Предварительная валидация стереотаксических координат инжекции с помощью криосекции
Summary
В настоящем протоколе описана практическая стратегия для ускорения этапа верификации координат стереотаксической инъекции перед проведением отслеживания вируса с использованием красителей и замороженных срезов.
Abstract
Стереотаксическая инъекция в определенную область мозга представляет собой фундаментальный экспериментальный метод в фундаментальной нейробиологии. Исследователи обычно основывают свой выбор параметров стереотаксической инъекции на атласах мозга мышей или опубликованных материалах, в которых использовались различные популяции/возрасты мышей и различное стереотаксическое оборудование, что требует дальнейшей проверки параметров стереотаксических координат. Эффективность визуализации кальция, хемогенетических и оптогенетических манипуляций зависит от точной экспрессии репортерных генов в исследуемой области, что часто требует нескольких недель усилий. Таким образом, это трудоемкая задача, если заранее не проверены координаты целевой области мозга. Используя соответствующий краситель вместо вируса и реализуя криосекцию, исследователи могут наблюдать за местом инъекции сразу после введения красителя. Это способствует своевременной корректировке параметров координат в тех случаях, когда существуют расхождения между фактическим местом введения и теоретическим положением. Такие корректировки значительно повышают точность экспрессии вируса в целевой области в последующих экспериментах.
Introduction
Почти все современные инструменты нейромодуляции, включая запись кальция in vivo, оптогенетические и хемогенетические инструменты, требуют использования стереотаксических координат для нацеливания на область мозга, представляющую интерес 1,2,3, что составляет основу нейронных манипуляций. Стереотаксические координаты областей мозга мыши определяются по отношению к брегме и лямбде, костным ориентирам на черепе, образуя так называемую стереотаксическую систему координат, производную от черепа. Либо брегма, либо лямбда могут служить нулевой точкой трехмерных координат. Три оси — переднезадняя (AP), медиолатеральная (ML) и дорсовентральная (DV), представляющие оси y, x и z на цифровом дисплее стереотаксических инструментов. Для хорошо известных областей мозга параметры стереотаксических координат конкретной области могут быть получены из атласов мозга мышей4 (например, мозг мыши Паксиноса и Франклина в стереотаксических координатах) и/или из опубликованной литературы 5,6. Тем не менее, дальнейшая валидация необходима из-за различий в стереотаксическом оборудовании и возрасте/популяциях мышей, используемых различными исследователями.
Структура – это основа функции. Нейронные цепи формируют основу для многих функций мозга, таких как когнитивная деятельность, эмоции, память, сенсорные и моторныефункции. Маркировка структуры и манипулирование активностью нейронных цепей жизненно важны для понимания функции конкретной нейронной цепи. За последние десятилетия нейронные индикаторы развивались на протяжении многих поколений; в ранних исследованиях в качестве антероградных индикаторов использовались агглютинин зародышей пшеницы (WGA) и агглютинин phaseolus vulgaris (PHA), а в качестве ретроградных индикаторов – фторзолото (FG), субъединица холерного токсина B (CTB), карбоцианин. Однако, в отличие от вирусных индикаторов, эти традиционные нейронные индикаторы не могут интегрировать экзогенные гены в организм хозяина, а также не обладают селективностью по типу клеток. В настоящее время вирусная стратегия стала важным предложением в фундаментальных исследованиях в области нейробиологии. Для различных исследовательских целей могут быть выбраны различные вирусные средства 7,8. Различают нетранссинаптические вирусы, транс-мультисинаптические вирусы (ретроградные и антероградные) и транс-моносинаптические вирусы (ретроградные и антероградные). Каждая категория содержит несколько типов с соответствующими характеристиками.
Процесс введения и экспрессии вируса очень трудоемкий и ресурсоемкий, часто занимает недели или даже дольше. Среди различных вирусных векторов аденоассоциированный вирус был идентифицирован как перспективное средство доставки генов, обеспечивающее широкое окно в диапазоне от 3 до 8 недель после инъекции для экспериментальной процедуры 7,8. По мере развития AAV анализ может быть проведен через 2-3 недели после введения 9,10. Другие индикаторы нейронных цепей, такие как вирус псевдобешенства (PRV) и вирус бешенства (RV), также требуют периода отслеживания не менее 2-7 дней 11,12,13,14,15. Таким образом, предварительная верификация места инъекции перед наблюдением сигналов флуоресценции является как быстрой, так и экономически эффективной.
Чтобы облегчить простую и быструю верификацию стереотаксических инъекций, в этом исследовании краситель вводится перед вирусными векторами, а криосекция позволяет исследователям наблюдать за местом инъекции и отслеживать его в течение 30 минут после инъекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описана стабильная стратегия более быстрой и простой проверки точности стереотаксических инъекций в мозг до отслеживания вируса, но незаменимый аспект экспрессии репортерных генов в области мозга имеет решающее значение для маркировки областей мозга.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Национальный фонд естественных наук Китая (грант No 82101249 XY Sun), Фонд постдокторских исследований Китая (грант No 2022M722125 XY Sun). Шанхайская парусная программа (грант No 21YF1425100 для С. Х. Чена). Специальный проект по клиническим исследованиям Шанхайской муниципальной комиссии по здравоохранению (грант No 202340088 компании J Zhou). Национальный фонд естественных наук Китая (грант No 82101262 Х Чжану, грант No 82101287 С. Чэню).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
