Summary
여기에서는 원발성 쇼그렌 증후군 환자의 구강 칸디다 감염 검사를 위한 프로토콜을 제시하며, 이는 적시에 치료하고 이후 관련 합병증을 피하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
원발성 쇼그렌 증후군(pSS)은 구강 건조증, 안구 건조증 및 기타 전신 증상과 같은 증상을 특징으로 하는 자가면역 질환입니다. pSS 환자가 경험하는 타액 분비 저하로 인해 구강 이균증이 자주 발생합니다. pSS의 일반적인 합병증은 구강 칸디다 감염입니다. 이 기사에서 저자는 구강 칸디다 감염을 효과적으로 진단하고 타액, 구강 점막 면봉 또는 pSS 환자의 구강 세정제를 사용하여 칸디다 균주를 식별할 수 있는 체계적인 방법을 설명합니다. Sabouraud's Dextrose Agar(SDA), 균사 형성 분석, 수산화칼륨(KOH) 도말 검사 및 calcofluor white(CFW) 염색 검사는 구강 칸디다 감염 진단에 사용됩니다. 칸디다 진단 한천은 칸디다 균주의 식별에 사용됩니다. 마지막으로, 적절한 항진균제 치료를 결정하기 위해 항진균제 감수성 검사가 사용됩니다. 이 표준화된 방법은 pSS 관련 구강 칸디다 감염의 진단, 치료 및 향후 연구를 향상시킬 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 조기 진단을 하면 적절한 치료를 받는 것이 지연되어 발생하는 합병증을 예방할 수도 있습니다.
Introduction
칸디다증은 기회 감염 병원균인 칸디다 종(Candida spp.)에 의해 발생합니다. 흔한 균주로는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 파라실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis)1 등이 있습니다. 칸디다 종에 의한 기회 감염에는 표재성 칸디다 감염과 침습성 칸디다증이 포함됩니다. 침습성 칸디다증은 주로 면역력이 저하된 개인에서 발생합니다. 예를 들어, 후천성면역결핍증후군(AIDS) 환자의 경우, 침습성 칸디다증은 삶의 질이나 심지어 수명까지 크게 위협할 수 있다2. 점액성 피부 칸디다증과 같은 표재성 칸디다 감염은 환자에서 더 흔하다3.
표재성 칸디다 감염인 구강 칸디다증은 가장 흔한 인간 진균 감염입니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans )는 구강의 정상적인 공생종입니다. 칸디다 균의 보균률은 증상이 없는 일반 인구에서 20%에서 75% 사이로 보고되었다4. 칸디다 균이 과도하게 증식하면 감각의 변화, 입안의 작열감, 영양 부족으로 인한 삼킴곤란, 회복 지연, 장기간의 입원과 같은 국소적 불편함을 유발할 수 있습니다. 장기적인 구강 칸디다증은 심각한 침습성 칸디다증으로 이어질 수 있으며, 이로 인해 상당한 이환율과 사망률이 발생할 수 있다5. 구강 칸디다증은 또한 구강암의 위험을 증가시킬 수 있다5. 손상된 타액선 기능은 구강 칸디다증의 위험 요인 중 하나이다6. 감염의 시작은 칸디다 균이 상피 세포벽에 부착되는 것입니다. 그 다음에는 칸디다(Candida )의 증식과 필라멘트화(filamentation), 생물막(biofilm)의 형성 및 성숙이 뒤따른다7. 생물막은 근절하기가 매우 어렵고 기존의 항진균제 처리에 내성이 있어 생물막 관련 구강 칸디다 감염에 대한 임상 치료가 어렵다7.
원발성 쇼그렌 증후군(pSS)은 구강 건조, 안구 건조증 및 기타 전신 증상을 특징으로 하는 자가면역 질환입니다8. 구강 건조증은 pSS의 가장 흔한 증상입니다. 타액은 중요한 생리적 항진균 기능을 가지고 있습니다. 한편으로는 구강을 희석하고 샅샅이 훑은 다음 점막에서 유기체를 제거할 수 있습니다. 한편, 타액에는 락토페린, 시알페록시다아제, 라이소자임, 히스티딘이 풍부한 폴리펩티드, 특정 항칸디달 항체 등의 항균 단백질이 포함되어 있어 구강 점막과 상호 작용하여 칸디다6의 과증식을 방지할 수 있습니다. 감소된 타액 흐름은 pSS 환자를 구강 칸디다증에 걸리게 할 수 있습니다. 61명의 pSS 환자를 대상으로 실시한 관찰 단면 연구에 따르면 pSS 환자의 13.1%가 칸디다증의 구강 징후를 보였으며 칸디다 알비칸스의 집락 형성 단위(CFU)/mL는 자극되지 않은 전체 타액(UWS) 및 자극된 전체 타액(SWS) 수준과 유의하고 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다9.
이 원고에 소개된 방법은 직접 도말 또는 배양 후 특징적인 형태학적 특성(예: 균사 및 효모 세포)을 기반으로 구강 칸디다 감염을 식별할 수 있습니다10. 칸디다 진단 한천을 사용한 칸디다의 균주 식별은 종 특이적 효소11에 의한 발색 기질의 절단으로 인해 발생하는 다양한 형태를 가진 다양한 색상의 콜로니의 형성을 기반으로 합니다. 이 원고에서는 전통적인 구강 칸디다 배양과 수산화칼륨(KOH) 도말 검사 및 칼코플루오르 화이트(CFW) 염색 검정을 통한 신속한 검사를 포함하여 구강 칸디다 감염을 검출하기 위한 체계적인 방법을 소개합니다10. 또한, 임상적 경구용 칸디다 감염 치료의 지침이 될 수 있는 항진균제 감수성 검사가 도입되었습니다. 실제 상황에서는 이 원고에 소개된 모든 방법을 수행할 필요가 없습니다. 경구용 칸디다 검출 방법은 목적에 따라 선택할 수 있습니다. pSS 환자에서 구강 칸디다 감염 검사 및 칸디다 균주 측정은 질병 치료에 도움이 될 뿐만 아니라 구강 칸디다증의 특성 및 종 프로필을 평가하는 데 도움이 됩니다.
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Protocol
아래에 설명된 모든 절차는 베이징 수도 의과대학 톈탄병원 윤리위원회(NO. KY2023-177-01)의 승인을 받았으며 이 연구에 참여한 모든 환자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
1. 환자 포함 및 제외 기준
- 포함 기준: 2016 American College of Rheumatology(ACR)/European League Against Rheumatism(EULAR) 기준12를 충족하는 경우 환자를 pSS 환자로 분류합니다. 구체적으로, 5개 항목의 가중 합계를 기반으로 최종 분류 기준을 설정합니다: 항-SSA/Ro 항체 양성률 및 초점 점수가 ≥ 1 foci/4 mm2인 국소 림프구성 규골염, 각각 3점; 비정상 안구 염색 점수 ≥ 5(또는 van Bijsterveld 점수 ≥ 4), Schirmer's 검사 결과 ≤ 5mm/5분 및 ≤ 0.1mL/분의 비자극 타액 유속, 각각 1점. SS를 암시하는 징후 및/또는 증상이 있는 개인으로 위 항목에 대한 총점이 ≥ 4인 개인은 pSS 기준을 충족합니다.
- 제외 기준: 검체 채취에 협조할 수 없는 환자와 구강 칸디다 감염으로 치료를 받고 있는 환자를 제외합니다.
주의: 아래에 설명된 방법은 2차 SS가 있는 개인의 구강 칸디다 감염의 포괄적인 특성화에도 적합하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. - 칸디다 샘플의 수집, 운송 및 배양 중 잠재적인 오염을 방지하려면 세심한 예방 조치를 취하십시오. 여기에는 꼼꼼한 실험 준비, 일회용 및 멸균 재료 사용, 적절한 라벨링, 샘플링 튜브의 안전한 밀봉, 전문 생물 안전 작업대에서 실험 절차 수행이 포함됩니다.
2. 시료 채취
- 타액 채취: 환자에게 깔때기로 튜브를 잡고 타액이 아랫입술을 따라 튜브로 서서히 흐르도록 지시합니다. 채취가 끝나면 환자에게 입안에 남아 있는 모든 침을 튜브에 뱉어내도록 요청합니다. 15분 동안 타액을 채취합니다.
- 구강 세척제 및 면봉 채취: 환자에게 자극되지 않은 타액 흐름이 없거나 매우 낮은 경우(0.03mL/분 미만) 구강 칸디다 감염이 의심되는 구강 점막 부위를 최소 10배 면봉으로 닦은 다음 환자에게 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS, 재료 표 참조)를 사용하여 1분 동안 입을 헹구도록 요청합니다. 구강 세정제를 50mL 멸균 튜브에 보관하고 면봉을 구강 세정제 튜브에 넣습니다.
참고: 자극되지 않은 타액 흐름이 0.03mL/min 이상인 pSS 환자의 경우 2.2단계를 사용하여 구강 칸디다 감염 검출을 위한 샘플을 수집할 수 있습니다.
3. 샘플 처리
- 채취한 타액에 PBS 1mL를 추가합니다. PBS로 구강 세정제에 PBS를 첨가하지 마십시오. 소용돌이를 사용하여 구강 세정제 튜브를 1분 동안 진동시킵니다.
4. 칸디다 문화
- Sabourand's Agar(SDA) 배지를 만들려면 70g SDA( 재료 표 참조)를 이중 증류수 1000mL에 녹입니다.
- 121°C에서 오토클레이브로 15분 동안 멸균하고 이 SDA 배지 10mL를 10cm 미생물 배양 접시( 재료 표 참조)에 플레이트하고 냉각합니다.
- 3단계에서 준비한 200μL의 샘플을 4.2단계에서 10mL의 SDA 배지로 준비한 10cm 미생물 배양 접시에 줄무늬를 만듭니다.
- 37 °C에서 48 시간 동안 배양하면 칸디다 군집이 성숙합니다. 칸디다 콜로니가 있는 SDA 접시를 4°C에서 임시로 보관합니다. SDA 접시에서 배양 된 칸디다 콜로니는 2-4 주 동안 보관할 수 있습니다.
5. 칸디다 균주 식별
- 배지를 만들려면 Candida diagnostic agar ( 재료 표 참조) 분말 47.7g을 꺼내 이중 증류수 1000mL에 넣고 100 °C로 가열합니다.
- 배지가 약간 끓으면 10cm 미생물 배양 접시에 10mL를 담아 식힙니다.
- 칸디다 콜로니를 500 μL의 SDA 배지에 용해시키고(단계 4), 피펫팅으로 현탁 및 해리합니다.
- 칸디다 콜로니(단계 5.3)가 있는 샘플 50μL를 단계 5.2에서 준비한 배지에 플레이트합니다. 칸디다 군집이 성숙할 때까지 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
- 칸디다 콜로니의 색상과 패턴에 따라 pSS 환자로부터 획득한 칸디다의 변형률을 결정합니다. 다음의 칸디다 균주 식별 기준을 사용하십시오: 에메랄드 녹색 군체는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 청회색 군체는 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 가장자리가 흐릿한 분홍색 군체는 칸디다 크루세이(Candida krusei), 자줏빛을 띤 적색 작은 군체는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 유백색 군체는 칸디다 파라실로시스(Candida parapsilosis)를 포함한 여러 균주를 포함합니다.
6. 칸디다 생물막 형성 분석
- 효모 질소 염기(YNB)-50 포도당(G) 매체를 만들려면 1.34g YNB( 재료 표 참조) 및 1.98g D(+)-포도당( 재료 표 참조)의 무게를 측정합니다. 이중 증류수 200mL에 녹입니다.
- YNB-100G 배지를 만들려면 1.34g의 YNB와 3.96g의 D(+)-포도당을 꺼내 이중 증류수 200mL에 녹입니다.
- 0.22μm 주사기 필터로 용액을 여과합니다( 재료 표 참조). 여과된 YNB-50G 및 YNB-100G 매체는 4°C에서 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 5 단계에서 접시의 동일한 균주에서 3 개 (또는 그 이상) 콜로니를 선택하고 96 웰 플레이트에서 200 μL의 YNB-50G 배지 (6.1 단계 및 6.3 단계)로 옮깁니다 ( 재료 표 참조). 접시에서 관찰 된 균주에 대해 이렇게하십시오. 37°C에서 200rpm에서 진탕하면서 밤새 배양합니다.
- 칸디다 현탁액을 흡인하고, PBS 1mL를 첨가하고, 효모 세포를 1500 x g에서 실온에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 같은 튜브에서 이 단계를 2번 반복합니다.
- YNB-100G 배지 1mL에 세포를 재현탁시키고 세포의 다른 희석액(1:10, 1:100 및 1:1000)을 준비합니다. 200 μL의 그래디언트 셀 현탁액을 스파이럴 플레이트 방법13에 의해 10cm SDA 배지에 플레이트합니다. 도금은 아르키메데스 나선의 형태로 계속 감소하는 양으로 회전하는 한천 플레이트에 알려진 양의 샘플을 증착하는 기계를 사용하여 수행됩니다. 37 °C에서 24-48 시간 동안 배양.
- 표준 방법13에 따라 SDA 플레이트의 CFU 수에 따라 서로 다른 희석액에 있는 세포의 농도를 계산합니다. 각 플레이트에서 잘 분리된 콜로니를 간략하게 세십시오. 적어도 25 개의 식민지가 관찰 될 때까지 바깥 쪽 가장자리에서 중심을 향해 한 팔각형의 식민지를 계산합니다. 또한 25번째 카운트가 발생한 해당 호의 나머지 부분을 계산합니다. 콜로니 수를 콜로니 수가 얻어진 면적에 해당하는 액체 부피로 나누어 세포의 농도를 계산합니다13. 세포 농도를 1 x 107 cells/mL로 조정합니다.
- YNB-100G의 세포 현탁액 100μL를 96웰 플레이트에 넣고 37°C에서 200rpm으로 흔들면서 2시간 동안 배양합니다.
- 조심스럽게 상층액을 꺼내 PBS로 2x 세척하고 떠 다니는 효모 세포를 제거합니다. 칸디다 생물막은 96웰 플레이트의 바닥에 형성됩니다.
7. 균사 형성 분석
참고: 균사를 형성할 수 있는 칸디다 (예: 칸디다 알비칸스)만 균사 형성을 유도할 수 있습니다. 균사를 형성할 수 없는 칸디다 (예: 칸디다 글라브라타)의 추가 특성 분석을 위해 8단계로 이동합니다.
- 단계 6.6에서 효모 세포 현탁액을 재현탁하고 세포 농도를 YNB-100G 배지를 사용하여 1 x 106 cells/mL로 조정합니다.
- RPMI 1640 완전 성장 배지를 준비하려면 50mL의 소 태아 혈청( 재료 표 참조)을 450mL의 RPMI 1640 배지( 재료 표 참조)에 넣고 추가 실험을 위해 4°C에서 보관합니다.
- 200μL의 RPMI 1640 완전 성장 배지에 희석된 2μL의 칸디다 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 옮기고 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 균사와 효모 세포가 형성되도록 합니다.
8. KOH 도말 검사 및 CFW 염색 분석
- 정밀 성형 루프( 재료 표 참조)를 사용하여 3단계 또는 6단계 또는 7단계에서 1μL의 샘플을 꺼내고 유리 슬라이드에 1cm x 1cm 면적을 바릅니다. 실온에서 마를 때까지 기다리십시오.
- 10% KOH 용액을 만들려면 10g KOH 분말( 재료 표 참조)의 무게를 측정하고 이중 증류수 100mL에 녹입니다.
- 알코올 램프로 슬라이드를 약간 가열합니다.amp 표본이 녹을 때까지. 8.1단계에서 준비한 슬라이드를 10% KOH(8.2단계)로 염색하고 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 슬립을 살짝 눌러 샘플을 투명하게 만듭니다.
- 현미경으로 균사와 효모 세포를 시각화합니다.
- 8.1단계에서 준비한 슬라이드를 CFW 한 방울로 염색하고( 재료 표 참조) 커버슬립으로 덮고 1분 동안 기다립니다.
- 형광 현미경을 사용하여 100x 및 200x 배율로 균사를 시각화합니다. CFW는 355nm에서 여기되고 300-440nm에서 감지됩니다. 노출 시간 아래에 있는 이미지를 촬영합니다. 거짓 양성 결과를 방지하려면 3번 반복합니다.
9. 항진균제 감수성 시험
참고: 이 테스트는 Yeast-Like Fungal Susceptibility Kit(미세 희석, 재료 표 참조)에 대한 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다.
- 0.85% NaCl 앰플(재료 표 참조)로 4일 미만의 칸디다 콜로니(단계 4)를 준비하고 2 McFarland에 해당하는 탁도를 갖는 현탁액을 얻습니다. McFarland Standards Kit에 따라 탁도를 측정합니다(재료 표 참조). 준비된 칸디다 현탁액을 즉시 사용하십시오.
- 테스트 스트립의 각 큐풀에 3 x 104 효모 세포/mL가 포함된 키트에 135μL의 ATB F2 배지를 피펫하고 뚜껑을 덮습니다. 밀봉된 용기에 테스트 스트립을 넣으십시오. 35 °C에서 24 시간 동안 배양.
- 시각적 해석으로 칸디다 의 성장을 관찰하십시오(사용 설명서 참조). 기준값(기준범위)은 사용설명서를 참조하십시오. 컨트롤 홀이 적절하게 성장하고 있는지 확인하십시오. 대조 구멍의 성장이 충분하지 않거나 자라지 않으면 결과를 읽을 수 없으며 24 시간의 재배가 더 필요합니다.
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Representative Results
본 연구에서는 pSS 환자 12명을 대표 환자로 선정하여 경구용 칸디다 감염 여부를 검사하였다(표 1). 이 환자들 중 일부 환자들은 구각염(입가의 갈라짐, 박리, 충혈을 특징으로 함, 그림 1A), 잇몸 점막의 선홍색 부종, 황백색의 끈적끈적한 가성막(그림 1B), 설유두 위축(lingual papillae atrophy) 및 혀의 밝은 붉은색 등쪽 점막(그림 1C)을 포함한 칸디다 감염의 전형적인 구강 병변을 보였다.
본 연구에 참여한 12명의 환자 중 8명은 경구용 칸디다 감염을 앓고 있었으며, 이는 SDA 접시에서 칸디다 콜로니의 성장에 의해 확인되었습니다(그림 2A-C 및 보충 그림 1). 진단 한천은 이러한 pSS 환자들 사이에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 크루세이(Candida krusei) 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)의 경구용 칸디다 감염이 존재함을 보여주었다(그림 2D-F, 보충 그림 2A, B). 일부 사례에서는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 칸디다 크루세이(Candida krusei)와의 조합 감염뿐만 아니라 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)와의 조합 감염과 같은 하나 이상의 칸디다 종이 검출되었습니다(그림 2D, 보충 그림 2A, B).
환자의 타액 또는 구강 점막 면봉 샘플을 사용하는 KOH 도말 검사 및 후속 CFW 염색 분석은 환자의 구강 칸디다 감염 여부를 신속하게 결정할 수 있습니다. 이 연구에서는 pSS 환자의 두 구강 샘플에서 균사의 존재가 관찰되었습니다(그림 3A,B). 이 발견은 균사의 형광 양성 염색을 나타낸 CFW 염색 분석에 의해 추가로 검증되었습니다(그림 3C,D). 또한, 경구용 칸디다 알비칸스에 감염된 pSS 환자의 균사는 균사 형성 분석을 통해 유도할 수 있었고(그림 4A), 유도된 균사는 CFW 염색 분석에서 형광 현미경으로 관찰되었습니다(그림 4D). 또한, KOH 도말 검사 및 CFW 염색 분석은 칸디다 생물막 형성 후 칸디다 크루세이 감염이 있는 pSS 환자(그림 4B,E)에서 양성 진균 포자 및 가성균사(pseudohypha)와 칸디다 글라브라타 감염이 있는 pSS 환자(그림 4C,F)의 진균 포자를 나타냈습니다.
항진균제 감수성 검사는 pSS 환자의 구강 칸디다 감염에 대한 임상 관리를 안내하는 데 매우 중요합니다. 여기에서 3명의 대표 환자를 대상으로 일반적으로 처방되는 5가지 약제인 플루코나졸(Fluconazole), 이트라코나졸(Itraconazole), 암포테리신 B(Amphotericin B), 보리코나졸(Voriconazole) 및 5-플루코나졸(5-Fluconazole)에 대한 항진균제 감수성을 테스트했습니다. 결과는 제조업체의 지침에 따라 해석되었습니다. pSS 환자 1 및 3은 테스트된 모든 항진균제에 대해 민감성을 보였다(표 1)14,15. pSS 환자 2는 플루코나졸 및 보리코나졸에 대한 용량 의존적 중간 반응, 용량 의존적, 이트라코나졸에 대한 중간 내성 민감성, 5-플루코나졸에 대한 내성 및 암포테리신 B 치료에 대한 민감성을 보여주었다(표 2)14,15.
그림 1: 구강 칸디다 감염의 대표적인 구강 증상. (A) 구각염(입가의 박리, 박리 및 충혈). (B) 치조(黃齋) 치은 점막에 부종을 동반한 홍반성 병변으로, 황백색의 끈적끈적한 가성막(pseudo-membrane)이 있다. (C) 분산되고 불규칙한 붉어지고 외접성 위축성 홍반 병변이 있는 설유두의 위축성 등쪽. 검은 화살표는 병변을 가리킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Sabouraud 포도당 한천(SDA) 및 칸디다 균주 식별. (A-C) 칸디다 감염이 있는 대표적인 pSS 환자 3명의 구강 샘플(타액, PBS 구강 세정제 또는 구강 점막 스왑)의 SDA 배양. 칸디다 진단 한천을 사용한 칸디다 균주 식별 분석은 경구용 (D) 칸디다 알비칸스와 칸디다 크루세이 감염, (E) 칸디다 알비칸스 감염 및 (F) 칸디다 글라브라타 감염이 있는 pSS 환자를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 순간 수산화칼륨(KOH) 도말 검사 및 칼코플루오르 화이트(CFW) 염색 분석. 이 분석은 2명의 대표적인 pSS 환자의 구강 샘플(타액, PBS 구강 세척제 또는 구강 점막 스왑)을 사용하여 수행되었습니다. (A) pSS 환자 1 및 (B) pSS 환자 2의 구강 샘플을 사용한 KOH 도말 검사. 속이 빈 검은색 화살표가 균사를 가리킵니다. (C) pSS 환자 1 및 (D) pSS 환자 2의 구강 샘플을 사용한 CFW 염색 분석법. 흰색 속이 빈 화살표는 균사와 곰팡이 포자를 가리킵니다. 눈금 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 수산화칼륨(KOH) 도말 검사, 배양 후 샘플의 칼코플루오르 화이트(CFW) 염색 분석. (A) 칸디다 알비칸스 감염이 있는 pSS 환자, (B) 칸디다 크루세이 감염이 있는 pSS 환자, (C) 칸디다 글라브라타 감염이 있는 pSS 환자의 타액을 사용한 KOH 도말 검사. (D) 칸디다 알비칸스 감염이 있는 pSS 환자, 진균 포자 및 (E) 칸디다 크루세이 감염이 있는 pSS 환자의 유사 균사 및 칸디다 글라브라타 감염이 있는 (F) pSS 환자의 진균 포자의 유도 균사에 대한 CFW 염색 분석. 흰색 속이 빈 화살표는 균사를 가리킵니다. 흰색 단색 화살표는 pseudo-hypha를 가리킵니다. 눈금 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: pSS 환자 구강 샘플(타액, PBS 구강 세정제 또는 구강 점막 스왑)을 사용한 대표적인 Sabouraud 포도당 한천(SDA) 배양. (A-C) 3명의 대표적인 pSS 환자의 구강 샘플을 사용한 칸디다 의 SDA 배양. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 칸디다 균주 식별. 칸디다 진단 한천을 사용하여 12명의 pSS 환자로부터 감염 가능한 칸디다균을 식별합니다. (A) pSS 환자 1-6의 구강 샘플을 사용한 칸디다 균주의 식별. pSS 환자 1: 칸디다 알비칸스, 2: 칸디다 알비칸스, 3: 칸디다 알비칸스 및 칸디다 크루세이, 4: 칸디다 알비칸스, 5: 칸디다 알비칸스 및 칸디다 글라브라타, 6: 구강 칸디다 감염 없음. (B) pSS 환자의 구강 샘플을 사용한 칸디다 균주의 식별 7-12. pSS 환자 7: 칸디다 알비칸스, 8: 칸디다 알비칸스 및 칸디다 글라브라타, 9: 경구용 칸디다 감염 없음, 10: 칸디다 알비칸스, 11: 경구용 칸디다 감염 없음, 12: 구강 칸디다 감염 없음. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 원발성 쇼그렌 증후군 환자의 정보. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 환자의 항진균제 감수성 검사 결과14,15. 약어: S = 민감성, I = 중간성, R = 내성성, SDD = 용량 의존성 민감성, C = 농도. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재 원고에서는 구강 칸디다 감염을 감지하고, 칸디다 균주를 식별하고, pSS 환자에서 일반적으로 사용되는 약물의 항진균성 감수성을 테스트하기 위한 일련의 체계적이고 간단하며 실현 가능한 방법을 제공합니다.
실제 상황에서는 이 원고에 소개된 모든 방법이 필요한 것은 아닙니다. 경구용 칸디다 검출 방법은 특정 목적에 따라 선택할 수 있습니다. 배양 없이 샘플을 사용하는 KOH 도말 검사 및 CFW 염색 분석은 pSS 환자에서 구강 칸디다 감염 여부를 빠르고 예비적으로 결정할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 상대적으로 높은 거짓음성률(false negative rate)을 갖는다16. 감염 여부를 확인하기 어려운 경우에는 칸디다 배양이 필수적입니다. 약물 내성은 치료 중에 고려해야 할 요소입니다. 일부 칸디다 균주는 일부 항진균제에 자연적으로 내성이 있으며, 예를 들어 칸디다 크루세이 는 플루코나졸17 치료에 자연적으로 내성이 있습니다. 따라서 때때로 칸디다균 의 균주를 식별해야 합니다. 이 경우, 칸디다 균주는 칸디다 진단 한천으로 식별할 수 있습니다. 현재 약물 내성 칸디다 균이 점점 더 주목을 받고 있다18. 항진균제 감수성 검사는 치료를 안내할 수 있으므로 치료 중 약물 내성을 최대한 피할 수 있습니다. 칸디다 생물막 형성 분석 및 균사 형성 분석은 구강 칸디다 감염과 관련된 연구에 적합합니다.
구강 칸디다 감염은 pSS 환자에서 가장 빈번하게 발생하는 합병증 중 하나이다4, 이로 인한 다양한 증상으로 인해 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미친다. 특히, pSS 환자는 이 감염에 매우 취약하며, 효과적인 치료를 위해서는 전신 요법과 환자의 협력이 필요한 경우가 많다19. 결과적으로, 구강 칸디다 감염은 종종 이 인구에서 재발합니다. 구강 칸디다증을 식별하고 항진균제 감수성 검사를 수행하여 치료를 안내하는 것이 중요합니다. 이 원고에 자세히 설명된 방법 중 칸디다 검출을 위한 구강 샘플 수집 및 후속 배양이 가장 중요한 단계입니다.
또한, 균사 형성이 있는 칸디다균(예: 칸디다 알비칸스)은 배양 없이 수집된 샘플을 사용하여 빠른 KOH 도말 검사 및 CFW 염색 분석으로 쉽게 검출할 수 있습니다. 대부분의 구강 칸디다 균주를 검출할 수 있고 칸디다 균주는 이 원고에 소개된 방법을 통해 식별할 수 있지만, 일부 칸디다 균주는 SDA 배양, 칸디다 진단 한천 배양, 칸디다 생물막 형성 분석 및 균사 형성 분석과 같은 방법으로만 다른 균주와 특별히 식별할 수 없습니다. 또한, 일부 칸디다 균주는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)와 같은 균사를 생성하도록 유도할 수 없습니다. 18s rDNA RT-PCR 기반 종 식별은 유전적 유사성 10,20,21에 기초하여 칸디다 종을 정확하게 식별할 수 있습니다. 필요한 경우, 예를 들어 pSS 환자의 구강 칸디다 감염에 대한 연구에서 18s rDNA RT-PCR 기반 종 식별을 활용할 수 있습니다.
구강 내에서, 칸디다 감염의 징후는 홍반성 점막 병변, 의치 구내염 및 혀의 균열로 나타날 수 있습니다. 구강 주위 부위에서 칸디다균의 집락화는 건조하고 갈라지며 홍반성 외관을 유발한다7. 임상적 구강 칸디다증의 보고된 유병률은 SS 환자에서 0%에서 80%까지 매우 다양하다. 구강 칸디다증의 큰 변동에 대한 가능한 이유에는 명확한 증상의 부족과 더 중요한 것은 문헌 8,9,12에서 구강 칸디다증 진단에 사용되는 다양한 기준이 포함됩니다. 더욱이, 칸디다 감염 환자는 SS의 위험이 더 높은 것으로 보고되고 있으며, 칸디다 감염은 후속 SS22의 초기 징후로 작용할 수 있습니다. pSS의 조기 진단은 치료 및 병리학적 연구에 매우 중요합니다. 따라서 pSS 환자에서 구강 칸디다 감염을 확인하기 위한 보편적이고 편리하며 실현 가능한 방법을 제공하는 것이 필수적입니다.
pSS 환자에서 장, 구강 및 질 마이크로바이옴의 미생물 불균형이 빈번하게 발생하지만, 구강 샘플은 미생물 변이의 정도가 가장 크다는 것을 보여준다1. 정상적인 조건에서 전체 타액의 하루 평균 유량은 1-1.5L2입니다. 타액의 99%까지는 수분으로 구성되어 있고 나머지 1%는 단백질과 이온으로 구성되어 있습니다. 타액은 여러 가지 이유로 구강 미생물군의 구성과 활성을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었습니다3. 타액은 지속적으로 치아를 청소하여 건강한 상태에서 중요한 구강 위생 기능을 수행할 뿐만 아니라 구강 표면에 컨디셔닝 필름을 형성합니다. 이 필름은 박테리아 부착을 위한 수용체를 제공하고, 당단백질에서 영양분을 공급하여 박테리아의 성장을 돕고, 박테리아 성장에 적합한 pH를 유지합니다. 또한 타액에는 미생물군을 조절하고 형성하는 항균 및 항칸디탈 인자가 포함되어 있습니다. 또한, 타액에는 아드레놈둘린(adrenomedullin), 스타테린(statherin), 히스타틴(histatins), 디펜신(α defensin), 라이소자임(lysozyme), 히스타틴(histatins), 락토페린(lactoferrin), 칼프로텍틴(calprotectin)과 같은 항균 및 항칸디즘 인자가 포함되어 있어 미생물군을 조절하고 형성한다4. pSS는 자가면역 조절 장애와 선기능 저하를 특징으로 합니다. 타액 분비량 저하증은 타액 분비의 가장 흔한 증상 중 하나입니다. 타액 pH 수치 및 혈류 감소는 구강 칸디다 감염의 중요한 위험 요인이다5. 또한, 칸디다 감염은 SS6과 관련된 두 번째로 흔한 구강 안면 합병증으로 보고되고 있습니다. 저자들은 pSS 환자에서 칸디다 감염이 증가하는 것이 타액 생성 감소뿐만 아니라 SS에 내재된 면역학적 조절 장애와도 관련이 있을 수 있다고 제안합니다.
결론적으로, 이 논문에서 소개한 경구용 칸디다 감염 및 항진균제 감수성 검사에 대한 실용적이고 재현 가능한 방법은 칸디다 감염의 임상적 식별 및 치료를 향상시킬 수 있는 가능성을 가지고 있습니다. 또한, 이러한 표준화된 절차는 구강 칸디다증과 관련된 연구 조사의 불일치를 최소화할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82201084), 중국박사후연구원(China Postdoctoral Science Foundation, 2022M722232), 베이징박사후연구원(Beijing Postdoctoral Research Foundation, 2023-ZZ-020), 베이징 톈탄병원(Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 2023MP10) 및 홍콩연구보조금위원회(Hong Kong Research Grants Council, 27111820, 17116521)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
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