Summary
Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek van orale Candida-infectie bij patiënten met het primaire syndroom van Sjögren, dat kan worden gebruikt voor tijdige behandeling en daarna om gerelateerde complicaties te voorkomen.
Abstract
Het primaire syndroom van Sjögren (pSS) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door symptomen zoals een droge mond, droge ogen en andere systematische symptomen. Vanwege de hyposalivatie die pSS-patiënten ervaren, treedt vaak orale dysbacteriose op. Een veel voorkomende complicatie van pSS is de orale Candida-infectie . In dit artikel beschrijven de auteurs systematische methoden die orale Candida-infectie effectief kunnen diagnosticeren en de Candida-stammen kunnen identificeren met behulp van speeksel, orale slijmvliesuitstrijkjes of mondwater van pSS-patiënten. De Sabouraud's Dextrose Agar (SDA), hyfvormige formatietest, kaliumhydroxide (KOH) uitstrijkje en calcofluorwit (CFW) kleuringstest worden gebruikt voor de diagnose van orale Candida-infectie . Een Candida diagnostische agar wordt gebruikt voor de identificatie van Candida-stammen . Ten slotte worden antischimmelgevoeligheidstests gebruikt om de juiste behandeling met antischimmelgeneesmiddelen te bepalen. Deze gestandaardiseerde methode kan de diagnose, behandeling en toekomstig onderzoek van pSS-gerelateerde orale Candida-infecties verbeteren. Vroege diagnose, met behulp van deze methode, kan ook complicaties voorkomen die optreden als gevolg van vertraging bij het ontvangen van de juiste behandeling.
Introduction
Candidiasis wordt veroorzaakt door Candida spp., dit zijn opportunistische ziekteverwekkers. Veel voorkomende stammen zijn Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis en Candida dubliniensis1. Opportunistische infecties veroorzaakt door Candida spp. omvatten oppervlakkige Candida-infecties en invasieve candidiasis. Invasieve candidiasis komt vooral voor bij immuungecompromitteerde personen; bij patiënten met het verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) kan invasieve candidiasis bijvoorbeeld de kwaliteit van leven of zelfs de levensduur aanzienlijk bedreigen2. Oppervlakkige Candida-infectie , zoals mucocutane candidiasis, komt vaker voor bij patiënten3.
Orale candidiasis, een oppervlakkige Candida-infectie , is de meest voorkomende menselijke schimmelinfectie. Candida albicans is een normale commensale van de mond; het dragerschapspercentage van Candida spp. is gerapporteerd tussen 20% en 75% in de algemene bevolking zonder enige symptomen4. Overgroei van Candida kan leiden tot lokaal ongemak bij patiënten, zoals de veranderde smaak van het gevoel, een branderig gevoel in de mond, dysfagie als gevolg van slechte voeding, vertraagd herstel en langdurig verblijf in het ziekenhuis. Langdurige orale candidiasis kan leiden tot ernstige invasieve candidiasis, met aanzienlijke morbiditeit enmortaliteit tot gevolg. Orale candidiasis kan ook het risico op mondkanker verhogen. Een verminderde speekselklierfunctie is een van de risicofactoren voor orale candidiasis6. De initiatie van infectie is de hechting van Candida aan epitheelcelwanden. Dit wordt gevolgd door de proliferatie en filamentatie van Candida en de vorming en rijping van biofilm7. Biofilms zijn uiterst moeilijk uit te roeien en zijn resistent tegen conventionele antischimmelbehandeling, waardoor klinische behandeling een uitdaging vormt voor biofilm-geassocieerde orale Candida-infectie 7.
Het primaire syndroom van Sjögren (pSS) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door een droge mond, droge ogen en andere systematische symptomen. Een droge mond is het meest voorkomende symptoom van pSS. Speeksel heeft belangrijke fysiologische antischimmelfuncties. Aan de ene kant kan het de mond verdunnen en schuren en vervolgens organismen uit het slijmvlies verwijderen. Aan de andere kant bevat speeksel antimicrobiële eiwitten, zoals lactoferrine, sialoperoxidase, lysozym, histidinerijke polypeptiden en specifieke anti-candida-antilichamen, die kunnen interageren met het mondslijmvlies en de overgroei van Candida6 kunnen voorkomen. De verminderde speekselvloed kan pSS-patiënten vatbaar maken voor orale candidiasis. Uit een observationele cross-sectionele studie bij 61 pSS-patiënten bleek dat 13,1% van de pSS-patiënten orale tekenen van candidiasis vertoonde en dat er een significant en negatief gecorreleerd bleek te zijn met de niveaus van niet-gestimuleerd volledig speeksel (UWS) en gestimuleerd volledig speeksel (SWS)9.
De methoden die in dit manuscript zijn geïntroduceerd, kunnen orale Candida-infectie identificeren op basis van gekarakteriseerde morfologische kenmerken (bijv. de hyfen en gistcellen) in een direct uitstrijkje of na het kweken10. De stamidentificatie van de Candida met behulp van een Candida diagnostische agar is gebaseerd op de vorming van verschillend gekleurde kolonies met een gevarieerde morfologie, die het resultaat zijn van de splitsing van chromogene substraten door soortspecifieke enzymen11. In dit manuscript worden systematische methoden voor het detecteren van orale Candida-infectie geïntroduceerd, waaronder traditionele orale Candida-cultuur en snel onderzoek door middel van kaliumhydroxide (KOH) uitstrijkje en calcofluorwit (CFW) kleuringstest10. Daarnaast is de antischimmelgevoeligheidstest, die als leidraad kan dienen voor de klinische orale behandeling van Candida-infecties . In feitelijke situaties is het niet nodig om alle in dit manuscript geïntroduceerde methoden uit te voeren; de orale Candida-detectiemethode (n) kunnen worden geselecteerd op basis van het doel. Het onderzoek naar orale Candida-infectie en de bepaling van Candida-stammen bij pSS-patiënten komen niet alleen de behandeling van de ziekte ten goede, maar helpen ook bij het beoordelen van de karakterisering van orale candidiasis en de soortprofielen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (NR. KY2023-177-01), en alle patiënten die bij deze studie betrokken waren, gaven geïnformeerde toestemming.
1. In- en uitsluitingscriteria voor patiënten
- Inclusiecriteria: Classificeer patiënten als pSS-patiënten als ze voldoen aan de criteria van het American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR)2016 12. Baseer de definitieve classificatiecriteria specifiek op de gewogen som van vijf items: anti-SSA/Ro-antilichaampositiviteit en focale lymfocytische sialadenitis met een focusscore van ≥ 1 foci/4 mm2, elk met een score van 3; een abnormale oculaire kleuringsscore van ≥ 5 (of van Bijsterveld-score van ≥ 4), een Schirmer's testresultaat van ≤ 5 mm/5 min en een niet-gestimuleerde speekselstroomsnelheid van ≤ 0,1 ml/min, elk met een score van 1. Personen met tekenen en/of symptomen die wijzen op SS en die een totaalscore van ≥ 4 hebben voor de bovenstaande items, voldoen aan de criteria voor pSS.
- Uitsluitingscriteria: Sluit patiënten uit die niet kunnen meewerken aan monsterafname en patiënten die worden behandeld voor orale Candida-infectie .
OPMERKING: Het is essentieel op te merken dat de hieronder beschreven methoden ook geschikt zijn voor de uitgebreide karakterisering van orale Candida-infecties bij personen met secundaire SS. - Neem nauwgezette voorzorgsmaatregelen om mogelijke besmettingen tijdens het verzamelen, vervoeren en kweken van Candida-monsters te voorkomen. Dit omvat een nauwgezette experimentele voorbereiding, het gebruik van steriele materialen voor eenmalig gebruik, de juiste etikettering, een veilige afdichting van bemonsteringsbuisjes en het uitvoeren van experimentele procedures in een professionele bioveiligheidskast.
2. Monstername
- Speekselverzameling: Instrueer de patiënten om de buis met een trechter vast te houden en het speeksel geleidelijk langs de onderlip in de buis te laten stromen. Vraag de patiënt aan het einde van de verzameling om al het resterende speeksel in de mond in de buis te spugen. Verzamel het speeksel gedurende 15 minuten.
- Mondwater en afname van uitstrijkjes: Als de patiënt geen of een extreem lage niet-gestimuleerde speekselvloed heeft (minder dan 0,03 ml/min), veeg dan ten minste 10x het mondslijmvliesgebied met vermoedelijke orale Candida-infectie af en vraag de patiënt vervolgens om 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zie materiaaltabel) te gebruiken om de mond gedurende 1 minuut te spoelen. Bewaar het mondwater in een steriele tube van 50 ml en doe het wattenstaafje in de mondwatertube.
OPMERKING: Voor pSS-patiënten met een niet-gestimuleerde speekselvloed van meer dan 0,03 ml/min kan stap 2.2 nog steeds worden gebruikt om monsters te verzamelen voor orale detectie van Candida-infecties .
3. Verwerking van monsters
- Voeg 1 ml PBS toe aan het verzamelde speeksel. Voeg geen PBS toe aan het mondwater met PBS. Laat de mondwaterslang trillen met behulp van een vortex gedurende 1 minuut.
4. Candida-cultuur
- Om het Sabourand's Agar (SDA) medium te maken, lost u 70 g SDA (zie materiaaltabel) op in 1000 ml dubbel gedestilleerd water.
- Steriel met een autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 min, schoot 10 ml van dit SDA-medium in een microbiologisch kweekschaaltje van 10 cm (zie Materiaaltabel) en laat afkoelen.
- Neem 200 μl monster dat in stap 3 is bereid en strijk het op de microbiologische kweekschaaltjes van 10 cm die in stap 4.2 zijn bereid met 10 ml SDA-medium.
- Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C en de Candida-kolonie zal rijpen. Bewaar het SDA schaaltje met Candida kolonies tijdelijk bij 4 °C. De Candida-kolonies die op de SDA-schaal worden gekweekt, kunnen 2-4 weken worden bewaard.
5. Identificatie van de Candida-stam
- Om het medium te maken, neemt u 47,7 g Candida diagnostische agar (zie materiaaltabel) poeder, doet u het in 1000 ml dubbel gedestilleerd water en verwarmt u het tot 100 °C.
- Als het medium licht kookt, leg dan 10 ml in een microbiologische kweekschaal van 10 cm en laat afkoelen.
- Los de Candida-kolonies op in 500 μL SDA-medium (stap 4), suspendeer en dissocieer door te pipetteren.
- Plaats 50 μL van het monster met Candida-kolonies (stap 5.3) op het medium dat in stap 5.2 is bereid. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C tot de Candida-kolonies volwassen zijn.
- Bepaal aan de hand van de kleur en de patronen van de Candida-kolonies de stam(men) van de verworven Candida van pSS-patiënten. Gebruik de volgende identificatiecriteria voor Candida-stammen : de smaragdgroene kolonie is Candida albicans, de blauwgrijze kolonie is Candida tropicalis, de roze kolonies met pluizige randen en microvilli zijn Candida krusei, de paarsrode kleine kolonie is Candida glabrata, de melkwitte kolonie bevat verschillende stammen, waaronder Candida parapsilosis.
6. Candida biofilm vorming assay
- Om de gist Stikstof Base (YNB)-50 glucose (G) medium te maken, weegt u 1,34 g YNB (zie materiaaltabel) en 1,98 g D (+)-glucose (zie materiaaltabel). Los ze op in 200 ml dubbel gedestilleerd water.
- Om de YNB-100G medium te maken, neemt u 1,34 g YNB en 3,96 g D (+)-glucose en lost u deze op in 200 ml dubbel gedestilleerd water.
- Filtreer de oplossingen met een spuitfilter van 0,22 μm (zie Materiaaltabel). Het gefilterde medium YNB-50G en YNB-100G kan 3 maanden bij 4 °C worden bewaard.
- Kies de 3 (of meer) kolonies van dezelfde belasting op de gerechten in stap 5 en breng ze over in 200 μL YNB-50G-medium (stappen 6.1 en 6.3) in een plaat met 96 putjes (zie Materiaaltabel). Doe dit voor de stammen die in het gerecht worden waargenomen. Cultuur 's nachts bij 37 °C met schudden bij 200 tpm.
- Zuig de Candida-suspensie op, voeg 1 ml PBS toe, centrifugeer de gistcellen bij 1500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Herhaal deze stap 2x in dezelfde tube.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml YNB-100G medium en bereid verschillende verdunningen (1:10, 1:100 en 1:1000) van de cellen. Neem 200 μL gradiëntcelsuspensie en leg deze op het 10 cm SDA-medium met behulp van de spiraalplaatmethode13. Het plateren gebeurt met behulp van een machine die een bekend volume monster in een steeds kleiner wordende hoeveelheid op een roterende agarplaat deponeert in de vorm van een Archimedes-spiraal. Kweek gedurende 24-48 uur bij 37 °C.
- Bereken de concentratie van cellen in verschillende verdunningen op basis van het aantal kve's in de SDA-plaat op basis van een standaardmethode13. Tel kort de goed gescheiden kolonies op elk bord. Tel de kolonies in één octant vanaf de buitenrand naar het midden totdat er minstens 25 kolonies zijn waargenomen. Tel ook de rest van die boog waar de 25etelling plaatsvond . Bereken de concentratie van de cellen door het aantal kolonies te delen door het vloeistofvolume dat overeenkomt met het gebied waarover het aantal kolonies is verkregen13. Pas de concentratie van cellen aan naar 1 x 107 cellen/ml.
- Doe 100 μL van de celsuspensie in YNB-100G in een plaat met 96 putjes en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur terwijl het schudt bij 200 tpm.
- Haal voorzichtig het supernatant eruit, was 2x met PBS en verwijder de drijvende gistcellen. De Candida-biofilm vormt zich op de bodem van de plaat met 96 putjes.
7. Analyse van de hyfale formatie
OPMERKING: Alleen Candida die hyfen kunnen vormen (zoals Candida albicans) kunnen worden geïnduceerd voor de vorming van hyfen. Ga naar stap 8 voor verdere karakterisering van Candida die geen hyfen kunnen vormen (zoals Candida glabrata).
- Resuspendeer de gistcelsuspensie in stap 6.6 en pas de celconcentratie aan tot 1 x 106 cellen/ml met YNB-100G medium.
- Om het volledige groeimedium van RPMI 1640 te bereiden, voegt u 50 ml foetaal runderserum (zie materiaaltabel) toe aan 450 ml RPMI 1640-medium (zie materiaaltabel) en bewaart u bij 4 °C voor verder experiment.
- Breng 2 μL Candida-celsuspensie verdund in 200 μL RPMI 1640 compleet groeimedium over in een plaat met 96 putjes en kweek een nacht bij 37 °C om de schimmeldraden en gistcellen te laten vormen.
8. KOH-uitstrijkje en CFW-kleuringstest
- Neem 1 μL monsters uit stap 3 of stap 6 of stap 7 met behulp van een nauwkeurig gegoten lus (zie Materiaaltabel) en smeer een gebied van 1 cm x 1 cm op de glasplaatjes. Wacht tot het op kamertemperatuur is opgedroogd.
- Om 10% KOH-oplossing te maken, weegt u 10 g KOH-poeder af (zie materiaaltabel) en lost u dit op in 100 ml dubbel gedestilleerd water.
- Verwarm het glaasje lichtjes met een alcohollamp tot het preparaat is opgelost. Kleur de in stap 8.1 geprepareerde objectglaasjes met 10% KOH (stap 8.2) en dek af met een dekglaasje. Druk lichtjes op het afdekglaasje om het monster transparant te maken.
- Visualiseer de schimmeldraden en gistcellen onder de microscoop.
- Vlek objectglaasjes die in stap 8.1 zijn voorbereid met een druppel CFW (zie Materiaaltabel), dek af met een dekglaasje en wacht 1 minuut.
- Visualiseer de hyfen met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij vergrotingen van 100x en 200x. CFW wordt geëxciteerd bij 355 nm en gedetecteerd bij 300-440 nm. Fotografeer de beelden onder de belichtingstijd. Herhaal dit 3x om vals-positieve resultaten te voorkomen.
9. Test op gevoeligheid tegen schimmel
OPMERKING: Deze test wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant voor de gistachtige schimmelgevoeligheidskit (microverdunning; zie materiaaltabel).
- Bereid Candida-kolonies (stap 4) van minder dan 4 dagen oud voor met de 0,85% NaCl-ampul (zie materiaaltabel) en verkrijg de suspensie met een troebelheid die overeenkomt met 2 McFarland. Bepaal de troebelheid volgens de McFarland Standards Kit (zie Tabel met materialen). Gebruik de voorbereide Candida suspensie onmiddellijk.
- Pipetteer 135 μL ATB F2-medium in de kit met 3 x 10 4 gistcellen/ml in elk napje in de teststrip en doe het deksel erop. Doe de teststrip in een afgesloten container. Kweek gedurende 24 uur bij 35 °C.
- Observeer de groei van de Candida met visuele interpretatie (raadpleeg de gebruikershandleiding). Raadpleeg de gebruikershandleiding voor de referentiewaarde (referentiebereik). Controleer of het controlegat voldoende groeit. Als de groei van het controlegat onvoldoende is of niet groeit, kunnen de resultaten niet worden afgelezen en is nog 24 uur teelt nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden 12 patiënten met pSS geselecteerd als representatieve patiënten en gescreend op orale Candida-infectie (tabel 1). Onder deze patiënten vertoonden sommige patiënten typische orale laesies van Candida-infectie , waaronder hoekige cheilitis (gekenmerkt door scheuren in de mondhoeken, afschilfering en hyperemie, Figuur 1A), helderrood oedeem op het tandvleesslijmvlies, geelachtig wit draderig pseudomembraan (Figuur 1B), linguale papilla-atrofie en helderrood dorslijmvlies van de tong (Figuur 1C).
Van deze 12 patiënten die bij de huidige studie betrokken waren, hadden er 8 een orale Candida-infectie, wat werd bevestigd door de groei van Candida-kolonies op de SDA-schalen (Figuur 2A-C en aanvullende figuur 1). De diagnostische agar toonde aan dat orale Candida-infecties van Candida albicans, Candida krusei en Candida glabrata voorkomen bij deze pSS-patiënten (Figuur 2D-F, Aanvullende Figuur 2A,B). In sommige gevallen werd meer dan één soort Candida gedetecteerd, zoals een combinatie-infectie met Candida albicans en Candida krusei, evenals een combinatie-infectie met Candida albicans en Candida glabrata (Figuur 2D, aanvullende figuur 2A,B).
Het KOH-uitstrijkje en de daaropvolgende CFW-kleuringstest, waarbij gebruik wordt gemaakt van speeksel van de patiënt of orale slijmvliesuitstrijkjes, kunnen snel bepalen of de patiënt een orale Candida-infectie heeft. In deze studie werd de aanwezigheid van hyfen waargenomen in beide orale monsters van pSS-patiënten (Figuur 3A,B). De bevinding werd verder gevalideerd door de CFW-kleuringstest, die fluorescerende positieve kleuring van de hyfen vertoonde (Figuur 3C,D). Bovendien werden de hyfen van een pSS-patiënt geïnfecteerd met orale Candida albicans induceerbaar via de hyfalenvormingstest (Figuur 4A), en werden de geïnduceerde hyfen waargenomen onder de fluorescentiemicroscoop in de CFW-kleuringstest (Figuur 4D). Bovendien gaven het KOH-uitstrijkje en de CFW-kleuringstest positieve schimmelsporen en pseudohypha aan van een pSS-patiënt met Candida krusei-infectie (Figuur 4B,E) en schimmelsporen van een pSS-patiënt met Candida glabrata-infectie (Figuur 4C,F), na de vorming van de Candida-biofilm.
Het testen op gevoeligheid voor schimmel is cruciaal bij het begeleiden van de klinische behandeling van orale Candida-infecties bij patiënten met pSS. Hier werden drie representatieve patiënten getest op antischimmelgevoeligheid voor vijf vaak voorgeschreven middelen: fluconazol, itraconazol, amfotericine B, voriconazol en 5-fluconazol. De resultaten werden geïnterpreteerd volgens de richtlijnen van de fabrikant. pSS-patiënten 1 en 3 vertoonden gevoeligheden voor alle geteste antischimmelmiddelen (tabel 1)14,15. pSS-patiënt 2 vertoonde een dosisafhankelijke intermediaire respons op fluconazol en voriconazol, een dosisafhankelijke, gemiddelde tot resistente gevoeligheid voor itraconazol, resistentie voor 5-fluconazol en gevoeligheid voor behandeling met amfotericine B (tabel 2)14,15.
Figuur 1: Representatieve orale manifestaties van orale Candida-infectie . (A) Hoekige cheilitis (rhagades in de mondhoeken, afschilfering en hyperemie). (B) Een erythemateuze laesie met oedeem op het alveolaire tandvleesslijmvlies, met een geelachtig wit draderig pseudomembraan. (C) Atrofisch dorsum van linguale papillen met verspreide en onregelmatige, rode en begrensde atrofische erytheemlaesie. Zwarte pijlen wijzen naar de laesies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Identificatie van Sabouraud-dextrose-agar (SDA) en Candida-stammen . (A-C) De SDA-kweek van orale monsters (speeksel, PBS-mondwater of orale slijmvliesswap) van 3 representatieve pSS-patiënten met Candida-infectie . De identificatietest van de Candida-stam met behulp van een diagnostische agar van Candida toont pSS-patiënten met orale (D) Candida albicans plus Candida Krusei-infecties , (E) Candida albicans-infectie en (F) Candida glabrata-infectie . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Onmiddellijke kaliumhydroxide (KOH) uitstrijkje en calcofluor wit (CFW) kleuringstest. De test werd uitgevoerd met behulp van orale monsters (speeksel, PBS-mondwater of mondslijmvliesswap) van 2 representatieve pSS-patiënten. KOH-uitstrijkje met behulp van het orale monster van (A) pSS-patiënt 1 en (B) pSS-patiënt 2. Zwarte, holle pijlen wijzen naar de hyfen. CFW-kleuringstest met behulp van het orale monster van (C) pSS-patiënt 1 en (D) pSS-patiënt 2. Witte holle pijlen wijzen naar de hyfen en schimmelsporen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kaliumhydroxide (KOH) uitstrijkje, calcofluorwit (CFW) kleuringstest van monsters na kweek. KOH-uitstrijkje met speeksel van pSS-patiënt met (A) Candida albicans-infectie , (B) pSS-patiënt met Candida krusei-infectie en (C) pSS-patiënt met Candida glabrata-infectie . CFW-kleuringstest van geïnduceerde hyfen van pSS-patiënt met (D) Candida albicans-infectie , schimmelsporen en pseudo-hyfen van (E) pSS-patiënt met Candida krusei-infectie en schimmelsporen van (F) pSS-patiënt met Candida glabrata-infectie . Witte holle pijlen wijzen naar de hyfen; Witte ononderbroken pijlen wijzen naar de pseudo-hyfen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Representatieve Sabouraud-dextrose-agar (SDA)-cultuur met behulp van orale monsters van pSS-patiënten (speeksel, PBS-mondwater of orale slijmvliesswap). (A-C) SDA-kweek van Candida met behulp van orale monsters van 3 representatieve pSS-patiënten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Identificatie van de Candida-stam . De identificatie van de mogelijk geïnfecteerde Candida van de 12 pSS-patiënten met behulp van een Candida diagnostische agar. (A) De identificatie van de Candida-stam met behulp van orale monsters van pSS-patiënten 1-6. pSS patiënt 1: Candida albicans, 2: Candida albicans, 3: Candida albicans en Candida krusei, 4: Candida albicans, 5: Candida albicans en Candida glabrata, 6: geen orale Candida-infectie . (B) De identificatie van de Candida-stam met behulp van orale monsters van pSS-patiënten 7-12. pSS-patiënt 7: Candida albicans, 8: Candida albicans en Candida glabrata, 9: geen orale Candida-infectie , 10: Candida albicans, 11: geen orale Candida-infectie , 12: geen orale Candida-infectie . Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 1: Informatie van patiënten met het primaire syndroom van Sjögren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Testresultaten voor antischimmelgevoeligheid van de patiënten14,15. Afkortingen: S = gevoelig, I = gemiddeld, R = resistent, SDD = dosisafhankelijk gevoelig, C = concentratie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige manuscript bieden we een reeks systematische, eenvoudige en haalbare methoden voor het detecteren van orale Candida-infecties , het identificeren van Candida-stammen en het testen van de antischimmelgevoeligheid van veelgebruikte geneesmiddelen bij patiënten met pSS.
In de praktijk zijn niet alle methoden die in dit manuscript worden geïntroduceerd nodig. De orale Candida-detectiemethode (n) kunnen worden gekozen op basis van het specifieke doel. KOH-uitstrijkjes en CFW-kleuringstests, met behulp van monsters zonder kweek, kunnen snel en voorlopig de aanwezigheid van orale Candida-infectie bij pSS-patiënten bepalen. Deze methoden hebben echter een relatief hoog percentage vals-negatievemins-naars-16. Als het moeilijk is om de infectie te bevestigen, is het kweken van Candida essentieel. Resistentie tegen geneesmiddelen is een factor waarmee tijdens de behandeling rekening moet worden gehouden; sommige Candida-stammen zijn van nature resistent tegen sommige antischimmelmiddelen, bijv. Candida krusei is van nature resistent tegen de behandeling met Fluconazol17. Daarom moet soms de stam van Candida worden geïdentificeerd. In dit geval kan de Candida-stam worden geïdentificeerd door een Candida-diagnostische agar. Momenteel krijgt de resistente Candida steeds meer aandacht18. De antischimmelgevoeligheidstest kan de behandeling begeleiden en zo resistentie tegen geneesmiddelen tijdens de behandeling zoveel mogelijk voorkomen. De Candida biofilmvormingstest en hyphalvormingstest zijn geschikt voor onderzoek met betrekking tot orale Candida-infectie .
Orale Candida-infectie is een van de meest voorkomende complicaties bij pSS-patiënten4 en heeft een aanzienlijke invloed op hun kwaliteit van leven vanwege de reeks symptomen die het veroorzaakt. Met name pSS-patiënten zijn zeer vatbaar voor deze infectie, en een effectieve behandeling vereist vaak systemische therapie en samenwerking met depatiënt19. Bijgevolg komen orale Candida-infecties vaak terug in deze populatie. Het is van cruciaal belang om orale candidiasis te identificeren en antischimmelgevoeligheidstests uit te voeren om de behandeling te begeleiden. Van de methoden die in dit manuscript worden beschreven, zijn het verzamelen van orale monsters voor Candida-detectie en daaropvolgende kweek de meest kritieke stappen.
Bovendien kan Candida met hyfale vorming (zoals Candida albicans) gemakkelijk worden gedetecteerd door de snelle KOH-uitstrijktest en CFW-kleuringstest met behulp van verzamelde monsters zonder te kweken. Hoewel de meeste orale Candida-infecties kunnen worden gedetecteerd en de Candida-stammen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de methoden die in dit manuscript zijn geïntroduceerd, kunnen sommige Candida-stammen niet worden geïdentificeerd van andere, specifiek alleen door methoden zoals SDA-cultuur, Candida-diagnostische agarcultuur, Candida-biofilmvormingstest en hyphal-vormingstest. Bovendien kunnen sommige Candida-stammen niet worden geïnduceerd om hyfen te produceren, zoals Candida glabrata. De 18s rDNA RT-PCR-gebaseerde soortidentificatie kan Candida-soorten nauwkeurig identificeren op basis van hun genetische gelijkenis 10,20,21. Indien nodig kan de 18s rDNA RT-PCR-gebaseerde soortidentificatie worden gebruikt, bijvoorbeeld in onderzoek naar orale Candida-infectie bij pSS-patiënten.
Intraoraal kan de manifestatie van Candida-infectie zich presenteren als erythemateuze mucosale laesies, prothesestomatitis en de kloven van de tong. In het periorale gebied veroorzaakt de kolonisatie van Candida een droog, gebarsten en erythemateus uiterlijk7. De gerapporteerde prevalentie van klinische orale candidiasis varieert sterk bij SS-patiënten, variërend van 0% tot 80%. De mogelijke redenen voor de grote variatie van orale candidiasis zijn onder meer het ontbreken van duidelijke symptomatologie en, nog belangrijker, de verschillende criteria die in de literatuur worden gebruikt voor de diagnose van orale candidiasis 8,9,12. Bovendien wordt gemeld dat patiënten met een Candida-infectie een hoger risico op SS hebben, en Candida-infectie kan fungeren als een vroeg teken van latere SS22. Vroege diagnose van pSS is cruciaal voor de behandeling en de pathologische studie. Daarom is het absoluut noodzakelijk om universele, gemakkelijke en haalbare methoden te bieden om orale Candida-infectie bij pSS-patiënten te identificeren.
Hoewel dysbiose in het darm-, orale en vaginale microbioom vaak voorkomt bij pSS-patiënten, vertonen orale monsters de grootste mate van microbiëlevariatie1. Onder normale omstandigheden is de gemiddelde dagelijkse stroom van heel speeksel 1 tot 1,5 L2. Tot 99% van het speeksel bestaat uit water en de resterende 1% bestaat uit eiwitten en ionen. Speeksel speelt naar verluidt ommeerdere redenen een belangrijke rol bij het bepalen van de samenstelling en activiteit van de orale microbiota. Speeksel reinigt niet alleen continu de tanden en voert cruciale mondhygiënefuncties uit in gezonde omstandigheden, maar het vormt ook een verzorgende film op orale oppervlakken. Deze film biedt receptoren voor de aanhechting van bacteriën, helpt bij de groei van bacteriën door ze te voorzien van voedingsstoffen uit glycoproteïnen en handhaaft een geschikte pH voor bacteriegroei. Bovendien bevat speeksel antimicrobiële en anti-candida-factoren die de microbiota reguleren en vormgeven. Bovendien bevat speeksel antimicrobiële en anti-candida-factoren, zoals adrenomedullin, statherine, histatines, α-defensines, lysozym, histatines, lactoferrine en calprotectine, die de microbiota reguleren en vormgeven4. pSS wordt gekenmerkt door auto-immuunderegulatie en glandulaire hypofunctie. Hyposalivatie, een vermindering van de speekselvloed, is een van de meest voorkomende symptomen van pSS. Verlaagde pH-waarden en bloeding van het speeksel zijn belangrijke risicofactoren voor orale Candida-infecties5. Bovendien worden Candida-infecties gerapporteerd als de op één na meest voorkomende orofaciale complicatie geassocieerd met SS6. De auteurs suggereren dat de verhoogde Candida-infecties bij pSS-patiënten niet alleen verband kunnen houden met een verminderde speekselproductie, maar ook met de immunologische deregulatie die inherent is aan SS.
Concluderend zijn praktische en reproduceerbare methoden voor orale Candida-infectie en antischimmelgevoeligheidstests die in dit manuscript zijn geïntroduceerd, veelbelovend voor het verbeteren van de klinische identificatie en behandeling van Candida-infecties . Bovendien kunnen deze gestandaardiseerde procedures inconsistenties in onderzoeken met betrekking tot orale candidiasis minimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82201084), China Postdoctoral Science Foundation (2022M722232), Beijing Postdoctoral Research Foundation (2023-ZZ-020), Miaopu Project van Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (2023MP10) en General Research Fund, Hong Kong Research Grants Council (27111820 en 17116521).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
- Wang, X., et al. Microbiota dysbiosis in primary Sjögren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine. Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).
- Humphrey, S. P., Williamson, R. T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. The power of saliva: Antimicrobial and beyond. PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).
- Serrano, J., et al. Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sjögren's syndrome. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).
- Napeñas, J. J., Rouleau, T. S.
- Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. Sjögren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care. Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).
- Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).
- Alam, M. Z., et al. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology. World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).
- Bauters, T. G., Nelis, H. J. Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species. J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).
- Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarcón-Segovia, D., Kraus, A. Oral candidiasis and Sjögren's syndrome. J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).
- Biomerieux. ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204. Biomerieux. , (2014).
- Zhang, L., et al. The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs. PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).
- Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test. Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).
- Samaranayake, L. P. Candida krusei infections and fluconazole therapy. Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).
- Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).
- Rihab, B., Lina, E. H., Noémie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences. BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).
- Panpetch, W., et al. Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium. PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).
- Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis. Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).
- Chen, C. L., et al. Candida infection as an early sign of subsequent Sjögren's syndrome: A population-based matched cohort study. Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).
