Summary
Burada, sıçan femoral diyafiz dokusunda kutu boşluğu defekti oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu model, biyomekanik stres altında biyomalzeme performansını değerlendirebilir ve intramembranöz osteogenez ile ilgili kemik rejenerasyon mekanizmalarını keşfedebilir.
Abstract
Ciddi kemik kusurları veya karmaşık kırıklar, kaynamama veya yetersiz kemik iyileşmesi gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilir. Hücrelerin, yapı iskelelerinin ve sitokinlerin uygulanmasını içeren doku mühendisliği, kemik rejenerasyonu için umut verici bir çözüm olarak kabul edilir. Sonuç olarak, kemik kusurlarını simüle eden çeşitli hayvan modelleri, kemik iyileşmesi için doku mühendisliğinin terapötik potansiyelini keşfetmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada, sıçanların orta uyluk kemiğinde, kemik iyileşmesini teşvik etmede biyomalzemelerin işlevini değerlendirmek için ideal bir model olarak hizmet edebilecek kutu şeklinde bir kortikal kemik defekti modeli oluşturduk. Bu kutu şeklindeki kortikal kemik defekti, oral düşük hızlı bir el aleti kullanılarak delindi ve bir torna iğnesi ile şekillendirildi. Kutu boşluklu kortikal kemik defektinin başarılı bir şekilde kurulduğunu doğrulamak için ameliyat sonrası mikro-BT analizi hemen yapıldı. Sıçanların ameliyat edilen tarafındaki femurlar daha sonra ameliyattan sonra birden fazla zaman noktasında (0 gün, 2 hafta, 4 hafta ve 6 hafta) toplandı. Her örneğin defekt alanının iyileşme süreci mikro-BT, hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ve Masson trikrom boyaması kullanılarak değerlendirildi. Bu sonuçlar, intramembranöz ossifikasyon ile tutarlı bir iyileşme paterni gösterdi ve iyileşme esasen 6 hafta boyunca tamamlandı. Bu hayvan modelinin iyileşme sürecinin sınıflandırılması, kemik dokusu defektinin iyileşmesi sırasında intramembranöz ossifikasyonu hedefleyen yeni biyomateryallerin ve ilaçların araştırılması için etkili bir in vivo yöntem sağlar.
Introduction
Kırık ve kusurlu kemik sıklıkla travma, tümörler, iltihaplanma ve konjenital malformasyonlardan kaynaklanır 1,2. Genç sağlıklı bireylerde kemik dokusu tipik olarak güçlü rejeneratif yetenekleresahip olsa da 3, kritik bir boyutu aşan kusurlar veya sistemik hastalıklara (örneğin diyabet, osteoporoz ve enfeksiyonlar) bağlı iyileşme engelleri yine de kemik süreksizliği veya iyileşme bozukluğu gibi komplikasyonlara yol açabilir4. Bu klinik zorluğun üstesinden gelmek için, kemik grefti veya biyomateryaller, ciddi şekilde kusurlu kemiği değiştirmek veya büyük kemik segmentlerini yeniden yapılandırmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu tedavilerin sınırlamaları vardır. Örneğin, altın standart olarak kabul edilmesine rağmen, otolog kemik grefti, sınırlı donör tedariki ve potansiyel donör bölgesi komplikasyonlarından muzdariptir 5,6. Allogreftler ayrıca bağışıklık aracılı redd, hastalıkların potansiyel iletimi ve greftinbiyomekanik ve biyolojik özellikleri üzerindeki olumsuz etkiler gibi belirli riskler de sunar 7.
Son yıllarda, kemik defekti iyileşme mekanizmalarına odaklanan araştırmalarda bir artışa tanık olunmuştur. Alternatif biyomalzemelerin kullanımı ve doku mühendisliğindeki gelişmeler, kemikrejenerasyonu alanında öne çıkan konular olarak ortaya çıkmıştır8. Bu biyomateryaller insan tedavisine uygulanmadan önce, etkinliklerini ve güvenliklerini sağlamak için in vitro ve in vivo olarak test edilmelidirler. Bununla birlikte, in vitro ortamların karmaşıklığının azalması ve immün ve inflamatuar yanıtların olmaması, çeşitli biyomateryallerin in vitro olarak değerlendirilmesini sınırlamaktadır. Sonuç olarak, çeşitli kemik dokusu defektleri için hayvan modellerinin oluşturulmasına ihtiyaç duyulmaktadır9. Hayvan modelleri, biyomalzemelerin farklı yükleme koşulları altında değerlendirilmesine izin verir, türe özgü kemik özelliklerinin anlaşılmasını kolaylaştırır ve hayvan modelleri ile insan klinik durumları arasındaki benzerlik hakkında fikir verir. Bu avantajlar, kemik-iskele etkileşimlerini incelemek ve araştırma bulgularını klinik uygulamaya dönüştürmek için gereklidir 9,10.
Şu anda, mekanik kemik defekti hayvan modelleri, kranial kemik defekti modelleri ve segmental kemik defekti modelleri en yaygın olarak uygulanan yöntemler olmak üzere, biyomalzemelerin performansını doğrulamak için yaygın olarak kullanılmaktadır11. Sıklıkla kemik kaynamaması ile sonlanan şiddetli uzun kemik veya tibia travmasını taklit etmek için kullanılan segmental kemik defekti modelleri, tek tip boyutları ve tanımlanmış anatomik pozisyonları, yeni kemik oluşumu ve revaskülarizasyonun radyolojik veya histolojik değerlendirmelerini basitleştirmeleri nedeniyle avantajlıdır. Bununla birlikte, bu modeller bilateral kırık segmentlerini stabilize etmek için metal implantlar gerektirir ve hem endokondral hem de intramembranöz ossifikasyonu içeren karmaşık bir iyileşme süreci gerektirir12. Öte yandan, kalvarial kemik defekti modelleri, standardize defekt çapları, uygun cerrahi erişimleri ve dura mater ve yumuşak dokuyu destekleyici işlevleri nedeniyle biyomateryallerin değerlendirilmesinde birincil tarama aracı haline gelmiştir13. Klinik olarak ilgili senaryolarda intramembranöz kemik oluşumunu modellemek için yaygın olarak kullanılmalarına rağmen, iyileşme sürecinde yük taşımayan yapıları nedeniyle biyomekanik yükleme koşulları altında kemik iyileşmesini değerlendirmek için uygun değildirler14.
Bu sınırlamaları ele almak için, sıçanların femoral diyafiz dokusunda bir kutu boşluklu kortikal kemik defekti modeli oluşturduk. Mikro bilgisayarlı tomografi (BT), üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon ve histopatolojik boyama (Hematoksilen ve eozin [HE] ve Masson) kullanarak, bu modelin hemostaz koşulları altında iyileşme sürecini analiz ettik. Biyomekanik yükleme koşulları altında biyomalzeme performansını değerlendirmek ve intramembranöz ossifikasyona karşı kemik rejenerasyonunun biyomühendislik ve mekanizmasını incelemek için yeni bilgiler sunmayı amaçlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu Etik Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (WCHSIRB-D-2021-597). Bu çalışma için Sprague-Dawley cinsi sıçanlar (erkek, vücut ağırlığı 300 g) kullanıldı.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- Enstrüman hazırlığı
- Bu çalışmada kullanılan cerrahi aletler için Şekil 1A'ya bakın: elektrikli tıraş makinesi, doku makası, oftalmik makas, oftalmik forseps, tek kullanımlık neşter, periosteal ayırıcı, oral düşük hızlı el aleti, oral prob, tek kullanımlık irrigasyon vaku, iğne tutucu, 3.0 sütür.
- Oral bir prob hazırlayın ve probun büyük kavisli ucunu kusurun çapına göre bir işaretleyici kalemle işaretleyin (Şekil 1B). Ameliyat sırasında kusurun boyutunu belirlemek için bunu kullanın.
- Kullanmadan önce prosedürü gerçekleştirmek için kullanılan tüm cerrahi malzemeleri ve aletleri sterilize edin. İstenilen malzemeleri katlanmış bir bez veya ambalaj kağıdına koyun ve buhar sterilizasyonu için otoklav bandı ile kapatın (20-25 dakika boyunca 125-135 ° C).
- Cerrahi alan hazırlığı: Ameliyat masasını ve masanın etrafındaki ortamı %75 alkol püskürterek dezenfekte edin. Ameliyat masasında otoklavlanmış örtüler ile yaklaşık 60 cm x 90 cm steril bir alan oluşturun.
- Anestezi hazırlığı
- Sıçanları intraperitoneal olarak %10 ketamin hidroklorür (50-100 mg/kg) ve %2 ksilazin 2 mg/kg) ile anestezikleştirin. Preoperatif ve intraoperatif analjezi için deri altı carprofen (5 mg / kg) enjeksiyonu kullanın. Anestezi derinliğini ayak parmağı sıkışma testi ile inceleyin. Anesteziden sonra, kuru gözleri ve kornea yaralanmasını önlemek için gözlere steril göz merhemi sürün.
2. Cerrahi prosedür
- Fareyi steril cerrahi masaya yanal yaslanma pozisyonuna getirin ve alt ekstremite tüylerini elektrikli bir tıraş makinesi ile alın.
- Cerrahi bölgedeki cilt dokusunu dezenfekte etmek için %5 iyodofor solüsyonu ve %75 alkol kullanın.
- Proksimal ve distal uyluk kemiğini bulun ve sıçanın cilt dokusunu kesmek için uyluk kemiğinin uzun ekseni boyunca 2,5 cm'lik bir kesi yapın.
- Oftalmik forseps ve doku makası ile cilt tabakasını fasyadan ayırın ve pazı femoris ve lateral femoral kaslar yoluyla femura lateral yaklaşımı ortaya çıkarın.
- İki kas septasının (beyaz doku çizgisi) kesişimini bulun ve femur yüzeyine ulaşılana kadar kas sınırı boyunca tek kullanımlık bir cerrahi bıçakla dikkatlice ayırın.
NOT: Kası ayırmak için tek kullanımlık bir bıçak kullanırken, kas septumu boyunca ayırmak ve yumuşak doku içinde vasküler yaralanmaya neden olmamak için dikkatli olmak önemlidir. Yeni başlayanlar ve anatomiye aşina olmayanlar, iki kas kütlesi arasındaki künt diseksiyonda oftalmik forseps ve periosteal ayırıcılar kullanmalıdır.
- Femoral yüzey kaslarını künt bir şekilde ayırmak ve femoral diyafizin ortasını ortaya çıkarmak için bir periosteal ayırıcı uygulayın.
- Femur başının lateral 1/3 eğik tepesinin üst kısmında bulunan femur diyafizinin orta yüzeyindeki kusur bölgesinin alanını işaretlemek için steril bir işaretleyici kalem kullanın.
- İşaretli bölgede kemik yüzeyine dik küçük bir delik açmak için 1,2 mm çapında yavaş hareket eden bilyalı matkapla oral düşük hızlı el aletini kullanın, periost ve kemik korteksini kemik iliği boşluğuna ulaşacak kadar derin bir derinlikle yok edin. Bu delme derinliği seviyesinde, bu derinliğe paralel olarak deliğin boyutunu her yöne genişletin ve bir kutu boşluğu şekli elde etmek için düzeltin.
- Hazırlık sırasında ve sonrasında defekt çapını ve morfolojisini belirlemek için defektin kenarına paralel etiketli bir oral prob kullanın.
- Kas ve cilt tabakalarını sırasıyla 3-0 monofilament emilebilir dikişlerle kapatın ve cerrahi bölgeyi içten dışa %5 iyodofor ile dezenfekte edin.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Ameliyattan sonra, carprofen'i (5 mg / kg) deri altından uygulayın ve fareyi anesteziden iyileşene kadar sabit sıcaklıkta bir ısıtma yastığına koyun. Sıçan bilincini geri kazandığında, yavaşça kuru, otoklavlanmış yatak takımları içeren bir kafese taşıyın.
- Ameliyattan sonra 24 saat analjeziye ve 1 hafta boyunca ameliyat sonrası izlemeye devam edin.
4. Numune toplama ve analiz
- Ameliyattan sonra intraperitoneal olarak pentobarbital sodyum 100-200 mg / kg enjekte ederek sıçanı insan olarak ötenazi yapın. Femurun yüzeyindeki kas ve fasyal dokuyu dikkatlice ayırın ve ameliyat edilen taraftaki uyluk kemiğini tamamen çıkarın. Ameliyat sonrası 0 gün (Şekil 2A, B), 2 hafta, 4 hafta ve 6 hafta sonra örnekleri toplayın.
- Femoral örnekleri 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Mikro bilgisayarlı tomografi kullanarak femora'nın yapısını analiz edin. Tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: X-ışını tüpü potansiyeli, 70 kVp; filtre, AL 0,5 mm; X-ışını yoğunluğu, 0.2 mA; voksel boyutu, 17 μm; ve entegrasyon süresi, 1 × 300 ms. Bitmap verilerini kullanarak 3B model görüntülerini yeniden oluşturun.
- Femoral örnekleri kademeli bir dizi etanol seyreltmesinde dehidre etmeden önce örnekleri 8 hafta boyunca% 10 EDTA'da kireçten arındırın. Ardından, numuneleri parafin mumu15'e gömün.
- Gömülü numuneleri sagital düzlemden 5 μm parafin kesitlerine kesin.
- Hem hematoksilen hem de eozin (H & E) boyama kiti ve bir Masson boyama kiti ile bölümleri boyayın. Histopatoloji ile defekt alanının iyileşmesini gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, delme işlemi ile 4,5 mm x 1,5 mm boyutlarında bir sıçan femur kutu boşluğu defekt modelini başarıyla kuruyoruz. İyileşme sürecini analiz etmek için, sıçanlarda femoral travmanın iyileşme sürecinde endokondral ossifikasyon, intramembranöz ossifikasyon ve kemik yeniden şekillenmesinin kilit zaman noktaları olan ameliyattan 0 gün, 2 hafta, 4 hafta ve 6 hafta sonra ameliyat edilen taraftaki femur dokusunu topladık2. Ameliyat sonrası 0. günde, mikro-BT bitmap verilerinden 3D modelin rekonstrüksiyonu, uyluk kemiğinde ilik boşluğuna kadar 4,5 mm x 1,5 mm derinliğinde bir kutu boşluğu defektini başarıyla modellediğimizi gösterdi (Şekil 3A). Mikro-BT sonuçları, model oluşturulduktan 2 hafta sonra kortikal kemik defektinin interstisyel boşluğunda mineralize trabeküler kemik oluşumunu gösterdi (Şekil 3B). Defekt alanındaki yeni kemik dokusunun yüzeyinde matürv, yoğun kortikal kemik görüldü ve trabeküler kemik dokusu ameliyattan 4 hafta sonra medüller tarafta hala görülebiliyordu (Şekil 3C). 6 hafta sonra, defekt alanı neredeyse olgun, yoğun kortikal kemikten oluşuyordu ve medüller tarafın yakınında sadece az miktarda trabeküler kemik dokusu kalmıştı, bu da defekt alanının temelde iyileştiğini gösteriyordu (Şekil 3D).
Toplanan örnekleri ayrıca H&E boyama ve Masson trikrom boyama ile analiz ediyoruz (Şekil 4). Sonuçlar, ameliyat sonrası 2 hafta içinde defekt bölgesinde naif trabeküler benzeri kemik dokusu oluştuğunu ve defekt alanı etrafındaki periostun kalınlaştığını ve defekt alanındaki yenidoğan trabeküler kemik dokusu ile bağlantılı olduğunu gösterdi (Şekil 4A,A',B,B'). Defekt oluşturulduktan 4 hafta sonra, defekt alanının yüzeyinde yoğun kortikal kemik dokusu oluştu ve defektin her iki tarafında kortikal kemik ile bağlandı; trabeküler benzeri kemik dokusu medüller tarafta yoğun olarak rezorbe idi (Şekil 4C,C',D,D'). Defekt bölgesinde matür kortikal kemik dokusu oluşmuştu ve ameliyat sonrası 6 hafta sonra medüller taraftaki trabeküler kemik dokusu neredeyse tamamen rezorbe olmuştu (Şekil 4E,E',F,F'), bu da defektin iyileşme sürecinin neredeyse tamamlandığını gösteriyordu.
Şekil 1: Kusur oluşturmak için gerekli araçlar. (A) Cerrahi aletler. (1) Elektrikli tıraş makinesi; (2) Oftalmik forseps; (3) Oftalmik makas; (4) Tek kullanımlık neşter; (5) Periosteal ayırıcı; (6) Oral düşük hızlı el aleti; (7) Modifiye oral sonda; (8) Tek kullanımlık sulama vakumu; (9) İğne tutucu; (10) Mendil makası; (11) 3.0 dikiş. (B) Kusur çapının boyutları ile etiketlenmiş oral problar. Steril tek kullanımlık oral probun büyük kavisli ucu, defekt alanının çapının intraoperatif ölçümü için 1.5 mm ve 4.5 mm'lik bir ölçekle işaretlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kutu boşluğu defektinin morfolojisi (Gün 0). (A,B) Kutu boşluğu defektini (4,5 mm x 1,2 mm) oluşturmak için kullanılan modifiye edilmiş bir oral prob kullanılarak ameliyat sonrası 0. gün örneklerinin ölçümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Defekt alanının iyileşme sürecinin mikro-BT analizi. Ameliyattan 0 gün, 14 gün, 28 gün ve 42 gün sonra defekt alanının 3D yeniden yapılandırılmış görüntüleri. (A) Boyuna düzlem . (B-D) Uzunlamasına (sol panel), sagital (orta) ve kesitsel (sağ panel) mikro-BT görüntüleri 14 gün, 28 gün ve 42 günlük defekt bölgesinin iyileşmesi. A, B, C ve D'deki sarı kesikli kutu, kusur alanını temsil eder. Sarı kesikli çizgi, defektin kenarlarını temsil eder ve sarı ok, defekt alanındaki yeni kemik dokusunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Histopatolojik sonuçlar. (A-F) Defekt bölgesinin 14 gün, 28 gün ve 42 günde H&E ve Masson boyanması. (A'-F') A-F ile gösterilen siyah dikdörtgen kutuların yakınlaştırılmış görüntüleri. Ameliyattan 14 gün sonra defekt bölgesinde trabeküler benzeri mineralize kemik dokusu oluştu; ameliyattan 28 gün sonra defekt alanının yüzeyinde kortikal kemik dokusu oluşturuldu ve defekt alanının her iki ucuna bağlandı; Ameliyattan 42 gün sonra defekt bölgesinde matür kortikal kemik dokusu oluşturuldu ve iyileşme temel olarak tamamlandı. Mavi noktalı çizgi, kusurun kenarını gösterir; Kırmızı noktalı çizginin çevrelediği alan, defekt alanındaki yeni kemik dokusudur; siyah ok, kalınlaşmış periosteumdur; sarı üçgen eski kortikal kemiktir; Yeşil ok, yeni trabeküler benzeri kemik dokusudur; Siyah ve sarı yıldızlar yeni kortikal kemik dokusudur; Ve kırmızı ok yeni periosteum. Ölçek çubukları: 500 μm (A-F), 200 μm (A'-F'). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinik öncesi hayvan modelleri, kemik iyileşmesini ve biyomalzemelerin kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisini incelemek için hayati öneme sahiptir. Bu protokol, klinik kemik rejenerasyonu ile ilişkili intramembranöz kemik oluşum sürecini kopyalayan bir femur kutu boşluğu defekt modelini göstermektedir. Defekt alanı, önceden işaretlenmiş bir oral prob kullanılarak intraoperatif olarak standardize edildi. Mikro-BT ve histopatolojik boyama sonuçları, kalınlaşmış periost ve yeni trabeküler kemik oluşumu ile 6 hafta boyunca ilerleyici iyileşme ve ardından yoğun kortikal kemik oluşumu gösterdi. İyileşme sürecinde herhangi bir kıkırdak dokusu gözlenmedi, bu da intramembranöz osteogenezi gösteriyor. Bu bulgu, klinik kemik rejenerasyonunda biyomalzemelerin veya ilaçların rolünü incelemek için yeni bakış açıları sunmaktadır.
Bu protokol birkaç faktöre dikkat edilmesini gerektirir: (i) Derin anestezi, hayvan sıkıntısını önlemek ve doğru defekt lokalizasyonunu sağlamak için bir ön koşuldur. Anestezi derinliği ve yaşamsal belirtiler dikkatli bir şekilde izlenmelidir. (ii) Kas ayrılması sırasında, iyileşmeyi engelleyebilecek vasküler yaralanmayı önlemek için titiz bir dikkat gösterilmelidir. (iii) Defekt deliğini hazırlarken, kutu defektinin aynı derinlikte olduğundan emin olmak için sağ dayanak noktasını sabit ve her zaman kemik yüzeyine dik tutun. Aşırı derine inmeden kortikal kemik dokusunu çıkarmak için matkap derinliği kontrol edilmelidir. Bu, kemik iliğinin aşırı mekanik yıkımı nedeniyle kemik iyileşmesinin gecikmesini önler, bu da mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) uzaklaştırılmasına ve inflamatuar yanıtın bozulmasına neden olur16. (iv) Kavite hazırlığı, cerrahi alanın görünürlüğünü korurken kemik ablasyonu sırasında ısının neden olduğu potansiyel doku hasarını azaltmak için alanı sürekli olarak tuzlu su ile sulamak için bir asistan gerektirir.
Kemik kırığı, segmental kemik defekti ve kranial kemik defekti modelleri, kemik rejenerasyonunun araştırılmasında yaygın olarak kullanılan hayvan modelleridir. Kemik kırığı modeli, gerçek travma sürecini yansıtır, ancak sonuçlar, deney hayvanları arasındaki kırık kesitlerindeki farklılıklar nedeniyle değişebilir17. Segmental kemik defekti modeli, kaynamama veya gecikmiş iyileşme gibi kırık komplikasyonlarını etkili bir şekilde simüle eder. Anatomik konumlandırması nedeniyle bu model, radyografik veya histolojik yöntemlerle yeni kemik oluşumunun ve revaskülarizasyonun değerlendirilmesini kolaylaştırır18. Bununla birlikte, bu yöntem, denekler arasında kusur boyutunda önemli farklılıklar gösterir; Splint fiksasyonu veya metal implantlarla internal fiksasyon gerekliliği de uygulamasını sınırlar11. Kalvarial defekt modeli, iç fiksasyon olmaması, boyut ve anatomik pozisyonda yüksek tekrarlanabilirlik ve stabil bir mekanik ortam14 ile karakterize edilir, bu da implante edilen materyalin13 fizyolojik, biyomekanik yüklenmesine biyolojik tepkinin değerlendirilmesinde uygulamayı kısıtlar. Ayrıca, bir greft kemiğinin yokluğunda, defektin dura mater ve üstteki yumuşak doku tarafından istila edilmesi, kemik yenilenmesini engelleyebilir ve bu modelleri iskele malzemesinin performansına duyarlı hale getirir18. Bu nedenle, bu protokol, sıçan femoral diyafizinde, basit bir alet18 kullanılarak defekt çapının intraoperatif ölçümüne izin veren bir kutu boşluğu defektinin kurulmasını önermektedir. Bu yaklaşım, defekt standardizasyonu üzerinde kırık veya segmental defekt modellerine göre daha iyi kontrol sağlar ve iç veya dış fiksasyon ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, bu model yumuşak doku erozyonu nedeniyle kemik oluşumunun bozulmasına karşı dayanıklıdır. Bununla birlikte, bu protokol bazı sınırlamalar sunar: (i) Yanlış uygulama veya aşırı kusur çapları, sıçanlarda ciddi kanama, şok ve hatta ölüme neden olabilir. Bu nedenle, hayvanların güvenliğini ve refahını sağlamak için, canlı denekler üzerinde prosedürü gerçekleştirmeden önce sıçan kadavralarının uygulanması zorunludur. (ii) Ayrıca, kemirgen korteksi19'da Haversian sisteminin olmaması, insan kemiği kırığının/defektinin doğal klinik iyileşme sürecini tamamen yeniden üretmeyi zorlaştırır. Sıçanlar, kemirgenler olarak, uygun maliyetlidir, minimum bakım gerektirir ve güvenli ve kullanımı kolaydır, tavşanlar, köpekler ve keçiler gibi daha büyük hayvanlardan daha yüksek tekrarlanabilirlik sağlar20.
Özetle, sıçan femoral diyafiz kutu kavite defekti modeli geliştirdik ve mikro-BT ve histopatolojik boyama tekniklerini kullanarak iyileşme sürecini izledik. Bu protokol, klinik olarak anlamlı kemik rejenerasyon modelleri içinde intramembranöz kemik oluşumunu incelemek için kapsamlı ve genelleştirilebilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, ikame biyomalzemelerin, kemik rejenerasyonu ile ilişkili ilaçların, iskelelerin vb. biyolojik performans değerlendirmesi için yenilikçi bakış açıları önermektedir. Ayrıca kemik dokusu mühendisliği için acil terapötik stratejilerin klinik öncesi doğrulanmasını kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm orijinal veriler ve görüntüler bu belgeye dahil edilmiştir. Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı 82101000 (HW), U21A20368 (LY) ve 82100982 (FL) tarafından finanse edildi ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı 2023NSFSC1499 (HW) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193 (2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66 (2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084 (2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977 (2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
