Voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie
Summary
Het huidige protocol beschrijft een praktische strategie om de verificatiestap van stereotaxische injectiecoördinaten te versnellen voordat virale tracering wordt uitgevoerd met behulp van kleurstoffen en bevroren secties.
Abstract
Stereotaxische injectie van een specifiek hersengebied vormt een fundamentele experimentele techniek in de fundamentele neurowetenschappen. Onderzoekers baseren hun keuze van stereotaxische injectieparameters gewoonlijk op muizenhersenatlassen of gepubliceerd materiaal dat verschillende populaties/leeftijden muizen en verschillende stereotaxische apparatuur gebruikte, waardoor verdere validatie van de stereotaxische coördinatenparameters nodig is. De werkzaamheid van calciumbeeldvorming, chemogenetische en optogenetische manipulaties is afhankelijk van de precieze expressie van reportergenen binnen het interessegebied, wat vaak enkele weken inspanning vereist. Het is dus een tijdrovende taak als de coördinaten van het doelhersengebied niet van tevoren worden geverifieerd. Door een geschikte kleurstof te gebruiken in plaats van een virus en cryosecties uit te voeren, kunnen onderzoekers de injectieplaats onmiddellijk na toediening van de kleurstof observeren. Dit vergemakkelijkt tijdige aanpassingen van de coördinatieparameters in gevallen waarin er discrepanties bestaan tussen de werkelijke injectieplaats en de theoretische positie. Dergelijke aanpassingen verbeteren de nauwkeurigheid van de virale expressie in het doelgebied in volgende experimenten aanzienlijk.
Introduction
Bijna alle moderne neuromodulatietools, waaronder in vivo calciumregistratie, optogenetische en chemogenetische tools, vereisen het gebruik van stereotaxische coördinaten om zich te richten op het interessegebied van de hersenen 1,2,3, dat de basis vormt van neurale manipulatie. Stereotaxische coördinaten voor hersengebieden van muizen worden gedefinieerd in relatie tot bregma en lambda, de benige oriëntatiepunten op de schedel, die het zogenaamde schedel-afgeleide stereotaxische coördinatensysteem vormen. Bregma of lambda kan dienen als het nulpunt van de driedimensionale coördinaten. De drie assen zijn anteroposterieur (AP), mediolateraal (ML) en dorsoventraal (DV) en vertegenwoordigen de y-, x- en z-assen op het digitale display van stereotaxische instrumenten. Voor bekende hersengebieden kunnen de stereotaxische coördinatenparameters van een specifiek gebied worden afgeleid uit muizenhersenatlassen4 (bijv. Paxinos en Franklin’s muizenbrein in stereotaxische coördinaten) en/of de gepubliceerde literatuur 5,6. Verdere validatie is echter nodig vanwege variaties in stereotaxische apparatuur en de leeftijd/populaties van muizen die door verschillende onderzoekers worden gebruikt.
Structuur is de basis van functie. Neurale circuits vormen de basis voor veel hersenfuncties, zoals cognitieve activiteiten, emotie, geheugen, sensorische en motorischefuncties1. Het labelen van de structuur en het manipuleren van de activiteit van neurale circuits zijn van vitaal belang voor het begrijpen van de functie van een specifiek neuraal circuit. In de afgelopen decennia zijn neurale tracers door vele generaties heen geëvolueerd; vroeg onderzoek nam tarwekiemagglutinine (WGA) en phaseolus vulgaris-agglutinine (PHA) aan als anterograde tracers, en fluorogold (FG), choleratoxine subeenheid B (CTB), carbocyanine als retrograde tracers. In tegenstelling tot virale tracers kunnen deze traditionele neurale tracers echter geen exogene genen in de gastheer integreren en hebben ze ook geen selectiviteit van het celtype. Tegenwoordig is de virale strategie een belangrijke propositie geworden tijdens fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek. Voor verschillende onderzoeksdoeleinden kunnen verschillende virale tools worden geselecteerd 7,8. Er zijn niet-transsynaptische virussen, trans-multisynaptische virussen (retrograde en anterograde) en trans-monosynaptische virussen (retrograde en anterograde). Elke categorie bevat verschillende typen met respectievelijke kenmerken.
Het proces van virale toediening en expressie is zeer tijdrovend en arbeidsintensief en duurt vaak weken of zelfs langer. Van de verschillende virale vectoren is adeno-geassocieerd virus geïdentificeerd als een veelbelovend middel voor genafgifte, dat een breed venster biedt van 3 tot 8 weken na injectie voor de experimentele procedure 7,8. Naarmate AAV evolueert, kan analyse 2-3 weken na toediening worden uitgevoerd 9,10. Andere neurale circuittracers, zoals het pseudorabiësvirus (PRV) en het rabiësvirus (RV), vereisen ook een traceringsperiode van ten minste 2-7 dagen 11,12,13,14,15. Een voorafgaande verificatie van de injectieplaats voordat fluorescentiesignalen worden waargenomen, is dus zowel tijd- als kosteneffectief.
Om een eenvoudige en snelle verificatie van stereotaxische injecties mogelijk te maken, wordt in deze studie een kleurstof toegediend vóór virale vectoren, en cryosectie stelt onderzoekers in staat om de injectieplaats te observeren en deze binnen 30 minuten na injectie te volgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel heeft een stabiele strategie beschreven om de nauwkeurigheid van stereotaxische herseninjecties 5,6 sneller en eenvoudiger te verifiëren voordat het virus wordt getraceerd, maar het onvervangbare aspect van genexpressie van reporters in het hersengebied is cruciaal voor het labelen van hersengebieden. De blauwe kleurstof die we gebruikten, maakte het mogelijk om de injectieplaats onmiddellijk te visualiseren.
Verschillende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 82101249 aan XY Sun), Postdoctorale onderzoeksstichting van China (subsidie nr. 2022M722125 aan XY Sun). Shanghai Sailing Program (subsidie nr. 21YF1425100 aan SH Chen). Speciaal project voor klinisch onderzoek van de gemeentelijke gezondheidscommissie van Shanghai (subsidie nr. 202340088 aan J Zhou). Nationale Natuurwetenschappelijke Stichting van China (subsidie nr. 82101262 aan X Zhang, subsidie nr. 82101287 aan SH Chen).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
