Summary
Här presenterar vi ett protokoll för undersökning av oral Candida-infektion hos patienter med primär Sjögrens syndrom, som kan användas för snabb behandling och därefter för att undvika relaterade komplikationer.
Abstract
Primärt Sjögrens syndrom (pSS) är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av symtom som muntorrhet, torra ögon och andra systematiska symtom. På grund av den hyposalivation som upplevs av pSS-patienter förekommer ofta oral dysbakterier. En vanlig komplikation av pSS är den orala Candida-infektionen . I den här artikeln beskriver författarna systematiska metoder som effektivt kan diagnostisera oral Candida-infektion och identifiera Candida-stammarna med hjälp av saliv, orala slemhinnepinnar eller munvatten från pSS-patienter. Sabourauds Dextrose Agar (SDA), hyfbildningsanalys, kaliumhydroxid (KOH) utstrykstest och calcofluor white (CFW) färgningsanalys används för diagnos av oral Candida-infektion . En Candida diagnostisk agar används för identifiering av Candida-stammar . Slutligen används resistensbestämning mot svamp för att bestämma lämplig behandling med svampdödande läkemedel. Denna standardiserade metod kan förbättra diagnos, behandling och framtida forskning om pSS-relaterade orala Candida-infektioner . Tidig diagnos, med hjälp av denna metod, kan också förhindra eventuella komplikationer som uppstår på grund av fördröjning av att få lämplig behandling.
Introduction
Candidiasis orsakas av Candida spp., som är opportunistiska patogener. Vanliga stammar är Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsillosis och Candida dubliniensis1. Opportunistiska infektioner orsakade av Candida spp. inkluderar ytliga Candida-infektioner och invasiv candidiasis. Invasiv candidiasis förekommer främst hos personer med nedsatt immunförsvar; Hos patienter med förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) kan invasiv candidiasis till exempel avsevärt hota livskvaliteten eller till och med livslängden2. Ytlig Candida-infektion , såsom mukokutan candidiasis, är vanligare hos patienter3.
Oral candidiasis, en ytlig Candida-infektion , är den vanligaste svampinfektionen hos människor. Candida albicans är en normal kommensalal av munnen; Bärarfrekvensen för Candida spp. har rapporterats variera mellan 20 % och 75 % i den allmänna befolkningen utan några symtom4. Överväxt av Candida kan leda till lokalt obehag hos patienter, såsom förändrad smak av känsel, brännande känsla i munnen, dysfagi på grund av dålig näring, fördröjd återhämtning och förlängd sjukhusvistelse. Långvarig oral candidiasis kan leda till allvarlig invasiv candidiasis, vilket resulterar i betydande sjuklighet och dödlighet5. Oral candidiasis kan också öka risken för muncancer5. Nedsatt spottkörtelfunktion är en av riskfaktorerna för oral candidiasis6. Initieringen av infektion är vidhäftningen av Candida till epitelcellväggar. Detta följs av proliferation och filamentation av Candida och bildandet och mognaden av biofilm7. Biofilmer är extremt svåra att utrota och är resistenta mot konventionell svampdödande behandling, vilket gör klinisk behandling till en utmaning för biofilmsassocierad oral Candida-infektion 7.
Primärt Sjögrens syndrom (pSS) är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av muntorrhet, torra ögon och andra systematiska symtom8. Muntorrhet är det vanligaste symtomet på pSS. Saliven har viktiga fysiologiska svampdödande funktioner. Å ena sidan kan den späda ut och skura munnen och därefter ta bort organismer från slemhinnan. Å andra sidan innehåller saliv antimikrobiella proteiner, såsom laktoferrin, sialoperoxidas, lysozym, histidinrika polypeptider och specifika anti-candidala antikroppar, som kan interagera med munslemhinnan och förhindra överväxt av Candida6. Det minskade salivflödet kan predisponera pSS-patienter för oral candidiasis. En observationstvärsnittsstudie utförd på 61 pSS-patienter fann att 13,1 % av pSS-patienterna uppvisade orala tecken på candidiasis och att kolonibildande enhet (CFU)/ml av Candida albicans visade sig vara signifikant och negativt korrelerad med nivåer av ostimulerad hel saliv (UWS) och stimulerad hel saliv (SWS)9.
Metoderna som introduceras i detta manuskript kan identifiera oral Candida-infektion baserat på karakteriserade morfologiska egenskaper (t.ex. hyfer och jästceller) i direkt utstryk eller efter odling10. Stamidentifieringen av Candida med hjälp av en Candida-diagnostisk agar baseras på bildandet av olikfärgade kolonier med varierad morfologi, som är resultatet av klyvning av kromogena substrat av artspecifika enzymer11. I detta manuskript introduceras systematiska metoder för att detektera oral Candida-infektion, inklusive traditionell oral Candida-odling och snabb undersökning med kaliumhydroxid (KOH) utstrykstest och calcofluor white (CFW) färgningsanalys10. Dessutom har det svampdödande känslighetstestet, som kan vägleda klinisk behandling av orala Candida-infektioner, introducerats. I verkliga situationer är det inte nödvändigt att utföra alla de metoder som introduceras i detta manuskript; de orala Candida-detektionsmetoderna kan väljas i enlighet med syftet. Undersökningen av oral Candida-infektion och bestämningen av Candida-stammar hos pSS-patienter gynnar inte bara sjukdomsbehandlingen utan hjälper också till att bedöma karakteriseringen av oral candidiasis och artprofilerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs nedan godkändes av den etiska kommittén vid Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (NO. KY2023-177-01), och alla patienter som var involverade i denna studie gav informerat samtycke.
1. Kriterier för patientinklusion och exklusion
- Inklusionskriterier: Klassificera patienter som pSS-patienter om de uppfyller 2016 års kriterier från American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR)12. Specifikt basera de slutliga klassificeringskriterierna på den viktade summan av fem objekt: anti-SSA/Ro-antikroppspositivitet och fokal lymfocytisk sialadenit, med en fokuspoäng på ≥ 1 foci/4 mm2, där var och en får 3 poäng; ett onormalt okulärt färgningsresultat på ≥ 5 (eller van Bijsterveld-poäng på ≥ 4), ett Schirmers testresultat på ≤ 5 mm/5 min och ett ostimulerat salivflöde på ≤ 0,1 ml/min, där var och en får 1 poäng. Individer med tecken och/eller symtom som tyder på SS och som har en totalpoäng på ≥ 4 för ovanstående punkter uppfyller kriterierna för pSS.
- Exklusions kriterier: Exkludera patienter som inte kan samarbeta med provtagning och patienter som får behandling för oral Candida-infektion .
OBS: Det är viktigt att notera att metoderna som beskrivs nedan också är lämpliga för omfattande karakterisering av orala Candida-infektioner hos individer med sekundär SS. - För att förhindra potentiella kontamineringar under insamling, transport och odling av Candida-prover , vidta noggranna försiktighetsåtgärder. Detta inkluderar noggrann experimentell förberedelse, användning av sterila material för engångsbruk, korrekt märkning, säker tätning av provtagningsrör och genomförande av experimentella procedurer i ett professionellt biosäkerhetsskåp.
2. Insamling av prover
- Salivuppsamling: Instruera patienterna att hålla röret med en tratt och låta saliven gradvis rinna in i röret längs underläppen. I slutet av insamlingen, be patienten att spotta ut all återstående saliv i munnen i röret. Samla upp saliven i 15 min.
- Munskölj och pinnuppsamling: Om patienten inte har något eller extremt lågt ostimulerat salivflöde (mindre än 0,03 ml/min), svabba munslemhinneområdet med misstänkt oral Candida-infektion minst 10 gånger, be sedan patienten att använda 5 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; se materialtabell) för att skölja munnen i 1 min. Förvara munvattnet i ett 50 ml sterilt rör och sätt pinnen i munsköljröret.
OBS: För pSS-patienter med ett ostimulerat salivflöde på mer än 0,03 ml/min kan steg 2.2 fortfarande användas för att samla in prover för att upptäcka orala Candida-infektioner .
3. Bearbetning av prover
- Tillsätt 1 ml PBS till den uppsamlade saliven. Tillsätt inte PBS i munvattnet med PBS. Vibrera munsköljröret med en virvel i 1 min.
4. Candida-kulturen
- För att göra Sabourand's Agar (SDA) medium, lös upp 70 g SDA (se Materialtabell) i 1000 ml dubbeldestillerat vatten.
- Sterilisera med en autoklav vid 121 °C i 15 minuter, platta 10 ml av detta SDA-medium i en 10 cm mikrobiologisk odlingsskål (se Materialtabell) och låt svalna.
- Ta 200 μl av det prov som beretts i steg 3 och stryk det över de 10 cm stora mikrobiologiska odlingsformarna som beretts med 10 ml SDA-medium i steg 4.2.
- Inkubera i 48 timmar vid 37 °C och Candida-kolonin kommer att mogna. Förvara SDA-skålen tillfälligt med Candida-kolonier vid 4 °C. Candida-kolonierna som odlas på SDA-rätten kan lagras i 2-4 veckor.
5. Identifiering av Candida-stammen
- För att göra mediet, ta ut 47,7 g Candida diagnostisk agar (se materialtabell) pulver, lägg det i 1000 ml dubbeldestillerat vatten och värm det till 100 °C.
- När mediet kokar lätt, lägg 10 ml i en 10 cm mikrobiologisk odlingsform och låt svalna.
- Lös upp Candida-kolonierna i 500 μL SDA-medium (steg 4), suspendera och dissociera genom pipettering.
- Platta 50 μL av provet med Candida-kolonier (steg 5.3) på det medium som beretts i steg 5.2. Inkubera i 48 timmar vid 37 °C tills Candida-samhällena är mogna.
- Enligt färgen och mönstren hos Candida-kolonierna , bestäm stammen/stammarna av den förvärvade Candida från pSS-patienter. Använd följande kriterier för identifiering av Candida-stammar : den smaragdgröna kolonin är Candida albicans, den blågrå kolonin är Candida tropicalis, de rosa kolonierna med suddiga kanter och mikrovilli är Candida krusei, den lilaröda lilla kolonin är Candida glabrata, den mjölkvita kolonin innehåller flera stammar inklusive Candida parapsilosis.
6. Analys av Candida-biofilmbildning
- För att göra jästkvävebasen (YNB)-50 glukos (G) medium, väg 1,34 g YNB (se materialtabell) och 1,98 g D (+)-glukos (se materialtabell). Lös upp dem i 200 ml dubbeldestillerat vatten.
- För att göra YNB-100G medium, ta ut 1,34 g YNB och 3,96 g D (+)-glukos och lös upp dem i 200 ml dubbeldestillerat vatten.
- Filtrera lösningarna med ett 0,22 μm sprutfilter (se Materialförteckning). Det filtrerade YNB-50G- och YNB-100G-mediet kan förvaras vid 4 °C i 3 månader.
- Plocka de 3 (eller fler) kolonierna från samma stam på disken i steg 5 och överför dem till 200 μL YNB-50G-medium (steg 6.1 och 6.3) i en 96-hålsplatta (se Materialtabell). Gör detta för de stammar som observeras i rätten. Odling över natten vid 37 °C med skakning vid 200 rpm.
- Aspirera Candida-suspensionen , tillsätt 1 ml PBS, centrifugera jästcellerna vid 1500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten. Upprepa detta steg 2 gånger i samma rör.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml YNB-100G-medium och förbered olika utspädningar (1:10, 1:100 och 1:1000) av celler. Ta 200 μL gradientcellssuspension och platta den på 10 cm SDA-mediet med spiralplattmetoden13. Pläteringen görs med hjälp av en maskin som deponerar en känd volym prov på en roterande agarplatta i en ständigt minskande mängd i form av en Arkimedesspiral. Odling i 24-48 timmar vid 37 °C.
- Beräkna koncentrationen av celler i olika utspädningar enligt antalet CFU:er i SDA-plattan baserat på en standardmetod13. Räkna kortfattat de väl separerade kolonierna på varje platta. Räkna kolonierna i en oktant från ytterkanten mot mitten tills minst 25 kolonier observeras. Räkna också resten av den bågen där den 25:e räkningen inträffade. Beräkna koncentrationen av cellerna genom att dividera antalet kolonier med den vätskevolym som motsvarar det område över vilket antalet kolonier erhölls13. Justera koncentrationen av celler till 1 x 107 celler/ml.
- Placera 100 μL av cellsuspensionen i YNB-100G i en platta med 96 brunnar och inkubera vid 37 °C i 2 timmar medan du skakar vid 200 rpm.
- Ta försiktigt ut supernatanten, tvätta 2 gånger med PBS och få bort de flytande jästcellerna. Candida-biofilmen bildas i botten av plattan med 96 brunnar.
7. Analys av hyfbildning
OBS: Endast Candida som kan bilda hyfer (t.ex. Candida albicans) kan induceras för hyfbildning. Gå till steg 8 för ytterligare karakterisering av Candida som inte kan bilda hyfer (t.ex. Candida glabrata).
- Återsuspendera jästcellssuspensionen i steg 6.6 och justera cellkoncentrationen till 1 x 106 celler/ml med YNB-100G medium.
- För att bereda det kompletta odlingsmediet RPMI 1640, tillsätt 50 ml Fetal Bovine Serum (se Materialtabell) till 450 ml RPMI 1640 medium (se Materialtabell) och förvara vid 4 °C för ytterligare experiment.
- Överför 2 μl Candida-cellsuspension utspädd i 200 μl av RPMI 1640 komplett odlingsmedium till en platta med 96 brunnar och odla över natten vid 37 °C så att hyfer och jästceller bildas.
8. KOH utstrykstest och CFW-färgningsanalys
- Ta ut 1 μL prover från steg 3 eller steg 6 eller steg 7 med hjälp av en precisionsgjuten ögla (se Materialtabell) och smeta ut en yta på 1 cm x 1 cm på glasskivorna. Vänta tills den torkar i rumstemperatur.
- För att göra 10% KOH-lösning, väg 10 g KOH-pulver (se Materialtabell) och lös upp det i 100 ml dubbeldestillerat vatten.
- Värm objektglaset något med en alkohollampa tills provet löses upp. Färga objektglasen som förberetts i steg 8.1 med 10 % KOH (steg 8.2) och täck med ett täckglas. Tryck lätt på täckglaset för att göra provet genomskinligt.
- Visualisera hyferna och jästcellerna under mikroskopet.
- Fläckglas som förberetts i steg 8.1 med en droppe CFW (se Materialtabell), täck med ett täckglas och vänta i 1 min.
- Visualisera hyferna med hjälp av ett fluorescensmikroskop vid förstogarna 100x och 200x. CFW exciteras vid 355 nm och detekteras vid 300-440 nm. Fotografera bilderna under exponeringstiden. Upprepa 3 gånger för att undvika falska positiva resultat.
9. Test av svampdödande känslighet
OBS: Detta test utförs enligt tillverkarens instruktioner för jästliknande svampkänslighetskit (mikroutspädning; se materialtabell).
- Förbered Candida-kolonier (steg 4) som är mindre än 4 dagar gamla med 0,85 % NaCl-ampullen (se Materialtabell) och erhåll suspensionen med en turbiditet motsvarande 2 McFarland. Bestäm grumligheten enligt McFarland Standards Kit (se materialförteckning). Använd den beredda Candida-suspensionen omedelbart.
- Pipettera över 135 μL ATB F2-medium i satsen som innehåller 3 x 104 jästceller/ml i varje kopp i teststickan och sätt på locket. Lägg teststickan i en förseglad behållare. Odling i 24 timmar vid 35 °C.
- Observera tillväxten av Candida med visuell tolkning (se användarmanualen). För referensvärdet (referensintervall), se användarmanualen. Kontrollera om kontrollhålet växer tillräckligt. Om tillväxten av kontrollhålet är otillräcklig eller inte växer, kan resultaten inte läsas och behöver ytterligare 24 timmars odling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie valdes 12 patienter med pSS ut som representativa patienter och screenades för oral Candida-infektion (tabell 1). Bland dessa patienter uppvisade vissa patienter typiska orala lesioner av Candida-infektion , inklusive angulär cheilit (kännetecknad av sprickor i mungiporna, deskvamation och hyperemi, Figur 1A), klarrött ödem på tandköttsslemhinnan, gulvit trådig pseudomembran (Figur 1B), lingual papillatrofi och klarröd ryggslemhinna på tungan (Figur 1C).
Bland dessa 12 patienter som ingick i den aktuella studien hade 8 av dem oral Candida-infektion, vilket bekräftades av tillväxten av Candida-kolonier på SDA-rätterna (Figur 2A-C och Kompletterande Figur 1). Den diagnostiska agaren visade att orala Candida-infektioner av Candida albicans, Candida krusei och Candida glabrata förekommer bland dessa pSS-patienter (Figur 2D-F, kompletterande figur 2A,B). I vissa fall påvisades mer än en art av Candida, såsom en kombinationsinfektion med Candida albicans och Candida krusei, samt en kombinationsinfektion med Candida albicans och Candida glabrata (Figur 2D, kompletterande figur 2A,B).
KOH-utstrykstestet och den efterföljande CFW-färgningsanalysen, med hjälp av patientens saliv eller orala slemhinneprover, kan snabbt avgöra om patienten har oral Candida-infektion. I denna studie observerades förekomst av hyfer i båda orala prover från pSS-patienter (Figur 3A,B). Fyndet validerades ytterligare av CFW-färgningsanalysen, som uppvisade fluorescerande positiv färgning av hyferna (Figur 3C,D). Dessutom var hyferna hos en pSS-patient infekterad med orala Candida albicans inducerbara genom hyfbildningsanalysen (Figur 4A), och de inducerade hyferna observerades under fluorescensmikroskopet i CFW-färgningsanalysen (Figur 4D). Dessutom indikerade KOH-utstrykstestet och CFW-färgningsanalysen positiva svampsporer och pseudohyfer från en pSS-patient med Candida krusei-infektion (Figur 4B,E) och svampsporer från en pSS-patient med Candida glabrata-infektion (Figur 4C,F), efter bildandet av Candida-biofilmen.
Resistensbestämning mot svamp är avgörande för att vägleda den kliniska hanteringen av orala Candida-infektioner hos patienter med pSS. Här testades tre representativa patienter för svampdödande känslighet för fem vanligt förskrivna medel: Flukonazol, Itrakonazol, Amfotericin B, Vorikonazol och 5-Flukonazol. Resultaten tolkades enligt tillverkarens riktlinjer. pSS-patienter 1 och 3 uppvisade känslighet för alla testade antimykotika (tabell 1)14,15. pSS-patient 2 uppvisade ett dosberoende intermediärt svar på flukonazol och vorikonazol, en dosberoende, intermediär till resistent känslighet mot itrakonazol, resistens mot 5-flukonazol och känslighet för amfotericin B-behandling (tabell 2)14,15.
Figur 1: Representativa orala manifestationer av oral Candida-infektion . (A) Angulär cheilit (ragader i mungiporna, deskvamation och hyperemi). (B) En erytematös lesion med ödem på den alveolära gingivalslemhinnan, med en gulvit trådig pseudohinna. C) Atrofisk rygg av linguala papiller med dispergerad och oregelbunden, rodnad och avgränsad atrofisk erytemskada. Svarta pilar pekar på lesionerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Identifiering av Sabouraud-dextrosagar (SDA) och Candida-stam . (A-C) SDA-odlingen av orala prover (saliv, PBS munvatten eller byte av munslemhinna) från 3 representativa pSS-patienter med Candida-infektion . Analysen för identifiering av Candida-stammar med hjälp av en diagnostisk agar-agar visar pSS-patienter med orala (D) Candida albicans-infektioner plus Candida Krusei-infektioner , (E) Candida albicans-infektion och (F) Candida glabrata-infektion . Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Utstrykstest för omedelbar kaliumhydroxid (KOH) och bestämning av färgning av kalkofluorvitt (CFW). Analysen utfördes med hjälp av orala prover (saliv, PBS munvatten eller byte av munslemhinna) från 2 representativa pSS-patienter. KOH utstrykstest med hjälp av det orala provet från (A) pSS-patient 1 och (B) pSS-patient 2. Svarta, ihåliga pilar pekar på hyferna. CFW-färgningsanalys med hjälp av det orala provet från (C) pSS-patient 1 och (D) pSS-patient 2. Vita ihåliga pilar pekar på hyfer och svampsporer. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Utstrykstest av kaliumhydroxid (KOH), bestämning av färgning av prover med kalkofluorvitt (CFW) efter odling. KOH-utstrykstest med saliv från pSS-patient med (A) Candida albicans-infektion , (B) pSS-patient med Candida krusei-infektion och (C) pSS-patient med Candida glabrata-infektion . CFW-färgningsanalys av inducerade hyfer från pSS-patient med (D) Candida albicans-infektion , svampsporer och pseudo-hyfer från (E) pSS-patient med Candida krusei-infektion och svampsporer från (F) pSS-patient med Candida glabrata-infektion . Vita ihåliga pilar pekar på hyferna; Vita heldragna pilar pekar på pseudo-hyferna. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Representativ odling av Sabouraud dextrose agar (SDA) med användning av orala pSS-patientprover (saliv, PBS-munvatten eller byte av munslemhinna). (A-C) SDA-odling av Candida med hjälp av orala prover från 3 representativa pSS-patienter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Identifiering av Candida-stammen . Identifiering av den möjliga infekterade Candida från de 12 pSS-patienterna med hjälp av en Candida diagnostisk agar. (A) Identifiering av Candida-stam med hjälp av orala prover från pSS-patienter 1-6. pSS-patient 1: Candida albicans, 2: Candida albicans, 3: Candida albicans och Candida krusei, 4: Candida albicans, 5: Candida albicans och Candida glabrata, 6: ingen oral Candida-infektion . (B) Identifiering av Candida-stam med hjälp av orala prover från pSS-patienter 7-12. pSS-patient 7: Candida albicans, 8: Candida albicans och Candida glabrata, 9: ingen oral Candida-infektion , 10: Candida albicans, 11: ingen oral Candida-infektion , 12: ingen oral Candida-infektion . Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tabell 1: Information till patienter med primärt Sjögrens syndrom. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Resultat av resistensbestämning hos patienterna14,15. Förkortningar: S = känslig, I = intermediär, R = resistent, SDD = dosberoende känslig, C = koncentration. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det aktuella manuskriptet tillhandahåller vi en serie systematiska, enkla och genomförbara metoder för att upptäcka orala Candida-infektioner , identifiera Candida-stammar och testa den svampdödande känsligheten hos vanliga läkemedel hos patienter med pSS.
I praktiska sammanhang är inte alla metoder som introduceras i detta manuskript nödvändiga. De orala Candida-detektionsmetoderna kan väljas baserat på det specifika syftet. KOH-utstrykstester och CFW-färgningsanalyser, med hjälp av prover utan odling, kan snabbt och preliminärt bestämma förekomsten av oral Candida-infektion hos pSS-patienter. Dessa metoder har dock en relativt hög falskt negativ frekvens16. Om det är svårt att bekräfta infektionen är det viktigt att odla Candida. Läkemedelsresistens är en faktor som måste beaktas under behandlingen. vissa Candida-stammar är naturligt resistenta mot vissa svampdödande läkemedel, t.ex. är Candida krusei naturligt resistent mot behandling med Fluconazole17. Därför måste ibland stammen av Candida identifieras. I det här fallet kan Candida-stammen identifieras med hjälp av en diagnostisk Agar-agar. För närvarande får den läkemedelsresistenta Candida allt större uppmärksamhet18. Det svampdödande känslighetstestet kan vägleda behandlingen och därmed undvika läkemedelsresistens så mycket som möjligt under behandlingen. Candida biofilmbildningsanalys och hyfbildningsanalys är lämpliga för forskning relaterad till oral Candida-infektion.
Oral Candida-infektion är en av de vanligaste komplikationerna hos pSS-patienter4 och påverkar avsevärt deras livskvalitet på grund av de olika symtom som den orsakar. Noterbart är att pSS-patienter är mycket mottagliga för denna infektion, och effektiv behandling kräver ofta systemisk terapi och patientsamarbete19. Följaktligen är orala Candida-infektioner ofta återkommande i denna population. Det är viktigt att identifiera oral candidiasis och utföra svampdödande känslighetstester för att vägleda behandlingen. Bland de metoder som beskrivs i detta manuskript är insamlingen av orala prover för Candida-detektion och efterföljande odling de mest kritiska stegen.
Dessutom kan Candida som har hyfbildning (t.ex. Candida albicans) lätt detekteras genom det snabba KOH-utstrykstestet och CFW-färgningsanalysen med hjälp av insamlade prover utan odling. Även om de flesta av de orala Candida-infektionerna kan detekteras och Candida-stammarna kan identifieras genom de metoder som introduceras i detta manuskript, kan vissa Candida-stammar inte identifieras från andra specifikt endast genom metoder som SDA-kultur, Candida diagnostisk agarkultur, Candida-biofilmbildningsanalys och hyfbildningsanalys. Dessutom kan vissa Candida-stammar inte förmås att producera hyfer, såsom Candida glabrata. Den 18s rDNA RT-PCR-baserade artidentifieringen kan exakt identifiera Candida-arter baserat på deras genetiska likhet 10,20,21. Vid behov kan den 18s rDNA RT-PCR-baserade artidentifieringen användas, t.ex. i forskning om oral Candida-infektion hos pSS-patienter.
Intraoralt kan manifestationen av Candida-infektion visa sig som erytematösa slemhinnelesioner, protesstomatit och klyvning av tungan. I det periorala området orsakar koloniseringen av Candida ett torrt, sprucket och erytematöst utseende7. Den rapporterade prevalensen av klinisk oral candidiasis varierar kraftigt hos SS-patienter, från 0 % till 80 %. De möjliga orsakerna till den stora variationen av oral candidiasis inkluderar bristen på tydlig symtomatologi och, ännu viktigare, de olika kriterier som används för diagnos av oral candidiasis i litteraturen 8,9,12. Dessutom rapporteras patienter med Candida-infektion ha en högre risk för SS, och Candida-infektion kan fungera som ett tidigt tecken på efterföljande SS22. Tidig diagnos av pSS är avgörande för behandlingen och den patologiska studien. Därför är det absolut nödvändigt att tillhandahålla universella, bekväma och genomförbara metoder för att identifiera oral Candida-infektion hos pSS-patienter.
Även om dysbios i tarmen, oralt och vaginalt mikrobiom är vanligt hos pSS-patienter, visar orala prover den största omfattningen av mikrobiell variation1. Under normala förhållanden är det genomsnittliga dagliga flödet av hel saliv 1 till 1,5 L2. Upp till 99 % av saliven består av vatten, och den återstående 1 % består av proteiner och joner. Saliv rapporteras spela en viktig roll vid bestämningen av sammansättningen och aktiviteten hos den orala mikrobiotan av flera skäl3. Saliven rengör inte bara tänderna kontinuerligt och utför viktiga munhygienfunktioner under hälsosamma förhållanden, utan den bildar också en konditioneringsfilm på orala ytor. Denna film ger receptorer för bakteriers fastsättning, hjälper till med tillväxten av bakterier genom att förse dem med näringsämnen från glykoproteiner och upprätthåller ett lämpligt pH för bakterietillväxt. Dessutom innehåller saliven antimikrobiella och anti-candidala faktorer som reglerar och formar mikrobiotan. Dessutom innehåller saliv antimikrobiella och anti-candidala faktorer, såsom adrenomedullin, statherin, histatiner, α-defensiner, lysozym, histatiner, laktoferrin och kalprotektin, som reglerar och formar mikrobiotan4. pSS kännetecknas av autoimmun avreglering och körtelhypofunktion. Hyposalivation, en minskning av salivflödet, är ett av de vanligaste symtomen på pSS. Minskade pH-nivåer och flöde i saliven är betydande riskfaktorer för orala Candida-infektioner 5. Dessutom rapporteras Candida-infektioner som den näst vanligaste orofaciala komplikationen i samband med SS6. Författarna föreslår att de ökade Candida-infektionerna hos pSS-patienter inte bara kan vara kopplade till minskad salivproduktion utan också till den immunologiska avreglering som är inneboende i SS.
Sammanfattningsvis är praktiska och reproducerbara metoder för oral Candida-infektion och svampdödande känslighetstester som introduceras i detta manuskript lovande för att förbättra klinisk identifiering och behandling av Candida-infektioner . Dessutom kan dessa standardiserade procedurer minimera inkonsekvenser i forskningsstudier relaterade till oral candidiasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China (82201084), China Postdoctoral Science Foundation (2022M722232), Beijing Postdoctoral Research Foundation (2023-ZZ-020), Miaopu Project of Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (2023MP10) och General Research Fund, Hong Kong Research Grants Council (27111820 och 17116521).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
- Wang, X., et al. Microbiota dysbiosis in primary Sjögren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine. Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).
- Humphrey, S. P., Williamson, R. T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. The power of saliva: Antimicrobial and beyond. PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).
- Serrano, J., et al. Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sjögren's syndrome. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).
- Napeñas, J. J., Rouleau, T. S.
- Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. Sjögren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care. Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).
- Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).
- Alam, M. Z., et al. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology. World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).
- Bauters, T. G., Nelis, H. J. Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species. J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).
- Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarcón-Segovia, D., Kraus, A. Oral candidiasis and Sjögren's syndrome. J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).
- Biomerieux. ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204. Biomerieux. , (2014).
- Zhang, L., et al. The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs. PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).
- Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test. Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).
- Samaranayake, L. P. Candida krusei infections and fluconazole therapy. Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).
- Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).
- Rihab, B., Lina, E. H., Noémie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences. BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).
- Panpetch, W., et al. Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium. PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).
- Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis. Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).
- Chen, C. L., et al. Candida infection as an early sign of subsequent Sjögren's syndrome: A population-based matched cohort study. Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).
