クライオセクショニングによる脳定位固定装置注射座標の予備検証
Summary
本プロトコルは、色素および凍結切片を用いてウイルス追跡を行う前に、脳定位固定装置注射座標の検証ステップを迅速化するための実際的な戦略を説明しています。
Abstract
特定の脳領域の定位固定装置注射は、基礎神経科学における基本的な実験手法を構成しています。研究者は通常、マウスの脳アトラスや、さまざまな集団/年齢のマウス、さまざまな定位固定装置を使用した公開資料に基づいて定位固定装置注射パラメータを選択するため、定位固定装置の座標パラメータをさらに検証する必要があります。カルシウムイメージング、化学遺伝学、および光遺伝学的操作の有効性は、関心領域内のレポーター遺伝子の正確な発現に依存しており、多くの場合、数週間の努力が必要です。そのため、目的の脳領域の座標を事前に確認しておかないと手間のかかる作業になります。ウイルスの代わりに適切な色素を使用し、クライオセクショニングを実施することで、研究者は色素投与後すぐに注入部位を観察することができます。これにより、実際の注入部位と理論上の位置との間に不一致がある場合に、パラメータを調整するためのタイムリーな調整が容易になります。このような調整により、その後の実験における標的領域内でのウイルス発現の精度が大幅に向上します。
Introduction
in vivoカルシウム記録、光遺伝学、化学遺伝学など、現代のほぼすべての神経調節ツールは、脳の関心領域を標的とするために定位固定座標の使用を必要としています1,2,3、神経操作の基礎を形成しています。マウスの脳領域の定位固定装置座標は、頭蓋骨の骨のランドマークであるブレグマとラムダに関連して定義され、いわゆる頭蓋骨由来の定位固定装置座標系を形成します。bregma と lambda のどちらかが 3 次元座標のゼロ点として機能します。3つの軸は、前後軸(AP)、中外側軸(ML)、背腹軸(DV)で、脳定位固定装置のデジタルディスプレイ上のy軸、x軸、z軸を表しています。周知の脳領域については、特定の領域の定位固定座標パラメータは、マウス脳アトラス4(例えば、定位座標におけるPaxinosおよびFranklinのマウス脳)および/または公開された文献5,6から得ることができる。ただし、脳定位固定装置のバリエーションや、研究者によって使用されるマウスの年齢/個体群が異なるため、さらなる検証が必要です。
構造は機能の基本です。神経回路は、認知活動、感情、記憶、感覚、運動機能など、多くの脳機能の基盤を形成しています1。神経回路の構造をラベリングし、その活動を操作することは、特定の神経回路の機能を理解するために不可欠です。過去数十年にわたり、ニューラルトレーサーは何世代にもわたって進化してきました。初期の研究では、前向性トレーサーとして小麦胚芽凝集素(WGA)と尋常性凝集素(PHA)が採用され、逆行性トレーサーとしてフルオロゴールド(FG)、コレラ毒素サブユニットB(CTB)、カルボシアニンが採用されました。しかし、ウイルストレーサーとは異なり、これらの従来のニューラルトレーサーは外因性遺伝子を宿主に組み込むことができず、細胞型選択性も持っていません。今日、ウイルス戦略は基礎神経科学研究における重要な命題となっています。さまざまな研究目的のために、さまざまなウイルスツールを選択できます7,8。非トランスシナプスウイルス、トランスマルチシナプスウイルス(逆行性および前行性)、およびトランスモノシナプスウイルス(逆行性および前行性)があります。各カテゴリには、それぞれの特性を持ついくつかのタイプが含まれています。
ウイルスの投与と発現のプロセスは非常に時間とリソースを大量に消費し、多くの場合、数週間またはそれ以上かかります。様々なウイルスベクターの中で、アデノ随伴ウイルスは遺伝子送達の有望な手段として同定されており、実験手順7,8のために注射後3〜8週間の範囲の広いウィンドウを提供する。AAVが進化するにつれて、投与後2〜3週間で分析を行うことができる9,10。偽狂犬病ウイルス(PRV)や狂犬病ウイルス(RV)などの他の神経回路トレーサーも、少なくとも2〜7日の追跡期間を必要とします11,12,13,14,15。したがって、蛍光シグナルを観察する前に注入部位を事前に検証することは、時間と費用対効果の両方が高いです。
定位固定装置による注射を簡単かつ迅速に検証するために、この研究では、ウイルスベクターの前に色素を投与し、クライオ切片により、研究者は注射部位を観察し、注射後30分以内に追跡することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、ウイルス追跡の前に脳定位注射5,6の精度をより迅速かつ簡単に検証するための安定した戦略について説明しましたが、脳領域でのレポーター遺伝子発現のかけがえのない側面は、脳領域の標識にとって非常に重要です。使用した青色の染料により、注射部位を即座に視覚化することができました。
このプロトコ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国国家自然科学基金会(XY Sunに助成金NO.82101249)、中国ポスドク研究基金会(XY Sunに助成金NO.2022M722125)。上海セーリングプログラム(SHチェンへの助成金番号21YF1425100)。上海市衛生健康委員会臨床研究特別プロジェクト(J Zhouに助成金NO.202340088)。中国国立自然科学基金会(X Zhangに助成金NO.82101262、SH Chenに助成金NO.82101287)。
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
References
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