Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de um defeito em cavidade em caixa em tecido de diáfise femoral de ratos. Este modelo pode avaliar o desempenho do biomaterial sob estresse biomecânico e explorar mecanismos de regeneração óssea relacionados à osteogênese intramembranosa.
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Artigo de método
Criando um modelo de defeito de cavidade em caixa no osso cortical do fêmur de rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Defeitos ósseos graves ou fraturas complexas podem resultar em complicações graves, como não consolidação ou cicatrização óssea insuficiente. A engenharia de tecidos, que envolve a aplicação de células, scaffolds e citocinas, é considerada uma solução promissora para a regeneração óssea. Consequentemente, vários modelos animais que simulam defeitos ósseos desempenham um papel crucial na exploração do potencial terapêutico da engenharia de tecidos para a cicatrização óssea. Neste estudo, estabelecemos um modelo de defeito ósseo cortical em forma de caixa no fêmur médio de ratos, que poderia servir como um modelo ideal para avaliar a função dos biomateriais na promoção da cicatrização óssea. Este defeito ósseo cortical em forma de caixa foi perfurado com uma peça de mão oral de baixa velocidade e moldado por uma agulha de torno. A análise de micro-TC pós-operatória foi imediatamente realizada para confirmar o estabelecimento bem-sucedido do defeito ósseo cortical da cavidade em caixa. Os fêmures do lado operado dos ratos foram então colhidos em vários momentos pós-operatórios (0 dias, 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas). O processo de cicatrização da área de defeito de cada amostra foi avaliado por meio de micro-CT, coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrômica de Masson. Esses resultados demonstraram um padrão de cicatrização consistente com ossificação intramembranosa, com cicatrização essencialmente completa em 6 semanas. A categorização do processo de cicatrização deste modelo animal fornece um método in vivo eficaz para investigar novos biomateriais e medicamentos que visam a ossificação intramembranosa durante a cicatrização de defeitos do tecido ósseo.
Introdução
O osso fraturado e defeituoso geralmente resulta de trauma, tumores, inflamação e malformações congênitas 1,2. Embora o tecido ósseo em indivíduos jovens e saudáveis normalmente possua habilidades regenerativas robustas3, defeitos que excedem um tamanho crítico ou impedimentos de cicatrização devido a doenças sistêmicas (por exemplo, diabetes, osteoporose e infecções) ainda podem levar a complicações como descontinuidade óssea ou cicatrização prejudicada4. Para enfrentar esse desafio clínico, enxerto ósseo ou biomateriais são comumente usados para substituir osso gravemente defeituoso ou para reconstruir grandes segmentos ósseos. No entanto, esses tratamentos têm limitações. Por exemplo, embora considerado o padrão-ouro, o enxerto ósseo autólogo sofre de oferta restrita de doadores e possíveis complicações no local doador 5,6. Os aloenxertos também apresentam certos riscos, como rejeição imunomediada, potencial transmissão de doenças e impactos negativos nas propriedades biomecânicas e biológicas do enxerto7.
Nos últimos anos, houve um aumento nas pesquisas com foco nos mecanismos de cicatrização de defeitos ósseos. O uso de biomateriais alternativos e os avanços na engenharia de tecidos têm emergido como tópicos proeminentes no domínio da regeneração óssea8. Antes que esses biomateriais possam ser aplicados à terapia humana, eles devem ser testados in vitro e in vivo para garantir sua eficácia e segurança. No entanto, a reduzida complexidade dos ambientes in vitro e a ausência de respostas imunes e inflamatórias limitam a avaliação de vários biomateriais in vitro. Consequentemente, é necessário o estabelecimento de modelos animais para vários tipos de defeitos do tecido ósseo9. Os modelos animais permitem a avaliação de biomateriais sob diferentes condições de carga, facilitam a compreensão das características ósseas específicas da espécie e fornecem informações sobre a semelhança entre modelos animais e situações clínicas humanas. Essas vantagens são essenciais para estudar as interações osso-andaime e traduzir os resultados da pesquisa para a prática clínica 9,10.
Atualmente, modelos animais de defeitos ósseos mecânicos são amplamente utilizados para validar o desempenho de biomateriais, sendo os modelos de defeitos ósseos cranianos e os modelos de defeitos ósseos segmentares os métodos mais comumenteaplicados11. Modelos de defeitos ósseos segmentares, frequentemente utilizados para mimetizar trauma grave de ossos longos ou tibiais que terminam em pseudoartrose óssea, são vantajosos devido às suas dimensões uniformes e posições anatômicas definidas, simplificando as avaliações radiológicas ou histológicas da nova formação óssea e revascularização. No entanto, esses modelos requerem implantes metálicos para estabilizar segmentos de fratura bilaterais e necessitam de um complexo processo de cicatrização envolvendo ossificação endocondral e intramembranosa12. Por outro lado, os modelos de defeitos ósseos da calvária tornaram-se uma ferramenta primária de triagem para avaliar biomateriais devido aos seus diâmetros de defeito padronizados, acesso cirúrgico conveniente e função de suporte da dura-máter e dos tecidos moles13. Embora sejam amplamente utilizados para modelar a formação óssea intramembranosa em cenários clinicamente relevantes, eles são inadequados para avaliar a cicatrização óssea em condições de carga biomecânica devido à sua natureza não suportadora de carga durante o processo de cicatrização14.
Para resolver essas limitações, estabelecemos um modelo de defeito ósseo cortical em cavidade em caixa no tecido da diáfise femoral de ratos. Utilizando microtomografia computadorizada (TC), reconstrução tridimensional (3D) e coloração histopatológica (Hematoxilina e eosina [HE] e Masson), analisamos o processo de cicatrização desse modelo em condições de hemostasia. Nosso objetivo é oferecer novos insights para avaliar o desempenho do biomaterial sob condições de carga biomecânica e para estudar a bioengenharia e o mecanismo de regeneração óssea vis-à-vis a ossificação intramembranosa.
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Ratos Sprague-Dawley (machos, peso corporal 300 g) foram utilizados para o presente estudo.
1. Preparação pré-cirúrgica
- Preparação do instrumento
- Consulte a Figura 1A para os instrumentos cirúrgicos utilizados neste estudo: barbeador elétrico, tesoura de tecido, tesoura oftálmica, pinça oftálmica, bisturi descartável, separador de periósteo, peça de mão oral de baixa rotação, sonda oral, aspirador de irrigação descartável, porta-agulha, sutura 3.0.
- Prepare uma sonda oral e marque a extremidade curva grande da sonda com uma caneta marcadora de acordo com o diâmetro do defeito (Figura 1B). Use isso para determinar o tamanho do defeito durante a cirurgia.
- Esterilize todos os materiais e instrumentos cirúrgicos usados para realizar o procedimento antes de usar. Embale os materiais desejados em pano dobrado ou papel de embrulho e sele-os com fita de autoclave para esterilização a vapor (125-135°C por 20-25 min).
- Preparação da área cirúrgica: Desinfete a mesa cirúrgica e o ambiente ao redor da mesa pulverizando com álcool 75%. Crie uma área estéril de aproximadamente 60 cm x 90 cm com cortinas autoclavadas na mesa de operação.
- Preparação da anestesia
- Anestesiar os ratos por via intraperitoneal com cloridrato de cetamina a 10% (50-100 mg/kg) e xilazina a 2% (2 mg/kg). Use injeção subcutânea de carprofeno (5 mg / kg) para analgesia pré e intraoperatória. Examine a profundidade da anestesia pelo teste de pinça do dedo do pé. Após a anestesia, aplique pomada estéril nos olhos para evitar olhos secos e lesões na córnea.
2. Procedimento cirúrgico
- Coloque o rato em posição de decúbito lateral na mesa cirúrgica estéril e remova os pelos dos membros inferiores com um barbeador elétrico.
- Use solução de iodóforo a 5% e álcool a 75% para desinfetar o tecido cutâneo na área cirúrgica.
- Localize o fêmur proximal e distal e faça uma incisão de 2,5 cm ao longo do longo eixo do fêmur para cortar o tecido da pele do rato.
- Separe a camada de pele da fáscia com pinça oftálmica e tesoura de tecido e exponha a abordagem lateral do fêmur através dos músculos bíceps femoral e femoral lateral.
- Localize a interseção dos dois septos musculares (uma linha de tecido branco) e separe cuidadosamente com uma lâmina cirúrgica descartável ao longo da borda do músculo até que a superfície femoral seja alcançada.
NOTA: Ao usar uma lâmina descartável para separar o músculo, é importante separar ao longo do septo muscular e ter cuidado para não causar lesões vasculares nos tecidos moles. Iniciantes e não familiarizados com a anatomia devem usar pinças oftálmicas e separadores periósteis na dissecção romba entre os dois volumes musculares.
- Aplique um separador periosteal para separar sem rodeios os músculos da superfície femoral e expor o meio da diáfise femoral.
- Use uma caneta marcadora estéril para marcar a área do local do defeito na superfície média da diáfise femoral, localizada na parte superior da crista oblíqua lateral de 1/3 da cabeça femoral.
- Use a peça de mão oral de baixa velocidade com uma broca esférica em câmera lenta de 1,2 mm de diâmetro para fazer um pequeno orifício perpendicular à superfície óssea no local marcado, destruindo o periósteo e o córtex ósseo com uma profundidade profunda o suficiente para alcançar a cavidade da medula óssea. Nesse nível de profundidade de perfuração, expanda o tamanho do furo paralelo a essa profundidade em todas as direções, aparando para obter uma forma de cavidade em caixa.
- Use uma sonda oral marcada paralela à borda do defeito para determinar o diâmetro e a morfologia do defeito durante e após a preparação.
- Feche as camadas muscular e cutânea com pontos absorvíveis de monofilamento 3-0, respectivamente, e desinfete a área cirúrgica com iodóforo a 5% de dentro para fora.
3. Cuidados pós-operatórios
- Após a cirurgia, administrar carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea e colocar o rato em uma almofada de aquecimento de temperatura constante até a recuperação da anestesia. Quando o rato recuperar a consciência, mova-o suavemente para uma gaiola que contenha roupas de cama secas e autoclavadas.
- Continuar a analgesia por 24 h e o monitoramento pós-operatório por 1 semana após a cirurgia.
4. Coleta e análise de amostras
- Eutanasiar humanamente o rato após a cirurgia, injetando pentobarbital sódico 100-200 mg / kg por via intraperitoneal. Separe cuidadosamente o músculo e o tecido fascial na superfície do fêmur e remova completamente o fêmur do lado operado. Colete amostras em 0 dias (Figura 2A, B), 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas de pós-operatório.
- Fixar os espécimes femorais em paraformaldeído a 4% por 24 h. Analisar a estrutura do fêmur por meio de microtomografia computadorizada. Defina os parâmetros de varredura da seguinte forma: Potencial do tubo de raios X, 70 kVp; filtro, AL 0,5 mm; intensidade de raios-X, 0,2 mA; tamanho do voxel, 17 μm; e tempo de integração, 1 × 300 ms. Reconstrua imagens de modelo 3D usando dados de bitmap.
- Descalcifique as amostras em EDTA a 10% por 8 semanas antes de desidratar as amostras femorais em uma série graduada de diluições de etanol. Em seguida, incorpore as amostras em cera de parafina15.
- Corte as amostras embebidas em seções de parafina de 5 μm do plano sagital.
- Seções de coloração com um kit de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e um kit de coloração Masson. Observe a cicatrização da área do defeito por histopatologia.
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Resultados
Neste protocolo, estabelecemos com sucesso um modelo de defeito em cavidade femoral de rato com dimensões de 4,5 mm x 1,5 mm por perfuração. Para analisar o processo de cicatrização, coletamos o tecido femoral do lado operado em 0 dias, 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas após a cirurgia, que são os principais momentos de ossificação endocondral, ossificação intramembranosa e remodelação óssea durante o processo de cicatrização do trauma femoral em ratos2. No dia 0 do...
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Discussão
Modelos animais pré-clínicos são vitais para examinar a cicatrização óssea e a influência dos biomateriais na regeneração óssea. Este protocolo ilustra um modelo de defeito em cavidade femoral replicando o processo de formação óssea intramembranosa associado à regeneração óssea clínica. A área do defeito foi padronizada no intraoperatório usando uma sonda oral pré-marcada. Os resultados da micro-TC e da coloração histopatológica mostraram cicatrização progressiva ao longo de 6 semanas, com periósteo espessado e nova form...
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Divulgações
Todos os dados e imagens originais estão incluídos neste artigo. Os autores declaram não haver conflito de interesses
Agradecimentos
Este estudo foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) e 82100982 (F. L.), e apoiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan 2023NSFSC1499 (H. W.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Furadeira esférica de baixa velocidade de 1,2 mm | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | Para a preparação de defeitos da cavidade da caixa |
| 3,0 sutura | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nenhum | Para suturar feridas |
| 4% paraformaldeído | Biosharp | BL539A | Para fixar as amostras femorais |
| Bolas de algodão | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | Para esterilização da pele e limpeza do campo cirúrgico |
| Palitos de algodão | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | Para desinfecção da pele |
| Retificadora de técnico de prótese dentária | Marathon | N3-140232 | Para preparação de defeitos da cavidade da caixa |
| Bisturi descartável | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | Para a realização de incisões na pele, bem como para separar nitidamente o tecido muscular |
| Barbeador eléctrico | JASE | BM320210 | Remoção do tecido piloso da área cirúrgica |
| Hematoxilina e Eosina Kit de coloração | Biosharp | C1005 | Para a análise histológica dos espécimes |
| Masson' s Kit de Mancha Tricrômica | Solarbio | G1340 | Para a análise histológica dos espécimes |
| Micro CT | Scanco medical ag | µ CT 45 | Para analisar a cicatrização de defeitos em amostras femorais |
| Porta-agulhas | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nenhum | Para agulhas de sutura |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | Para analisar os resultados da coloração HE e coloração de Masson |
| Pinça oftálmica | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nenhum | Para apertar a pele, tecido muscular |
| Tesoura oftálmica | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nenhum | Para formar uma abordagem de incisão na pele |
| Peça de mão oral de baixa velocidade | Marathon | Y221101003 | Para preparação de defeitos da cavidade da caixa Sonda |
| oral | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | Para medir o diâmetro dos defeitos |
| Separador periosteal | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nenhum | Para separação sem corte do tecido muscular |
| Sprague– Ratos Dawley | Byrness Weil Biotech Ltd | Nenhum | Para o estabelecimento de defeito cavitário quadrado do osso femoral |
| Tesoura de tecido | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Nenhum | Para formar uma abordagem de incisão na pele |
Referências
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Reimpressões e permissões
