Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning
Summary
본 프로토콜은 염료 및 동결 절편을 사용하여 바이러스 추적을 수행하기 전에 입체탁 주입 좌표의 검증 단계를 신속하게 처리하기 위한 실용적인 전략을 설명합니다.
Abstract
특정 뇌 부위에 대한 입체적 주입은 기초 신경과학의 기본적인 실험 기법입니다. 연구자들은 일반적으로 마우스의 다양한 개체군/연령 및 다양한 입체 장비를 사용한 마우스 뇌 아틀라스 또는 발표된 자료에 따라 입체탁스 주입 매개변수를 선택하므로 입체 좌표 매개변수에 대한 추가 검증이 필요합니다. 칼슘 이미징, 화학유전학 및 광유전학 조작의 효능은 관심 영역 내 리포터 유전자의 정확한 발현에 달려 있으며, 종종 몇 주간의 노력이 필요합니다. 따라서 대상 뇌 영역의 좌표를 미리 확인하지 않으면 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 바이러스 대신 적절한 염료를 사용하고 동결 절제를 구현하면 연구원은 염료 투여 직후 주입 부위를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 실제 사출 부위와 이론적 위치 사이에 불일치가 있는 경우 좌표 매개변수를 적시에 조정할 수 있습니다. 이러한 조정은 후속 실험에서 표적 영역 내에서 바이러스 발현의 정확도를 크게 향상시킵니다.
Introduction
생체 내 칼슘 기록, 광유전학 및 화학유전학 도구를 포함한 거의 모든 현대 신경 조절 도구는 신경 조작의 기초를 형성하는 뇌 관심 영역 1,2,3을 표적으로 하기 위해 입체 좌표를 사용해야 합니다. 쥐의 뇌 영역에 대한 입체 좌표는 두개골의 뼈 랜드 마크인 브레그마 (bregma)와 람다 (lambda)와 관련하여 정의되며, 소위 두개골 유래 입체 좌표계를 형성합니다. bregma 또는 lambda는 3차원 좌표의 영점 역할을 할 수 있습니다. 3개의 축은 전후(AP), 내측(ML) 및 등쪽(DV)으로, 입체 기기의 디지털 디스플레이에서 y, x 및 z축을 나타냅니다. 잘 알려진 뇌 영역의 경우, 특정 영역의 입체 좌표 매개변수는 마우스 뇌 아틀라스(mouse brain atlases)4(예: 입체 좌표에서의 팍시노스(Paxinos) 및 프랭클린의 마우스 뇌) 및/또는 발표된 문헌 5,6으로부터 얻어질 수 있다. 그러나 입체 택시 장비의 다양성과 다른 연구자가 사용하는 마우스의 연령/개체군으로 인해 추가 검증이 필요합니다.
구조는 기능의 기초입니다. 신경 회로는 인지 활동, 감정, 기억, 감각 및 운동 기능과 같은 많은 뇌 기능의 기초를 형성합니다1. 구조를 분류하고 신경 회로의 활동을 조작하는 것은 특정 신경 회로의 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 지난 수십 년 동안 신경 추적자는 여러 세대에 걸쳐 진화해 왔습니다. 초기 연구에서는 밀 배아 응집체(WGA) 및 위상 올루스 불가리스 응집체(PHA)를 전행 추적자로, 플루오로골드(FG), 콜레라 독소 소단위 B(CTB), 카보시아닌을 역행 추적자로 채택했습니다. 그러나 바이러스 추적자와 달리 이러한 전통적인 신경 추적자는 외인성 유전자를 숙주에 통합할 수 없으며 세포 유형 선택성도 없습니다. 오늘날 바이러스 전략은 기초 신경 과학 연구에서 중요한 제안이 되었습니다. 다양한 연구 목적을 위해 다양한 바이러스 도구를 선택할 수 있습니다 7,8. non-trans-transsynaptic virus, trans-multisynaptic virus(역행 및 전행성) 및 trans-monosynaptic virus(역행 및 전행성 바이러스)가 있습니다. 각 범주에는 각각의 특성을 가진 여러 유형이 포함되어 있습니다.
바이러스 투여 및 발현 과정은 시간과 자원이 많이 소요되며 종종 몇 주 또는 그 이상이 걸립니다. 다양한 바이러스 벡터 중에서, 아데노 관련 바이러스는 유전자 전달을 위한 유망한 수단으로 확인되었으며, 실험 절차 7,8에서 주입 후 3주에서 8주에 이르는 넓은 기간을 제공합니다. AAV가 발전함에 따라, 분석은 투여 후 2-3주 후에 수행할 수 있다 9,10. 가성 광견병 바이러스(PRV) 및 광견병 바이러스(RV)와 같은 다른 신경 회로 추적자도 최소 2-7일의 추적 기간을 필요로 합니다 11,12,13,14,15. 따라서 형광 신호를 관찰하기 전에 주입 부위를 미리 검증하는 것은 시간적으로나 비용 효율적입니다.
입체적 주입의 간단하고 신속한 검증을 용이하게 하기 위해 이 연구에서는 바이러스 벡터 전에 염료를 투여하고 동결 절개를 통해 연구원은 주입 부위를 관찰하고 주입 후 30분 이내에 추적할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 바이러스 추적 전에 입체적 뇌 주입 5,6의 정확성을 더 빠르고 간단하게 검증할 수 있는 안정적인 전략을 설명했지만, 뇌 영역에서 리포터 유전자 발현의 대체 불가능한 측면은 뇌 영역 라벨링에 매우 중요합니다. 우리가 사용한 파란색 염료는 주입 부위를 즉시 시각화할 수 있었습니다.
이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
중국 국립 자연 과학 재단(XY Sun에 보조금 번호 82101249), 중국 박사후 연구 재단(XY Sun에 보조금 번호 2022M722125). 상하이 세일링 프로그램(SH Chen에 보조금 번호 21YF1425100). 상하이시 위생건강위원회 임상 연구를 위한 특별 프로젝트(J Zhou에게 보조금 NO. 202340088). 중국 국립 자연 과학 재단 (X Zhang에게 보조금 NO. 82101262, SH Chen에게 보조금 NO. 82101287).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
