التحقق الأولي من إحداثيات الحقن التجسيمي عن طريق التقسيم بالتبريد
Summary
يصف هذا البروتوكول استراتيجية عملية للتعجيل بخطوة التحقق من إحداثيات الحقن التجسيمي قبل إجراء تتبع الفيروس باستخدام الأصباغ والأقسام المجمدة.
Abstract
يشكل الحقن التجسيمي لمنطقة معينة من الدماغ تقنية تجريبية أساسية في علم الأعصاب الأساسي. عادة ما يبني الباحثون اختيارهم لمعلمات الحقن التجسيمي على أطالس دماغ الفئران أو المواد المنشورة التي تستخدم مجموعات / أعمار مختلفة من الفئران ومعدات تجسيمية مختلفة ، مما يستلزم مزيدا من التحقق من صحة معلمات الإحداثيات المجسمة. تعتمد فعالية تصوير الكالسيوم والتلاعب الكيميائي الوراثي والبصري الوراثي على التعبير الدقيق لجينات المراسل داخل المنطقة محل الاهتمام ، وغالبا ما تتطلب عدة أسابيع من الجهد. وبالتالي ، فهي مهمة تستغرق وقتا طويلا إذا لم يتم التحقق من إحداثيات منطقة الدماغ المستهدفة مسبقا. باستخدام صبغة مناسبة بدلا من الفيروس وتنفيذ التقسيم بالتبريد ، يمكن للباحثين مراقبة موقع الحقن مباشرة بعد إعطاء الصبغة. هذا يسهل التعديلات في الوقت المناسب لتنسيق المعلمات في الحالات التي توجد فيها تناقضات بين موقع الحقن الفعلي والموضع النظري. هذه التعديلات تعزز بشكل كبير دقة التعبير الفيروسي داخل المنطقة المستهدفة في التجارب اللاحقة.
Introduction
تتطلب جميع أدوات التعديل العصبي الحديثة تقريبا ، بما في ذلك تسجيل الكالسيوم في الجسم الحي ، والأدوات البصرية الوراثية ، والأدوات الكيميائية الجينية ، استخدام إحداثيات مجسمة لاستهداف منطقة الدماغ محل الاهتمام1،2،3 ، مما يشكل أساس التلاعب العصبي. يتم تعريف الإحداثيات المجسمة لمناطق دماغ الفأر فيما يتعلق ب bregma و lambda ، المعالم العظمية على الجمجمة ، والتي تشكل ما يسمى بنظام الإحداثيات التجسيمية المشتقة من الجمجمة. يمكن أن يكون البريغما أو لامدا بمثابة نقطة الصفر للإحداثيات ثلاثية الأبعاد. المحاور الثلاثة هي الأمامية الخلفية (AP) ، والمتوسطة الجانبية (ML) ، والظهرية البطنية (DV) ، والتي تمثل المحاور y و x و z على الشاشة الرقمية للأدوات المجسمة. بالنسبة لمناطق الدماغ المعروفة ، يمكن الحصول على معلمات الإحداثيات المجسمة لمنطقة معينة من أطالس دماغ الفأر4 (على سبيل المثال ، Paxinos ودماغ فأر فرانكلين في الإحداثيات المجسمة) و / أو الأدبيات المنشورة 5,6. ومع ذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التحقق بسبب الاختلافات في معدات التجسيم وعمر / أعداد الفئران المستخدمة من قبل باحثين مختلفين.
الهيكل هو أساس الوظيفة. تشكل الدوائر العصبية الأساس للعديد من وظائف الدماغ ، مثل الأنشطة المعرفية والعاطفة والذاكرة والوظائف الحسية والحركية1. يعد وضع العلامات على البنية والتلاعب بنشاط الدوائر العصبية أمرا حيويا لفهم وظيفة دائرة عصبية معينة. على مدى العقود الماضية ، تطورت المتتبعات العصبية عبر أجيال عديدة. اعتمدت الأبحاث المبكرة أغلوتينين جنين القمح (WGA) و phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) كمتتبعات تقدمية ، والفلوروغولد (FG) ، الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (CTB) ، الكاربوسيانين كمتتبعات رجعية. ومع ذلك ، على عكس المتتبعات الفيروسية ، لا يمكن لهذه المقتفيات العصبية التقليدية دمج الجينات الخارجية في المضيف ، ولا تتمتع بانتقائية نوع الخلية. في الوقت الحاضر ، أصبحت الاستراتيجية الفيروسية اقتراحا مهما خلال أبحاث علم الأعصاب الأساسية. لأغراض بحثية مختلفة ، يمكن اختيار أدوات فيروسية مختلفة 7,8. هناك فيروسات غير عبر المشبكي ، وفيروسات عبر متعدد المشابك (رجعية وتقدمية) ، وفيروسات عبر أحادي المشبك (رجعي وأمامي). تحتوي كل فئة على عدة أنواع لها خصائص كل منها.
تستغرق عملية الإعطاء والتعبير الفيروسي وقتا طويلا وموارد كثيفة الاستخدام ، وغالبا ما تستغرق أسابيع أو حتى أكثر. من بين النواقل الفيروسية المختلفة ، تم تحديد الفيروس المرتبط بالغدي كوسيلة واعدة لتوصيل الجينات ، مما يوفر نافذة واسعة تتراوح من 3 إلى 8 أسابيع بعد الحقن للإجراء التجريبي 7,8. مع تطور AAV ، يمكن إجراء التحليل بعد 2-3 أسابيع من إعطاء 9,10. تتطلب متتبعات الدوائر العصبية الأخرى ، مثل فيروس داء الكاذب (PRV) وفيروس داء (RV) ، فترة تتبع لا تقل عن 2-7 أيام11،12،13،14،15. وبالتالي ، فإن التحقق الأولي من موقع الحقن قبل مراقبة إشارات التألق يكون فعالا من حيث الوقت والتكلفة.
لتسهيل التحقق البسيط والسريع من الحقن التجسيمية ، في هذه الدراسة ، يتم إعطاء صبغة قبل النواقل الفيروسية ، ويمكن التشريح بالتبريد الباحثين من مراقبة موقع الحقن وتتبعه في غضون 30 دقيقة بعد الحقن.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت هذه المقالة استراتيجية مستقرة للتحقق من دقة حقن الدماغ التجسيمية 5,6 بسرعة أكبر وببساطة قبل تتبع الفيروس ، ولكن الجانب الذي لا يمكن الاستغناء عنه من التعبير الجيني للمراسل في منطقة الدماغ أمر بالغ الأهمية لوضع العلامات على منطقة الدماغ. سمحت الصبغة الز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82101249 إلى XY Sun) ، مؤسسة أبحاث ما بعد الدكتوراه في الصين (منحة رقم 2022M722125 إلى XY Sun). برنامج شنغهاي للإبحار (منحة رقم 21YF1425100 إلى SH Chen). المشروع الخاص للبحوث السريرية التابع للجنة الصحة البلدية في شنغهاي (المنحة رقم 202340088 إلى J Zhou). المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82101262 ل X Zhang ، المنحة رقم 82101287 إلى SH Chen).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
