Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de um defeito em cavidade em caixa em tecido de diáfise femoral de ratos. Este modelo pode avaliar o desempenho do biomaterial sob estresse biomecânico e explorar mecanismos de regeneração óssea relacionados à osteogênese intramembranosa.
Abstract
Defeitos ósseos graves ou fraturas complexas podem resultar em complicações graves, como não consolidação ou cicatrização óssea insuficiente. A engenharia de tecidos, que envolve a aplicação de células, scaffolds e citocinas, é considerada uma solução promissora para a regeneração óssea. Consequentemente, vários modelos animais que simulam defeitos ósseos desempenham um papel crucial na exploração do potencial terapêutico da engenharia de tecidos para a cicatrização óssea. Neste estudo, estabelecemos um modelo de defeito ósseo cortical em forma de caixa no fêmur médio de ratos, que poderia servir como um modelo ideal para avaliar a função dos biomateriais na promoção da cicatrização óssea. Este defeito ósseo cortical em forma de caixa foi perfurado com uma peça de mão oral de baixa velocidade e moldado por uma agulha de torno. A análise de micro-TC pós-operatória foi imediatamente realizada para confirmar o estabelecimento bem-sucedido do defeito ósseo cortical da cavidade em caixa. Os fêmures do lado operado dos ratos foram então colhidos em vários momentos pós-operatórios (0 dias, 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas). O processo de cicatrização da área de defeito de cada amostra foi avaliado por meio de micro-CT, coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrômica de Masson. Esses resultados demonstraram um padrão de cicatrização consistente com ossificação intramembranosa, com cicatrização essencialmente completa em 6 semanas. A categorização do processo de cicatrização deste modelo animal fornece um método in vivo eficaz para investigar novos biomateriais e medicamentos que visam a ossificação intramembranosa durante a cicatrização de defeitos do tecido ósseo.
Introduction
O osso fraturado e defeituoso geralmente resulta de trauma, tumores, inflamação e malformações congênitas 1,2. Embora o tecido ósseo em indivíduos jovens e saudáveis normalmente possua habilidades regenerativas robustas3, defeitos que excedem um tamanho crítico ou impedimentos de cicatrização devido a doenças sistêmicas (por exemplo, diabetes, osteoporose e infecções) ainda podem levar a complicações como descontinuidade óssea ou cicatrização prejudicada4. Para enfrentar esse desafio clínico, enxerto ósseo ou biomateriais são comumente usados para substituir osso gravemente defeituoso ou para reconstruir grandes segmentos ósseos. No entanto, esses tratamentos têm limitações. Por exemplo, embora considerado o padrão-ouro, o enxerto ósseo autólogo sofre de oferta restrita de doadores e possíveis complicações no local doador 5,6. Os aloenxertos também apresentam certos riscos, como rejeição imunomediada, potencial transmissão de doenças e impactos negativos nas propriedades biomecânicas e biológicas do enxerto7.
Nos últimos anos, houve um aumento nas pesquisas com foco nos mecanismos de cicatrização de defeitos ósseos. O uso de biomateriais alternativos e os avanços na engenharia de tecidos têm emergido como tópicos proeminentes no domínio da regeneração óssea8. Antes que esses biomateriais possam ser aplicados à terapia humana, eles devem ser testados in vitro e in vivo para garantir sua eficácia e segurança. No entanto, a reduzida complexidade dos ambientes in vitro e a ausência de respostas imunes e inflamatórias limitam a avaliação de vários biomateriais in vitro. Consequentemente, é necessário o estabelecimento de modelos animais para vários tipos de defeitos do tecido ósseo9. Os modelos animais permitem a avaliação de biomateriais sob diferentes condições de carga, facilitam a compreensão das características ósseas específicas da espécie e fornecem informações sobre a semelhança entre modelos animais e situações clínicas humanas. Essas vantagens são essenciais para estudar as interações osso-andaime e traduzir os resultados da pesquisa para a prática clínica 9,10.
Atualmente, modelos animais de defeitos ósseos mecânicos são amplamente utilizados para validar o desempenho de biomateriais, sendo os modelos de defeitos ósseos cranianos e os modelos de defeitos ósseos segmentares os métodos mais comumenteaplicados11. Modelos de defeitos ósseos segmentares, frequentemente utilizados para mimetizar trauma grave de ossos longos ou tibiais que terminam em pseudoartrose óssea, são vantajosos devido às suas dimensões uniformes e posições anatômicas definidas, simplificando as avaliações radiológicas ou histológicas da nova formação óssea e revascularização. No entanto, esses modelos requerem implantes metálicos para estabilizar segmentos de fratura bilaterais e necessitam de um complexo processo de cicatrização envolvendo ossificação endocondral e intramembranosa12. Por outro lado, os modelos de defeitos ósseos da calvária tornaram-se uma ferramenta primária de triagem para avaliar biomateriais devido aos seus diâmetros de defeito padronizados, acesso cirúrgico conveniente e função de suporte da dura-máter e dos tecidos moles13. Embora sejam amplamente utilizados para modelar a formação óssea intramembranosa em cenários clinicamente relevantes, eles são inadequados para avaliar a cicatrização óssea em condições de carga biomecânica devido à sua natureza não suportadora de carga durante o processo de cicatrização14.
Para resolver essas limitações, estabelecemos um modelo de defeito ósseo cortical em cavidade em caixa no tecido da diáfise femoral de ratos. Utilizando microtomografia computadorizada (TC), reconstrução tridimensional (3D) e coloração histopatológica (Hematoxilina e eosina [HE] e Masson), analisamos o processo de cicatrização desse modelo em condições de hemostasia. Nosso objetivo é oferecer novos insights para avaliar o desempenho do biomaterial sob condições de carga biomecânica e para estudar a bioengenharia e o mecanismo de regeneração óssea vis-à-vis a ossificação intramembranosa.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Ratos Sprague-Dawley (machos, peso corporal 300 g) foram utilizados para o presente estudo.
1. Preparação pré-cirúrgica
- Preparação do instrumento
- Consulte a Figura 1A para os instrumentos cirúrgicos utilizados neste estudo: barbeador elétrico, tesoura de tecido, tesoura oftálmica, pinça oftálmica, bisturi descartável, separador de periósteo, peça de mão oral de baixa rotação, sonda oral, aspirador de irrigação descartável, porta-agulha, sutura 3.0.
- Prepare uma sonda oral e marque a extremidade curva grande da sonda com uma caneta marcadora de acordo com o diâmetro do defeito (Figura 1B). Use isso para determinar o tamanho do defeito durante a cirurgia.
- Esterilize todos os materiais e instrumentos cirúrgicos usados para realizar o procedimento antes de usar. Embale os materiais desejados em pano dobrado ou papel de embrulho e sele-os com fita de autoclave para esterilização a vapor (125-135°C por 20-25 min).
- Preparação da área cirúrgica: Desinfete a mesa cirúrgica e o ambiente ao redor da mesa pulverizando com álcool 75%. Crie uma área estéril de aproximadamente 60 cm x 90 cm com cortinas autoclavadas na mesa de operação.
- Preparação da anestesia
- Anestesiar os ratos por via intraperitoneal com cloridrato de cetamina a 10% (50-100 mg/kg) e xilazina a 2% (2 mg/kg). Use injeção subcutânea de carprofeno (5 mg / kg) para analgesia pré e intraoperatória. Examine a profundidade da anestesia pelo teste de pinça do dedo do pé. Após a anestesia, aplique pomada estéril nos olhos para evitar olhos secos e lesões na córnea.
2. Procedimento cirúrgico
- Coloque o rato em posição de decúbito lateral na mesa cirúrgica estéril e remova os pelos dos membros inferiores com um barbeador elétrico.
- Use solução de iodóforo a 5% e álcool a 75% para desinfetar o tecido cutâneo na área cirúrgica.
- Localize o fêmur proximal e distal e faça uma incisão de 2,5 cm ao longo do longo eixo do fêmur para cortar o tecido da pele do rato.
- Separe a camada de pele da fáscia com pinça oftálmica e tesoura de tecido e exponha a abordagem lateral do fêmur através dos músculos bíceps femoral e femoral lateral.
- Localize a interseção dos dois septos musculares (uma linha de tecido branco) e separe cuidadosamente com uma lâmina cirúrgica descartável ao longo da borda do músculo até que a superfície femoral seja alcançada.
NOTA: Ao usar uma lâmina descartável para separar o músculo, é importante separar ao longo do septo muscular e ter cuidado para não causar lesões vasculares nos tecidos moles. Iniciantes e não familiarizados com a anatomia devem usar pinças oftálmicas e separadores periósteis na dissecção romba entre os dois volumes musculares.
- Aplique um separador periosteal para separar sem rodeios os músculos da superfície femoral e expor o meio da diáfise femoral.
- Use uma caneta marcadora estéril para marcar a área do local do defeito na superfície média da diáfise femoral, localizada na parte superior da crista oblíqua lateral de 1/3 da cabeça femoral.
- Use a peça de mão oral de baixa velocidade com uma broca esférica em câmera lenta de 1,2 mm de diâmetro para fazer um pequeno orifício perpendicular à superfície óssea no local marcado, destruindo o periósteo e o córtex ósseo com uma profundidade profunda o suficiente para alcançar a cavidade da medula óssea. Nesse nível de profundidade de perfuração, expanda o tamanho do furo paralelo a essa profundidade em todas as direções, aparando para obter uma forma de cavidade em caixa.
- Use uma sonda oral marcada paralela à borda do defeito para determinar o diâmetro e a morfologia do defeito durante e após a preparação.
- Feche as camadas muscular e cutânea com pontos absorvíveis de monofilamento 3-0, respectivamente, e desinfete a área cirúrgica com iodóforo a 5% de dentro para fora.
3. Cuidados pós-operatórios
- Após a cirurgia, administrar carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea e colocar o rato em uma almofada de aquecimento de temperatura constante até a recuperação da anestesia. Quando o rato recuperar a consciência, mova-o suavemente para uma gaiola que contenha roupas de cama secas e autoclavadas.
- Continuar a analgesia por 24 h e o monitoramento pós-operatório por 1 semana após a cirurgia.
4. Coleta e análise de amostras
- Eutanasiar humanamente o rato após a cirurgia, injetando pentobarbital sódico 100-200 mg / kg por via intraperitoneal. Separe cuidadosamente o músculo e o tecido fascial na superfície do fêmur e remova completamente o fêmur do lado operado. Colete amostras em 0 dias (Figura 2A, B), 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas de pós-operatório.
- Fixar os espécimes femorais em paraformaldeído a 4% por 24 h. Analisar a estrutura do fêmur por meio de microtomografia computadorizada. Defina os parâmetros de varredura da seguinte forma: Potencial do tubo de raios X, 70 kVp; filtro, AL 0,5 mm; intensidade de raios-X, 0,2 mA; tamanho do voxel, 17 μm; e tempo de integração, 1 × 300 ms. Reconstrua imagens de modelo 3D usando dados de bitmap.
- Descalcifique as amostras em EDTA a 10% por 8 semanas antes de desidratar as amostras femorais em uma série graduada de diluições de etanol. Em seguida, incorpore as amostras em cera de parafina15.
- Corte as amostras embebidas em seções de parafina de 5 μm do plano sagital.
- Seções de coloração com um kit de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e um kit de coloração Masson. Observe a cicatrização da área do defeito por histopatologia.
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Representative Results
Neste protocolo, estabelecemos com sucesso um modelo de defeito em cavidade femoral de rato com dimensões de 4,5 mm x 1,5 mm por perfuração. Para analisar o processo de cicatrização, coletamos o tecido femoral do lado operado em 0 dias, 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas após a cirurgia, que são os principais momentos de ossificação endocondral, ossificação intramembranosa e remodelação óssea durante o processo de cicatrização do trauma femoral em ratos2. No dia 0 do pós-operatório, a reconstrução do modelo 3D a partir de dados de bitmap de micro-CT mostrou que modelamos com sucesso um defeito de cavidade em caixa no fêmur com um tamanho de 4,5 mm x 1,5 mm de profundidade na cavidade da medula (Figura 3A). Os resultados da micro-TC mostraram formação óssea trabecular mineralizada no espaço intersticial do defeito ósseo cortical 2 semanas após a criação do modelo (Figura 3B). A superfície do novo tecido ósseo na área do defeito mostrava osso cortical maduro e denso, e o tecido ósseo trabecular ainda era visível no lado medular 4 semanas após a cirurgia (Figura 3C). Após 6 semanas, a área do defeito era quase composta de osso cortical maduro e denso, com apenas uma pequena quantidade de tecido ósseo trabecular permanecendo próximo ao lado medular, indicando que a área do defeito havia basicamente cicatrizado (Figura 3D).
Também analisamos os espécimes coletados pela coloração H&E e coloração tricrômica de Masson (Figura 4). Os resultados mostraram que o tecido ósseo trabecular virgens foi formado na área do defeito 2 semanas após a cirurgia, e o periósteo ao redor da área do defeito engrossou e se conectou com o tecido ósseo trabecular do recém-nascido na área do defeito (Figura 4A, A ', B, B '). Às 4 semanas após a criação do defeito, um tecido ósseo cortical denso foi formado na superfície da área do defeito e conectado ao osso cortical em ambos os lados do defeito; o tecido ósseo trabecular foi reabsorvido fortemente no lado medular (Figura 4C, C ', D, D '). Tecido ósseo cortical maduro foi formado na área do defeito, e o tecido ósseo trabecular no lado medular foi quase completamente reabsorvido 6 semanas após a cirurgia (Figura 4E, E, F, F), indicando que o processo de cicatrização do defeito estava quase completo.
Figura 1: Instrumentos necessários para a criação de defeitos. (A) Instrumentos cirúrgicos. (1) Barbeador elétrico; (2) Pinça oftálmica; (3) Tesoura oftálmica; (4) bisturi descartável; (5) Separador periosteal; (6) Peça de mão oral de baixa velocidade; (7) Sonda oral modificada; (8) Aspirador de irrigação descartável; (9) Porta-agulhas; (10) Tesoura de tecido; (11) Sutura 3.0. (B) Sondas orais rotuladas com as dimensões do diâmetro do defeito. A grande extremidade curva da sonda oral descartável estéril foi marcada com uma escala de 1,5 mm e 4,5 mm para medição intraoperatória do diâmetro da área do defeito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia do defeito da cavidade da caixa (Dia 0). (A,B) Medição das amostras pós-operatórias do Dia 0 usando uma sonda oral modificada que foi usada para criar o defeito da cavidade da caixa (4,5 mm x 1,2 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de micro-TC do processo de cicatrização da área do defeito. Imagens reconstruídas em 3D da área do defeito em 0 dias, 14 dias, 28 dias e 42 dias após a cirurgia. (A) Plano longitudinal. (BD) Imagens de micro-TC longitudinais (painel esquerdo), sagitais (médio) e transversais (painel direito) de cicatrização da área do defeito em 14 dias, 28 dias e 42 dias. A caixa tracejada amarela em A, B, C e D representa a área do defeito. A linha tracejada amarela representa as bordas do defeito e a seta amarela representa o novo tecido ósseo na área do defeito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Resultados histopatológicos. (A-F) Coloração H&E e Masson da área do defeito em 14 dias, 28 dias e 42 dias. (A'-F') As imagens ampliadas das caixas retangulares pretas mostradas em A-F. Tecido ósseo mineralizado semelhante ao trabecular foi formado na área do defeito aos 14 dias após a cirurgia; tecido ósseo cortical foi formado na superfície da área do defeito e conectado a ambas as extremidades da área do defeito 28 dias após a cirurgia; O tecido ósseo cortical maduro foi formado na área do defeito aos 42 dias após a cirurgia, e a cicatrização foi basicamente concluída. A linha pontilhada azul indica a borda do defeito; a área circundada pela linha pontilhada vermelha é o novo tecido ósseo na área do defeito; a seta preta é o periósteo espessado; o triângulo amarelo é o antigo osso cortical; a seta verde é o novo tecido ósseo semelhante ao trabecular; as estrelas pretas e amarelas são o novo tecido ósseo cortical; e a seta vermelha é o novo periósteo. Barras de escala: 500 μm (A-F), 200 μm (A'-F'). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modelos animais pré-clínicos são vitais para examinar a cicatrização óssea e a influência dos biomateriais na regeneração óssea. Este protocolo ilustra um modelo de defeito em cavidade femoral replicando o processo de formação óssea intramembranosa associado à regeneração óssea clínica. A área do defeito foi padronizada no intraoperatório usando uma sonda oral pré-marcada. Os resultados da micro-TC e da coloração histopatológica mostraram cicatrização progressiva ao longo de 6 semanas, com periósteo espessado e nova formação de osso trabecular, seguido por densa formação de osso cortical. Nenhum tecido cartilaginoso foi observado durante o processo de cicatrização, indicando osteogênese intramembranosa. Esta descoberta apresenta novas perspectivas para estudar o papel de biomateriais ou drogas na regeneração óssea clínica.
Este protocolo requer atenção cuidadosa a vários fatores: (i) A anestesia profunda é um pré-requisito para evitar o sofrimento do animal e garantir a localização precisa do defeito. A profundidade da anestesia e os sinais vitais devem ser monitorados vigilantemente. (ii) Durante a separação muscular, atenção meticulosa deve ser dada para prevenir lesões vasculares, o que pode dificultar a recuperação. (iii) Ao preparar o orifício do defeito, mantenha o fulcro direito estável e sempre perpendicular à superfície óssea para garantir que o defeito da caixa esteja na mesma profundidade. A profundidade da broca deve ser controlada para remover o tecido ósseo cortical sem ir excessivamente fundo. Isso evita retardar a cicatrização óssea devido à destruição mecânica excessiva da medula óssea, resultando na remoção de células-tronco mesenquimais (CTMs) e na interrupção da resposta inflamatória16. (iv) A preparação da cavidade requer um assistente para irrigar continuamente a área com solução salina para mitigar possíveis danos teciduais causados pelo calor durante a ablação óssea, mantendo a visibilidade do campo cirúrgico.
Modelos de fratura óssea, defeito ósseo segmentar e defeito ósseo craniano são os modelos animais comumente usados na investigação da regeneração óssea. O modelo de fratura óssea reflete o processo real do trauma, mas os resultados podem variar devido às diferenças nas seções transversais das fraturas entre os animais experimentais17. O modelo de defeito ósseo segmentar simula efetivamente complicações de fratura, como pseudoartrose ou cicatrização retardada. Devido ao seu posicionamento anatômico, esse modelo facilita a avaliação da neoformação óssea e revascularização por meio de métodos radiográficos ouhistológicos18. No entanto, esse método apresenta uma variação considerável no tamanho do defeito entre os sujeitos; A necessidade de fixação por tala ou fixação interna com implantes metálicos também limita sua aplicação11. O modelo de defeito da calvária é caracterizado por ausência de fixação interna, alta reprodutibilidade em tamanho e posição anatômica e ambiente mecânico estável14, o que também restringe a aplicação na avaliação da resposta biológica à carga fisiológica e biomecânica do material implantado13. Além disso, na ausência de enxerto ósseo, a invasão do defeito pela dura-máter e pelos tecidos moles sobrejacentes pode dificultar a regeneração óssea, tornando esses modelos sensíveis ao desempenho do material doandaime18. Portanto, este protocolo propõe o estabelecimento de um defeito em caixa na diáfise femoral de ratos, que permite a medição intraoperatória do diâmetro do defeito usando uma ferramenta simples18. Essa abordagem oferece melhor controle sobre a padronização do defeito do que os modelos de fratura ou defeito segmentar e elimina a necessidade de fixação interna ou externa. Além disso, este modelo é robusto contra o comprometimento da formação óssea devido à erosão dos tecidos moles. Este protocolo, no entanto, apresenta algumas limitações: (i) Execução inadequada ou diâmetros excessivos de defeitos podem levar a hemorragia grave, choque ou até mesmo fatalidade em ratos. Assim, para garantir a segurança e o bem-estar dos animais, é imprescindível praticar cadáveres de ratos antes de realizar o procedimento em indivíduos vivos. (ii) Além disso, a ausência do sistema de Havers no córtex de roedores19 dificulta a reprodução completa do processo natural de cicatrização clínica da fratura/defeito ósseo humano. Os ratos, como roedores, são econômicos, requerem manutenção mínima e são seguros e fáceis de manusear, proporcionando maior reprodutibilidade do que animais maiores, como coelhos, cães e cabras20.
Em resumo, desenvolvemos um modelo de defeito em caixa de diáfise femoral de rato e rastreamos o processo de cicatrização utilizando técnicas de micro-TC e coloração histopatológica. Este protocolo fornece um método abrangente e generalizável para examinar a formação óssea intramembranosa em modelos de regeneração óssea clinicamente significativos. Além disso, propõe perspectivas inovadoras para a avaliação do desempenho biológico de biomateriais substitutos, fármacos associados à regeneração óssea, scaffolds, etc. Também facilita a validação pré-clínica de estratégias terapêuticas emergentes para engenharia de tecido ósseo.
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Disclosures
Todos os dados e imagens originais estão incluídos neste artigo. Os autores declaram não haver conflito de interesses
Acknowledgments
Este estudo foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) e 82100982 (F. L.), e apoiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan 2023NSFSC1499 (H. W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
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