟した皮質骨組織が形成され、基本的に治癒が完了しました。青い点線は、欠陥のエッジを示します。赤い点線で囲まれた領域は、欠損領域の新しい骨組織です。黒い矢印は肥厚した骨膜です。黄色の三角形は古い皮質の骨です。緑の矢印は新しい小柱状の骨組織です。黒と黄色の星は新しい皮質骨組織です。そして赤い矢印は新しい骨膜です。スケールバー:500μm(AF)、200μm(A '-F ')。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
前臨床動物モデルは、骨の治癒と生体材料が骨再生に及ぼす影響を調べるために不可欠です。このプロトコルは、臨床骨再生に関連する膜内骨形成プロセスを再現する大腿骨箱腔欠損モデルを示しています。欠陥領域は、事前にマークされた経口プローブを使用して術中に標準化されました。マイクロCTおよび病理組織学的染色の結果は、骨膜の肥厚と新しい海綿骨の形成、続いて密集した皮質骨の形成を伴う、6週間にわたる進行性の治癒を示しました。治癒過程で軟骨組織は観察されず、膜内骨形成が示されました。この知見は、臨床的な骨再生における生体材料や薬物の役割を研究するための新たな視点を示しています。
このプロトコルでは、いくつかの要因に細心の注意を払う必要があります: (i) 深い麻酔は、動物の苦痛を防ぎ、正確な欠陥の特定を確保するための前提条件です。麻酔の深さとバイタルサインは注意深く監視する必要があります。(ii)筋肉の分離中は、回復を妨げる可能性のある血管損傷を防ぐために細心の注意を払う必要があります。(iii)欠陥穴を準備する際には、右側の支点を安定させ、常に骨表面に対して垂直に保ち、ボックスの欠陥が同じ深さにあることを確認します。ドリルの深さは、過度に深く入ることなく皮質骨組織を取り除くために制御する必要があります。これにより、骨髄の過度の機械的破壊による骨治癒の遅延を回避し、その結果、間葉系幹細胞(MSC)が除去され、炎症反応が破壊される16。(iv) 空洞の準備では、手術野の視認性を維持しながら、骨アブレーション中の熱によって引き起こされる潜在的な組織損傷を軽減するために、助手が生理食塩水で領域を継続的に洗浄する必要があります。
骨折モデル、分節性骨欠損モデル、および頭蓋骨欠損モデルは、骨再生の研究に一般的に使用される動物モデルです。骨折モデルは、実際の外傷の過程を反映しているが、実験動物間の骨折断面積の違いにより、結果は異なる可能性がある17。分節骨欠損モデルは、癒合不全や治癒の遅延などの骨折合併症を効果的にシミュレートします。その解剖学的位置により、このモデルは、X線撮影または組織学的方法18を通じて、新しい骨形成および血行再建術の評価を容易にする。ただし、この方法では、被験者間で欠陥サイズにかなりのばらつきがあります。スプリント固定または金属インプラントによる内部固定の要件も、その適用を制限します11。calvarial欠損モデルは、内部固定がなく、サイズと解剖学的位置の高い再現性、および安定した機械的環境14によって特徴付けられ、これはまた、移植された材料13の生理学的、生体力学的負荷に対する生物学的応答を評価する際の適用を制限する。さらに、移植骨がない場合、硬膜とその上にある軟組織による欠損の侵入は骨の再生を妨げる可能性があり、これらのモデルは足場材料18の性能に敏感になる。したがって、このプロトコルは、ラット大腿骨骨幹における箱腔欠損の確立を提案し、これにより、簡単なツール18を使用して欠損直径の術中測定が可能になる。このアプローチでは、骨折またはセグメント欠陥モデルよりも欠陥の標準化をより適切に制御でき、内部または外部固定の必要性がなくなります。さらに、このモデルは、軟部組織の侵食による骨形成の障害に対して堅牢です。このプロトコルは、しかし、特定の制限を提示します:(i)不適切な実行または過度の欠陥直径は、ラットで重度の出血、ショック、またはさらには死亡につながる可能性があります。したがって、動物の安全と福祉を確保するためには、生きている被験者に対して手順を実行する前に、ラットの死体を練習することが不可欠です。(ii)さらに、げっ歯類の皮質19 にハバーシアンシステムが存在しないため、ヒトの骨折/欠損の自然な臨床的治癒過程を完全に再現することは困難である。ネズミは、げっ歯類として、費用対効果が高く、最小限のメンテナンスを必要とし、安全で取り扱いが容易で、ウサギ、イヌ、ヤギなどの大型動物よりも高い再現性を提供する20。
要約すると、ラット大腿骨骨幹骨幹箱腔欠損モデルを開発し、マイクロCTおよび病理組織学的染色技術を使用して治癒過程を追跡しました。このプロトコルは、臨床的に重要な骨再生モデル内の膜内骨形成を精査するための包括的で一般化可能な方法を提供します。さらに、代替生体材料、骨再生関連薬、足場などの生物学的性能評価のための革新的な視点を提案します。また、骨組織工学のための新たな治療戦略の前臨床検証も容易になります。
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Disclosures
この論文には、すべての元のデータと画像が含まれています。著者は利益相反を宣言しません
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会 82101000 (H. W.)、U21A20368 (L. Y.)、82100982 (F. L.) からの助成金を受け、Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.) の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
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