אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מעשית לזרז את שלב האימות של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות לפני ביצוע מעקב נגיפי באמצעות צבעים ומקטעים קפואים.
Abstract
הזרקה סטריאוטקסית של אזור מסוים במוח מהווה טכניקה ניסיונית בסיסית במדעי המוח הבסיסיים. חוקרים בדרך כלל מבססים את בחירתם בפרמטרים של הזרקה סטריאוטקסית על אטלסים של מוח עכבר או חומרים שפורסמו שהשתמשו באוכלוסיות/גילאים שונים של עכברים ובציוד סטריאוטקסי שונה, מה שמחייב אימות נוסף של פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. היעילות של דימות סידן, מניפולציות כימוגנטיות ואופטוגנטיות מסתמכת על ביטוי מדויק של גנים מדווחים באזור המעניין, הדורש לעתים קרובות מספר שבועות של מאמץ. לכן, זוהי משימה גוזלת זמן אם הקואורדינטות של אזור המוח היעד אינן מאומתות מראש. באמצעות שימוש בצבע מתאים במקום וירוס ויישום קריוסקציה, החוקרים יכולים לצפות באתר ההזרקה מיד לאחר מתן הצבע. זה מאפשר התאמות בזמן כדי לתאם פרמטרים במקרים שבהם קיימים פערים בין אתר ההזרקה בפועל לבין המיקום התיאורטי. התאמות כאלה משפרות באופן משמעותי את דיוק ביטוי הנגיפים באזור המטרה בניסויים הבאים.
Introduction
כמעט כל הכלים הנוירומודולטיביים המודרניים, כולל רישום סידן in vivo, כלים אופטוגנטיים וכימוגנטיים, דורשים שימוש בקואורדינטות סטריאוטקסיות כדי להתמקד באזור המוח המעניין 1,2,3, ויוצרים את הבסיס למניפולציה עצבית. קואורדינטות סטריאוטקסיות עבור אזורי מוח של עכברים מוגדרות ביחס לברגמה ולמבדה, ציוני הדרך הגרמיים על הגולגולת, ויוצרים את מה שמכונה מערכת קואורדינטות סטריאוטקסית שמקורה בגולגולת. ברגמה או למדא יכולות לשמש כנקודת האפס של הקואורדינטות התלת-ממדיות. שלושת הצירים הם אנטרופוסטריורי (AP), בינוני (ML) ודורסו-ונטרלי (DV), המייצגים את צירי y, x ו-z בתצוגה דיגיטלית של מכשירים סטריאוטקסיים. עבור אזורי מוח ידועים, ניתן לקבל את פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של אזור מסויםמאטלסים 4 של מוח עכבר (למשל, מוח העכבר של פקסינוס ופרנקלין בקואורדינטות סטריאוטקסיות) ו/או מהספרות שפורסמה 5,6. עם זאת, יש צורך בתיקוף נוסף בשל שינויים בציוד סטריאוטקסי ובגיל/אוכלוסיות העכברים המשמשים חוקרים שונים.
מבנה הוא הבסיס לתפקוד. מעגלים עצביים מהווים את הבסיס לתפקודי מוח רבים, כגון פעילויות קוגניטיביות, רגש, זיכרון, תפקודים חושיים ומוטוריים1. תיוג המבנה ומניפולציה של הפעילות של מעגלים עצביים חיוניים להבנת תפקודו של מעגל עצבי מסוים. במהלך העשורים האחרונים, עוקבים עצביים התפתחו במשך דורות רבים; מחקרים מוקדמים אימצו את נבט החיטה אגלוטינין (WGA) ופאזולוס וולגריס אגלוטינין (PHA) כעוקבים אנטרוגרדיים, ואת פלואורוגולד (FG), תת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB), קרבוציאנין כעוקבים מדרדרים. עם זאת, שלא כמו נותבים נגיפיים, עוקבים עצביים מסורתיים אלה אינם יכולים לשלב גנים אקסוגניים בפונדקאי, וגם אין להם סלקטיביות מסוג התא. כיום, האסטרטגיה הוויראלית הפכה להצעה חשובה במהלך מחקר בסיסי במדעי המוח. למטרות מחקר שונות, ניתן לבחור כלים ויראליים שונים 7,8. ישנם וירוסים שאינם טרנססינפטיים, וירוסים טרנס-מולטיסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים), ונגיפים טרנס-מונוסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים). כל קטגוריה מכילה מספר סוגים עם מאפיינים מתאימים.
תהליך הניהול והביטוי של הנגיפים הוא עתיר זמן ומשאבים, ולעתים קרובות לוקח שבועות ואף יותר. בין וקטורים נגיפיים שונים, וירוס הקשור באדנו זוהה כאמצעי מבטיח להעברת גנים, ומספק חלון רחב הנע בין 3 ל 8 שבועות לאחר ההזרקה להליך הניסוי 7,8. ככל ש- AAV מתפתח, ניתוח יכול להתבצע 2-3 שבועות לאחר מתן 9,10. עוקבים אחרים של מעגלים עצביים, כגון וירוס פסאודורבי (PRV) ונגיף הכלבת (RV), דורשים גם הם תקופת מעקב של לפחות 2-7 ימים 11,12,13,14,15. לפיכך, אימות ראשוני של אתר ההזרקה לפני צפייה באותות פלואורסצנטיים הוא גם זמן וגם חסכוני.
כדי לאפשר אימות פשוט ומהיר של הזרקות סטריאוטקסיות, במחקר זה, צבע ניתן לפני וקטורים נגיפיים, והקפאה מאפשרת לחוקרים לצפות באתר ההזרקה ולעקוב אחריו תוך 30 דקות לאחר ההזרקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה תיאר אסטרטגיה יציבה לאימות הדיוק של זריקות מוח סטריאוטקסיות 5,6 מהר יותר ופשוט לפני מעקב נגיפי, אך ההיבט חסר התחליף של ביטוי גנים מדווח באזור המוח הוא חיוני לתיוג אזור המוח. הצבע הכחול בו השתמשנו איפשר הדמיה מיידית של אתר ההזרקה.
מספר ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘82101249 ל- XY Sun), קרן המחקר לפוסט-דוקטורט של סין (מענק מס ‘2022M722125 ל- XY Sun). תוכנית השייט של שנחאי (מענק מס’ 21YF1425100 לש.ש. צ’ן). פרויקט מיוחד למחקר קליני של ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (מענק מס ‘202340088 לג’יי ג’ואו). הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘82101262 ל- X Zhang, מענק מס ‘82101287 ל- SH Chen).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
