通过冷冻切片初步验证立体定向注射坐标
Summary
本方案描述了一种实用策略，用于在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪之前加快立体定位注射坐标的验证步骤。
Abstract
特定大脑区域的立体定向注射构成了基础神经科学中的一项基本实验技术。研究人员通常根据小鼠脑图谱或已发表的材料来选择立体定位注射参数，这些材料采用了不同群体/年龄的小鼠和不同的立体定位设备，因此需要进一步验证立体定位坐标参数。钙成像、化学遗传学和光遗传学操作的功效依赖于感兴趣区域内报告基因的精确表达，通常需要数周的努力。因此，如果不事先验证目标大脑区域的坐标，这将是一项耗时的任务。使用适当的染料代替病毒并实施冷冻切片，研究人员可以在染料给药后立即观察注射部位。这有助于在实际注射位置和理论位置之间存在差异的情况下及时调整坐标参数。在随后的实验中，这种调整显著提高了靶区域内病毒表达的准确性。
Introduction
几乎所有现代神经调控工具，包括体内钙记录、光遗传学和化学遗传学工具，都需要使用立体定位坐标来靶向感兴趣的大脑区域 1,2,3，从而形成神经操作的基础。小鼠大脑区域的立体定位坐标是相对于前囟和λ（颅骨上的骨标志）定义的，形成了所谓的颅骨衍生的立体定位坐标系统。bregma 或 lambda 都可以用作三维坐标的零点。这三个轴是前后轴 （AP）、内外侧轴 （ML） 和背腹轴 （DV），代表立体定位仪器数字显示屏上的 y、x 和 z 轴。对于众所周知的大脑区域，特定区域的立体定位坐标参数可以从小鼠脑图谱4（例如，Paxinos和Franklin的小鼠大脑在立体定位坐标中）和/或已发表的文献5,6中获得。然而，由于立体定位设备的变化和不同研究人员使用的小鼠的年龄/群体，需要进一步验证。
结构是功能的基础。神经回路构成了许多大脑功能的基础，例如认知活动、情绪、记忆、感觉和运动功能1.标记结构和操纵神经回路的活动对于理解特定神经回路的功能至关重要。在过去的几十年里，神经示踪剂已经进化了好几代;早期研究采用小麦胚芽凝集素（WGA）和菜豆凝集素（PHA）作为顺行示踪剂，氟金（FG）、霍乱毒素B亚基（CTB）、痰花青作为逆行示踪剂。然而，与病毒示踪剂不同，这些传统的神经示踪剂不能将外源基因整合到宿主中，也不具有细胞类型选择性。如今，病毒策略已成为基础神经科学研究中的一个重要命题。针对不同的研究目的，可以选择各种病毒工具7,8。有非跨突触病毒、反式多突触病毒（逆行和顺行）和跨单突触病毒（逆行和顺行）。每个类别都包含几种具有各自特征的类型。
病毒给药和表达的过程非常耗费时间和资源，通常需要数周甚至更长时间。在各种病毒载体中，腺相关病毒已被确定为一种有前途的基因递送手段，为实验程序提供了注射后 3 至 8 周的广泛窗口 7,8。随着 AAV 的发展，可以在给药后 2-3 周进行分析 9,10。其他神经回路示踪剂，如伪狂犬病病毒 （PRV） 和狂犬病病毒 （RV），也需要至少 2-7 天的追踪期 11,12,13,14,15。因此，在观察荧光信号之前对注射部位进行初步验证既省时又经济。
为了便于简单快速地验证立体定向注射，在这项研究中，在病毒载体之前施用染料，冷冻切片使研究人员能够在注射后 30 分钟内观察注射部位并对其进行追踪。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文描述了一种稳定的策略，可以在病毒追踪之前更快、更简单地验证立体定向脑注射的准确性 5,6，但报告基因在大脑区域表达的不可替代性对于大脑区域标记至关重要。我们使用的蓝色染料可以立即看到注射部位。
该协议中的几个关键步骤有助于提高注射部位的准确性。首先，从步骤1.5开始，确保大脑在立体定位仪中的左右水?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国家自然科学基金（授予孙晓彦82101249项），国家博士后科研工作基金（授予孙晓彦，批准号：2022M722125授予孙晓彦）。上海市帆船项目（授权号：21YF1425100）上海市卫生健康委员会临床研究专项（J 周 202340088 号拨款）.国家自然科学基金（第82101262项授予张旭，第82101287项授予陈旭）。
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
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