Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması
Summary
Mevcut protokol, boyalar ve donmuş kesitler kullanarak viral izleme yapmadan önce stereotaksik enjeksiyon koordinatlarının doğrulama adımını hızlandırmak için pratik bir stratejiyi açıklamaktadır.
Abstract
Belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik enjeksiyonu, temel sinirbilimde temel bir deneysel teknik oluşturur. Araştırmacılar genellikle stereotaksik enjeksiyon parametreleri seçimlerini fare beyin atlaslarına veya çeşitli popülasyonlar / yaşlarda fareler ve farklı stereotaksik ekipman kullanan yayınlanmış materyallere dayandırırlar ve bu da stereotaksik koordinat parametrelerinin daha fazla doğrulanmasını gerektirir. Kalsiyum görüntüleme, kemogenetik ve optogenetik manipülasyonların etkinliği, genellikle birkaç haftalık çaba gerektiren, ilgilenilen bölgedeki raportör genlerin kesin ifadesine dayanır. Bu nedenle, hedef beyin bölgesinin koordinatlarının önceden doğrulanmaması zaman alıcı bir iştir. Virüs yerine uygun bir boya kullanarak ve kriyoseksiyon uygulayarak, araştırmacılar boya uygulamasından hemen sonra enjeksiyon bölgesini gözlemleyebilirler. Bu, gerçek enjeksiyon bölgesi ile teorik konum arasında tutarsızlıkların olduğu durumlarda koordinat parametrelerinde zamanında ayarlamalar yapılmasını kolaylaştırır. Bu tür ayarlamalar, sonraki deneylerde hedef bölge içindeki viral ekspresyonun doğruluğunu önemli ölçüde artırır.
Introduction
İn vivo kalsiyum kaydı, optogenetik ve kemogenetik araçlar dahil olmak üzere neredeyse tüm modern nöromodülasyon araçları, nöral manipülasyonun temelini oluşturan beyin ilgi alanını 1,2,3 hedeflemek için stereotaksik koordinatların kullanılmasını gerektirir. Fare beyin bölgeleri için stereotaksik koordinatlar, kafatası üzerindeki kemikli yer işaretleri olan bregma ve lambda ile ilişkili olarak tanımlanır ve kafatasından türetilmiş stereotaksik koordinat sistemini oluşturur. Ya bregma ya da lambda, üç boyutlu koordinatların sıfır noktası olarak hizmet edebilir. Üç eksen anteroposterior (AP), mediolateral (ML) ve dorsoventral (DV) olup, stereotaksik aletlerin dijital ekranında y, x ve z eksenlerini temsil eder. İyi bilinen beyin bölgeleri için, belirli bir alanın stereotaksik koordinat parametreleri, fare beyin atlaslarından4 (örneğin, stereotaksik koordinatlarda Paxinos ve Franklin’in fare beyni) ve/veya yayınlanmış literatürden 5,6 elde edilebilir. Bununla birlikte, stereotaksik ekipmandaki farklılıklar ve farklı araştırmacılar tarafından kullanılan farelerin yaşı / popülasyonları nedeniyle daha fazla doğrulama gereklidir.
Yapı, işlevin temelidir. Nöral devreler, bilişsel aktiviteler, duygu, hafıza, duyusal ve motor işlevler gibi birçok beyin fonksiyonunun temelini oluşturur1. Nöral devrelerin yapısını etiketlemek ve aktivitesini manipüle etmek, belirli bir nöral devrenin işlevini anlamak için hayati önem taşır. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, nöral izleyiciler birçok nesil boyunca gelişti; erken araştırmalar, buğday tohumu aglütinini (WGA) ve phaseolus vulgaris aglütinini (PHA) anterograd izleyiciler olarak ve florogold (FG), kolera toksin alt birimi B (CTB), karbosiyanin retrograd izleyiciler olarak kabul edildi. Bununla birlikte, viral izleyicilerin aksine, bu geleneksel nöral izleyiciler, eksojen genleri konakçıya entegre edemezler ve hücre tipi seçiciliğine sahip değildirler. Günümüzde, viral strateji, temel sinirbilim araştırmaları sırasında önemli bir öneri haline gelmiştir. Farklı araştırma amaçları için çeşitli viral araçlar seçilebilir 7,8. Transsinaptik olmayan virüsler, trans-multisinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) ve trans-monosinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) vardır. Her kategori, ilgili özelliklere sahip birkaç tür içerir.
Viral uygulama ve ekspresyon süreci oldukça zaman ve kaynak yoğundur, genellikle haftalar veya daha uzun sürer. Çeşitli viral vektörler arasında, adeno-ilişkili virüs, deneysel prosedür için enjeksiyondan 3 ila 8 hafta sonra geniş bir pencere sağlayarak, gen iletimi için umut verici bir araç olarak tanımlanmıştır 7,8. AAV geliştikçe, uygulamadan 2-3 hafta sonra analiz yapılabilir 9,10. Yalancı kuduz virüsü (PRV) ve kuduz virüsü (RV) gibi diğer nöral devre izleyicileri de en az 2-7 günlük bir izleme süresi gerektirir 11,12,13,14,15. Bu nedenle, floresan sinyallerini gözlemlemeden önce enjeksiyon bölgesinin ön doğrulaması hem zaman hem de maliyet açısından etkilidir.
Stereotaksik enjeksiyonların basit ve hızlı bir şekilde doğrulanmasını kolaylaştırmak için, bu çalışmada, viral vektörlerden önce bir boya uygulanır ve kriyoseksiyon, araştırmacıların enjeksiyon bölgesini gözlemlemelerini ve enjeksiyondan sonraki 30 dakika içinde izlemelerini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, stereotaksik beyin enjeksiyonlarının 5,6 doğruluğunu viral izlemeden önce daha hızlı ve basit bir şekilde doğrulamak için istikrarlı bir strateji tanımlamıştır, ancak beyin bölgesindeki raportör gen ekspresyonunun yeri doldurulamaz yönü, beyin bölgesi etiketlemesi için çok önemlidir. Kullandığımız mavi boya, enjeksiyon bölgesinin hemen görselleştirilmesine izin verdi.
Bu protokoldeki birkaç kri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (XY Sun’a 82101249 NO’lu hibe), Çin Doktora Sonrası Araştırma Vakfı (XY Sun’a hibe NO. 2022M722125). Şangay Yelken Programı (SH Chen’e hibe NO. 21YF1425100). Şanghay Belediye Sağlık Komisyonu Klinik Araştırma Özel Projesi (J Zhou’ya 202340088 numaralı hibe). Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (X Zhang’a 82101262 NO’lu hibe, SH Chen’e 82101287 NO’lu hibe).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
