Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'esame dell'infezione orale da Candida in pazienti con sindrome di Sjögren primaria, che può essere utilizzato per un trattamento tempestivo e, successivamente, per evitare complicanze correlate.
Abstract
La sindrome di Sjögren primaria (pSS) è una malattia autoimmune caratterizzata da sintomi come secchezza delle fauci, secchezza oculare e altri sintomi sistematici. A causa dell'iposalivazione sperimentata dai pazienti con pSS, si verifica spesso disbatteriosi orale. Una complicanza comune della pSS è l'infezione orale da Candida . In questo articolo, gli autori descrivono metodi sistematici in grado di diagnosticare efficacemente l'infezione orale da Candida e identificare i ceppi di Candida utilizzando saliva, tamponi della mucosa orale o collutorio di pazienti con pSS. Il test di destrosio agar (SDA) di Sabouraud, il test di formazione ifale, il test dello striscio di idrossido di potassio (KOH) e il test di colorazione bianco calcofluor (CFW) sono utilizzati per la diagnosi di infezione orale da Candida . Un agar diagnostico per Candida viene utilizzato per l'identificazione dei ceppi di Candida . Infine, il test di suscettibilità antifungina viene utilizzato per determinare il trattamento farmacologico antimicotico appropriato. Questo metodo standardizzato può migliorare la diagnosi, il trattamento e la ricerca futura delle infezioni orali da Candida correlate a pSS. La diagnosi precoce, utilizzando questo metodo, può anche prevenire eventuali complicazioni dovute al ritardo nel ricevere un trattamento appropriato.
Introduction
La candidosi è causata da Candida spp., che sono agenti patogeni opportunisti. I ceppi comuni includono Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida dubliniensis1. Le infezioni opportunistiche causate da Candida spp. includono infezioni superficiali da Candida e candidosi invasiva. La candidosi invasiva si verifica principalmente in individui immunocompromessi; ad esempio, nei pazienti con sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), la candidosi invasiva può minacciare significativamente la qualità della vita o addirittura la durata della vita2. L'infezione superficiale da Candida , come la candidosi mucocutanea, è più comune nei pazienti3.
La candidosi orale, un'infezione superficiale da Candida , è l'infezione fungina umana più comune. La Candida albicans è un normale commensale della bocca; è stato riportato che il tasso di trasporto di Candida spp. varia dal 20% al 75% nella popolazione generale senza alcun sintomo4. La crescita eccessiva di Candida può portare a disagio locale nei pazienti, come l'alterazione del gusto della sensazione, la sensazione di bruciore in bocca, la disfagia dovuta a cattiva alimentazione, il recupero ritardato e la degenza ospedaliera prolungata. La candidosi orale a lungo termine può portare a una grave candidosi invasiva, con conseguente significativa morbilità e mortalità5. La candidosi orale può anche aumentare il rischio di cancro orale5. La compromissione della funzione delle ghiandole salivari è tra i fattori di rischio per la candidosi orale6. L'inizio dell'infezione è l'adesione della Candida alle pareti cellulari epiteliali. Segue la proliferazione e la filamentazione della Candida e la formazione e maturazione del biofilm7. I biofilm sono estremamente difficili da eradicare e sono resistenti al trattamento antimicotico convenzionale, rendendo il trattamento clinico una sfida per l'infezione orale da Candida associata al biofilm7.
La sindrome di Sjögren primaria (pSS) è una malattia autoimmune caratterizzata da secchezza delle fauci, secchezza oculare e altri sintomi sistematici8. La secchezza delle fauci è il sintomo più frequente della pSS. La saliva ha importanti funzioni antimicotiche fisiologiche. Da un lato, può diluire e strofinare la bocca e successivamente rimuovere gli organismi dalla mucosa. D'altra parte, la saliva contiene proteine antimicrobiche, come lattoferrina, scialoperossidasi, lisozima, polipeptidi ricchi di istidina e anticorpi specifici anti-candida, che possono interagire con la mucosa orale e prevenire la crescita eccessiva di Candida6. Il ridotto flusso di saliva può predisporre i pazienti con pSS alla candidosi orale. Uno studio osservazionale trasversale condotto su 61 pazienti con pSS ha rilevato che il 13,1% dei pazienti con pSS presentava segni orali di candidosi e l'unità formante colonie (CFU)/mL di Candida albicans è risultata significativamente e negativamente correlata con i livelli di saliva intera non stimolata (UWS) e saliva intera stimolata (SWS)9.
I metodi introdotti in questo manoscritto possono identificare l'infezione orale da Candida in base ad attributi morfologici caratterizzati (ad esempio, le ife e le cellule di lievito) in striscio diretto o dopo coltura10. L'identificazione del ceppo della Candida utilizzando un agar diagnostico per Candida si basa sulla formazione di colonie di diversi colori con morfologia varia, che derivano dalla scissione dei substrati cromogenici da parte di enzimi specie-specifici11. In questo manoscritto vengono introdotti metodi sistematici per rilevare l'infezione orale da Candida , tra cui la tradizionale coltura orale di Candida e l'esame rapido mediante striscio di idrossido di potassio (KOH) e test di colorazione calcofluor white (CFW)10. Inoltre, è stato introdotto il test di suscettibilità antifungina, che può guidare il trattamento clinico orale dell'infezione da Candida . In situazioni reali, non è necessario eseguire tutti i metodi introdotti in questo manoscritto; i metodi di rilevamento orale della Candida possono essere selezionati in base allo scopo. L'esame dell'infezione orale da Candida e la determinazione dei ceppi di Candida nei pazienti con pSS non solo avvantaggiano il trattamento della malattia, ma aiutano anche a valutare la caratterizzazione della candidosi orale e i profili delle specie.
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Protocol
Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dal Comitato etico del Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (NO. KY2023-177-01) e tutti i pazienti coinvolti in questo studio hanno fornito il consenso informato.
1. Criteri di inclusione ed esclusione del paziente
- Criteri di inclusione: classificare i pazienti come pazienti con pSS se soddisfano i criteri 12 dell'American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR)del 2016. In particolare, basare i criteri di classificazione finale sulla somma ponderata di cinque elementi: positività agli anticorpi anti-SSA/Ro e scialoadenite linfatica focale con un punteggio di focus di ≥ 1 focolai/4 mm2, ciascuno con un punteggio di 3; un punteggio di colorazione oculare anormale di ≥ 5 (o punteggio di van Bijsterveld di ≥ 4), un risultato del test di Schirmer di ≤ 5 mm/5 min e una velocità di flusso salivare non stimolata di ≤ 0,1 ml/min, ciascuno con un punteggio di 1. Gli individui con segni e/o sintomi suggestivi di SS che hanno un punteggio totale di ≥ 4 per gli elementi di cui sopra soddisfano i criteri per la pSS.
- Criteri di esclusione: escludere i pazienti che non possono collaborare con la raccolta del campione e i pazienti che stanno ricevendo un trattamento per l'infezione orale da Candida .
NOTA: È essenziale notare che i metodi descritti di seguito sono adatti anche per la caratterizzazione completa delle infezioni orali da Candida in individui con SS secondaria. - Per prevenire potenziali contaminazioni durante la raccolta, il trasporto e la coltura dei campioni di Candida , prendere precauzioni meticolose. Ciò include una meticolosa preparazione sperimentale, l'uso di materiali monouso e sterili, un'etichettatura adeguata, una sigillatura sicura delle provette di campionamento e l'esecuzione di procedure sperimentali in una cabina di biosicurezza professionale.
2. Raccolta del campione
- Raccolta della saliva: Istruire i pazienti a tenere la provetta con un imbuto e lasciare che la saliva fluisca gradualmente nella provetta lungo il labbro inferiore. Al termine della raccolta, chiedere al paziente di sputare tutta la saliva rimanente in bocca nella provetta. Raccogli la saliva per 15 min.
- Collutorio e raccolta di tamponi: se il paziente ha un flusso salivare non stimolato assente o estremamente basso (inferiore a 0,03 ml/min), tamponare l'area della mucosa orale con sospetta infezione orale da Candida almeno 10 volte, quindi chiedere al paziente di utilizzare 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; vedere Tabella dei materiali) per sciacquare la bocca per 1 minuto. Conservare il collutorio in una provetta sterile da 50 ml e inserire il tampone nella provetta del collutorio.
NOTA: Per i pazienti con pSS con flusso salivare non stimolato superiore a 0,03 ml/min, la fase 2.2 può ancora essere utilizzata per raccogliere campioni per il rilevamento orale dell'infezione da Candida .
3. Elaborazione del campione
- Aggiungere 1 ml di PBS alla saliva raccolta. Non aggiungere PBS nel collutorio con PBS. Vibrare il tubo del collutorio usando un vortice per 1 minuto.
4. Cultura della candida
- Per rendere il terreno Sabourand's Agar (SDA), sciogliere 70 g di SDA (vedi Tabella dei materiali) in 1000 ml di acqua bidistillata.
- Sterile in autoclave a 121 °C per 15 minuti, preparare 10 mL di questo terreno SDA in una piastra di coltura microbiologica da 10 cm (vedere la Tabella dei materiali) e raffreddare.
- Prelevare 200 μl di campione preparato nella fase 3 e strizzarlo sulle piastre di coltura microbiologica da 10 cm preparate con 10 mL di terreno SDA nella fase 4.2.
- Incubare per 48 ore a 37 °C e la colonia di Candida maturerà. Conservare temporaneamente la capsula SDA con colonie di Candida a 4 °C. Le colonie di Candida coltivate sul piatto SDA possono essere conservate per 2-4 settimane.
5. Identificazione del ceppo di Candida
- Per preparare il terreno, prelevare 47,7 g di polvere di agar diagnostico per Candida (vedi Tabella dei materiali), metterla in 1000 ml di acqua distillata doppia e riscaldarla a 100 °C.
- Quando il terreno è leggermente bollente, impiattare 10 ml in un piatto di coltura microbiologica di 10 cm e lasciare raffreddare.
- Sciogliere le colonie di Candida in 500 μL di terreno SDA (fase 4), sospendere e dissociare mediante pipettaggio.
- Preparare 50 μl del campione con colonie di Candida (fase 5.3) sul terreno preparato nella fase 5.2. Incubare per 48 ore a 37 °C fino a quando le colonie di Candida sono mature.
- In base al colore e ai modelli delle colonie di Candida , determinare i ceppi della Candida acquisita da pazienti con pSS. Utilizzare i seguenti criteri di identificazione del ceppo di Candida : la colonia verde smeraldo è Candida albicans, la colonia grigio-blu è Candida tropicalis, le colonie rosa con bordi sfocati e microvilli sono Candida krusei, la piccola colonia rosso violaceo è Candida glabrata, la colonia bianco latte contiene diversi ceppi tra cui Candida parapsilosis.
6. Saggio di formazione del biofilm di Candida
- Per rendere il terreno di base di azoto per lievito (YNB)-50 glucosio (G), pesare 1,34 g YNB (vedi Tabella dei materiali) e 1,98 g D (+)-glucosio (vedi Tabella dei materiali). Scioglierli in 200 ml di acqua distillata doppia.
- Per rendere l'YNB-100G un mezzo, estrarre 1,34 g di YNB e 3,96 g di D (+)-glucosio e scioglierli in 200 ml di acqua distillata doppia.
- Filtrare le soluzioni con un filtro per siringa da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali). Il terreno filtrato YNB-50G e YNB-100G può essere conservato a 4 °C per 3 mesi.
- Prelevare le 3 (o più) colonie dallo stesso ceppo sulle piastre nella fase 5 e trasferirle in 200 μL di terreno YNB-50G (fasi 6.1 e 6.3) in una piastra a 96 pozzetti (vedere Tabella dei materiali). Fallo per le varietà osservate nel piatto. Coltura notturna a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
- Aspirare la sospensione di Candida , aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare le cellule di lievito a 1500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte nella stessa provetta.
- Risospendere le cellule in 1 mL di terreno YNB-100G e preparare diverse diluizioni (1:10, 1:100 e 1:1000) di cellule. Prelevare 200 μl di sospensione cellulare a gradiente e piastrare sul terreno SDA da 10 cm con il metodo della piastra a spirale13. La placcatura viene eseguita utilizzando una macchina che deposita un volume noto di campione su una piastra di agar rotante in quantità sempre minore sotto forma di spirale di Archimede. Coltura per 24-48 ore a 37 °C.
- Calcolare la concentrazione di cellule in diverse diluizioni in base al numero di CFU nella piastra SDA sulla base di un metodo standard13. Conta brevemente le colonie ben separate su ogni piatto. Contare le colonie in un ottante dal bordo esterno verso il centro fino a quando non si osservano almeno 25 colonie. Inoltre, conta il resto di quell'arco in cui si è verificato il 25° conteggio. Calcolare la concentrazione delle cellule dividendo il conteggio delle colonie per il volume liquido corrispondente all'area su cui è stato ottenuto il conteggio delle colonie13. Regolare la concentrazione di cellule a 1 x 107 cellule/mL.
- Mettere 100 μl della sospensione cellulare in YNB-100G in una piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 °C per 2 ore agitando a 200 giri/min.
- Estrarre con cautela il surnatante, lavare 2 volte con PBS e rimuovere le cellule di lievito galleggianti. Il biofilm di Candida si forma sul fondo della piastra a 96 pozzetti.
7. Saggio di formazione ifa
NOTA: Solo la Candida che può formare ife (come la Candida albicans) può essere indotta per la formazione di ife. Vai al passaggio 8 per un'ulteriore caratterizzazione della Candida che non può formare ife (come la Candida glabrata).
- Risospendere la sospensione di cellule di lievito al punto 6.6 e regolare la concentrazione cellulare a 1 x 106 cellule/mL con terreno YNB-100G.
- Per preparare il terreno di coltura completo RPMI 1640, aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (vedere Tabella dei materiali) in 450 ml di terreno RPMI 1640 (vedere Tabella dei materiali) e conservare a 4 °C per ulteriori esperimenti.
- Trasferire 2 μL di sospensione cellulare di Candida diluita in 200 μL di terreno di crescita completo RPMI 1640 in una piastra a 96 pozzetti e coltura per una notte a 37 °C per consentire la formazione delle ife e delle cellule di lievito.
8. Striscio di KOH e test di colorazione CFW
- Prelevare 1 μL di campioni dalla fase 3 o dalla fase 6 o dalla fase 7 utilizzando un anello stampato di precisione (vedere la Tabella dei materiali) e spalmare un'area di 1 cm x 1 cm sui vetrini. Aspetta che si asciughi a temperatura ambiente.
- Per ottenere una soluzione di KOH al 10%, pesare 10 g di polvere di KOH (vedere la Tabella dei materiali) e scioglierla in 100 mL di acqua bidistillata.
- Riscaldare leggermente il vetrino con una lampada ad alcool fino a quando il campione non si dissolve. Colorare i vetrini preparati al punto 8.1 con KOH al 10% (passaggio 8.2) e coprire con un vetrino coprioggetto. Premere leggermente il vetrino coprioggetti per rendere trasparente il campione.
- Visualizza le ife e le cellule di lievito al microscopio.
- Colorare i vetrini preparati al punto 8.1 con una goccia di CFW (vedi Tabella dei materiali), coprire con un vetrino coprioggetti e attendere 1 min.
- Visualizzare le ife utilizzando un microscopio a fluorescenza agli ingrandimenti di 100x e 200x. La CFW viene eccitata a 355 nm e rilevata a 300-440 nm. Fotografare le immagini con il tempo di esposizione. Ripetere 3 volte per evitare risultati falsi positivi.
9. Test di sensibilità antifungina
NOTA: Questo test viene eseguito secondo le istruzioni del produttore per il kit di suscettibilità fungina simile al lievito (microdiluizione; vedere la tabella dei materiali).
- Preparare colonie di Candida (fase 4) di età inferiore a 4 giorni con l'ampolla di NaCl allo 0,85% (vedi Tabella dei materiali) e acquisire la sospensione avente la torbidità equivalente a 2 McFarland. Determinare la torbidità secondo il kit di standard McFarland (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare immediatamente la sospensione di Candida preparata.
- Pipettare 135 μL di terreno ATB F2 nel kit contenente 3 x 104 cellule di lievito/mL in ciascuna cupola della striscia reattiva e mettere il coperchio. Metti la striscia reattiva in un contenitore sigillato. Coltura per 24 ore a 35 °C.
- Osservare la crescita della Candida con l'interpretazione visiva (fare riferimento al manuale d'uso). Per il valore di riferimento (intervallo di riferimento), fare riferimento al manuale dell'utente. Controllare se il foro di controllo sta crescendo adeguatamente. Se la crescita del foro di controllo è insufficiente o non cresce, i risultati non possono essere letti e necessitano di altre 24 ore di coltivazione.
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Representative Results
In questo studio, 12 pazienti con pSS sono stati selezionati come pazienti rappresentativi e sottoposti a screening per l'infezione orale da Candida (Tabella 1). Tra questi pazienti, alcuni pazienti presentavano lesioni orali tipiche dell'infezione da Candida , tra cui cheilite angolare (caratterizzata da crepe agli angoli della bocca, desquamazione e iperemia, Figura 1A), edema rosso vivo sulla mucosa gengivale, pseudomembrana filamentosa bianco-giallastra (Figura 1B), atrofia delle papille linguali e mucosa dorsale della lingua di colore rosso vivo (Figura 1C).
Tra questi 12 pazienti coinvolti nel presente studio, 8 di loro avevano un'infezione orale da Candida, che è stata confermata dalla crescita di colonie di Candida sulle piastre SDA (Figura 2A-C e Figura supplementare 1). L'agar diagnostico ha mostrato che tra questi pazienti con PSS esistono infezioni orali da Candida albicans, Candida krusei e Candida glabrata (Figura 2D-F, Figura supplementare 2A, B). In alcuni casi, è stata rilevata più di una specie di Candida, come un'infezione combinata da Candida albicans e Candida krusei, nonché un'infezione combinata da Candida albicans e Candida glabrata (Figura 2D, Figura 2A, B supplementare).
Il test dello striscio KOH e il successivo test di colorazione CFW, utilizzando campioni di saliva del paziente o tamponi della mucosa orale, possono determinare rapidamente se il paziente ha un'infezione orale da Candida . In questo studio, la presenza di ife è stata osservata in entrambi i campioni orali di pazienti con pSS (Figura 3A, B). Il risultato è stato ulteriormente convalidato dal test di colorazione CFW, che ha mostrato una colorazione fluorescente positiva delle ife (Figura 3C, D). Inoltre, le ife di un paziente con pSS infettato da Candida albicans orale erano inducibili attraverso il test di formazione ifa (Figura 4A) e le ife indotte sono state osservate al microscopio a fluorescenza nel test di colorazione CFW (Figura 4D). Inoltre, il test dello striscio KOH e il test di colorazione CFW hanno indicato spore fungine e pseudoife positive da un paziente con infezione da Candida krusei (Figura 4B, E) e spore fungine da un paziente con infezione da Candida glabrata (Figura 4C, F), dopo la formazione del biofilm di Candida .
I test di suscettibilità antifungina sono fondamentali per guidare la gestione clinica delle infezioni orali da Candida nei pazienti con pSS. Qui, tre pazienti rappresentativi sono stati testati per la suscettibilità antifungina a cinque agenti comunemente prescritti: fluconazolo, itraconazolo, amfotericina B, voriconazolo e 5-fluconazolo. I risultati sono stati interpretati secondo le linee guida del produttore. I pazienti con pSS 1 e 3 hanno mostrato sensibilità a tutti gli agenti antifungini testati (Tabella 1)14,15. Il paziente pSS 2 ha dimostrato una risposta intermedia dose-dipendente a fluconazolo e voriconazolo, una sensibilità dose-dipendente, da intermedia a resistente all'itraconazolo, resistenza al 5-fluconazolo e sensibilità al trattamento con amfotericina B (Tabella 2)14,15.
Figura 1: Manifestazioni orali rappresentative dell'infezione orale da Candida . (A) Cheilite angolare (ragadi agli angoli della bocca, desquamazione e iperemia). (B) Una lesione eritematosa con edema sulla mucosa gengivale alveolare, con una pseudomembrana filamentosa bianco-giallastra. (C) Dorso atrofico delle papille linguali con lesione eritematica atrofica dispersa e irregolare, arrossata e circoscritta. Le frecce nere indicano le lesioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione del destrosio agar Sabouraud (SDA) e del ceppo di Candida . (A-C) La coltura SDA di campioni orali (saliva, collutorio PBS o scambio di mucosa orale) da 3 pazienti rappresentativi con pSS con infezione da Candida . Il test di identificazione del ceppo di Candida utilizzando un agar diagnostico di Candida mostra pazienti con pSS con infezioni orali da Candida albicans più Candida Krusei , (E) infezione da Candida albicans e (F) infezione da Candida glabrata . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Striscio istantaneo di idrossido di potassio (KOH) e test di colorazione con calcofluor white (CFW). Il test è stato eseguito utilizzando campioni orali (saliva, collutorio PBS o scambio di mucosa orale) da 2 pazienti rappresentativi con pSS. Test dello striscio KOH utilizzando il campione orale del paziente pSS 1 e del paziente 2 pSS (B). Le frecce nere e cave puntano alle ife. Test di colorazione CFW utilizzando il campione orale del paziente pSS 1 (C) e del paziente pSS 2 (D). Le frecce cave bianche indicano le ife e le spore fungine. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Striscio di idrossido di potassio (KOH), saggio di colorazione con calcofluor white (CFW) dei campioni dopo la coltura. Test dello striscio KOH utilizzando la saliva di un paziente pSS con (A) infezione da Candida albicans , (B) paziente pSS con infezione da Candida krusei e (C) paziente pSS con infezione da Candida glabrata . Saggio di colorazione CFW di ife indotte da paziente pSS con infezione da (D) Candida albicans , spore fungine e pseudo-ifa da (E) paziente pSS con infezione da Candida krusei e spore fungine da (F) paziente pSS con infezione da Candida glabrata . Le frecce cave bianche puntano alle ife; le frecce bianche puntano alla pseudo-ifa. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Coltura rappresentativa di destrosio agar (SDA) di Sabouraud utilizzando campioni orali di pazienti con pSS (saliva, collutorio PBS o scambio di mucosa orale). (A-C) Coltura SDA di Candida utilizzando campioni orali di 3 pazienti con pSS rappresentativi. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Identificazione del ceppo di Candida . L'identificazione della possibile Candida infetta dai 12 pazienti con pSS utilizzando un agar diagnostico di Candida . (A) L'identificazione del ceppo di Candida utilizzando campioni orali di pazienti con pSS 1-6. paziente pSS 1: Candida albicans, 2: Candida albicans, 3: Candida albicans e Candida krusei, 4: Candida albicans, 5: Candida albicans e Candida glabrata, 6: nessuna infezione orale da Candida . (B) L'identificazione del ceppo di Candida utilizzando campioni orali di pazienti con pSS 7-12. paziente 7: Candida albicans, 8: Candida albicans e Candida glabrata, 9: nessuna infezione orale da Candida , 10: Candida albicans, 11: nessuna infezione orale da Candida , 12: nessuna infezione orale da Candida . Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella 1: Informazioni sui pazienti con sindrome di Sjögren primaria. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Risultati dei test di suscettibilità antifungina dei pazienti14,15. Abbreviazioni: S = sensibile, I = intermedio, R = resistente, SDD = sensibile dose-dipendente, C = concentrazione. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Nel presente manoscritto, forniamo una serie di metodi sistematici, semplici e fattibili per rilevare le infezioni orali da Candida , identificare i ceppi di Candida e testare la suscettibilità antifungina dei farmaci comunemente usati nei pazienti con pSS.
In contesti pratici, non tutti i metodi introdotti in questo manoscritto sono necessari. I metodi di rilevamento orale della Candida possono essere scelti in base allo scopo specifico. I test di striscio KOH e i test di colorazione CFW, utilizzando campioni senza coltura, possono determinare rapidamente e preliminarmente la presenza di infezione orale da Candida nei pazienti con pSS. Tuttavia, questi metodi hanno un tasso di falsi negativi relativamente alto16. Se è difficile confermare l'infezione, la coltura della Candida è essenziale. La resistenza ai farmaci è un fattore che deve essere considerato durante il trattamento; alcuni ceppi di Candida sono naturalmente resistenti ad alcuni farmaci antifungini, ad esempio, la Candida krusei è naturalmente resistente al trattamento con Fluconazolo17. Pertanto, a volte, il ceppo di Candida deve essere identificato. In questo caso, il ceppo di Candida può essere identificato da un agar diagnostico di Candida . Attualmente, la Candida resistente ai farmaci sta ricevendo una crescente attenzione18. Il test di sensibilità antimicotica può guidare il trattamento e quindi evitare il più possibile la resistenza ai farmaci durante il trattamento. Il saggio di formazione del biofilm di Candida e il test di formazione di ife sono adatti per la ricerca relativa all'infezione orale da Candida .
L'infezione orale da Candida è una delle complicanze più frequenti nei pazienti con pSS4, con un impatto significativo sulla loro qualità di vita a causa della serie di sintomi che causa. In particolare, i pazienti con pSS sono altamente suscettibili a questa infezione e un trattamento efficace spesso richiede una terapia sistemica e la cooperazione del paziente19. Di conseguenza, le infezioni orali da Candida sono spesso ricorrenti in questa popolazione. È fondamentale identificare la candidosi orale ed eseguire test di suscettibilità antifungina per guidare il trattamento. Tra i metodi descritti in questo manoscritto, la raccolta di campioni orali per il rilevamento della Candida e la successiva coltura sono i passaggi più critici.
Inoltre, la Candida che ha formazione ifa (come la Candida albicans) può essere facilmente rilevata dal test rapido dello striscio KOH e dal test di colorazione CFW utilizzando campioni raccolti senza coltura. Sebbene la maggior parte delle infezioni orali da Candida possa essere rilevata e i ceppi di Candida possano essere identificati attraverso i metodi introdotti in questo manoscritto, alcuni ceppi di Candida non possono essere identificati da altri specificamente solo con metodi come la coltura SDA, la coltura diagnostica di agar Candida, il test di formazione di biofilm Candida e il test di formazione ifale. Inoltre, alcuni ceppi di Candida non possono essere indotti a produrre ife, come la Candida glabrata. L'identificazione delle specie basata su RT-PCR a 18 rDNA può identificare con precisione le specie di Candida in base alla loro somiglianza genetica 10,20,21. Se necessario, l'identificazione delle specie basata su RT-PCR a 18 RNA può essere utilizzata, ad esempio, nella ricerca sull'infezione orale da Candida nei pazienti con pSS.
Per via intraorale, la manifestazione dell'infezione da Candida può presentarsi come lesioni eritematose della mucosa, stomatite da protesi e fessurazione della lingua. Nell'area periorale, la colonizzazione della Candida provoca un aspetto secco, screpolato ed eritematoso7. La prevalenza riportata di candidosi orale clinica varia ampiamente nei pazienti con SS, dallo 0% all'80%. Le possibili ragioni dell'ampia variazione della candidosi orale includono la mancanza di una chiara sintomatologia e, soprattutto, i diversi criteri utilizzati per la diagnosi di candidosi orale in letteratura 8,9,12. Inoltre, i pazienti con infezione da Candida hanno un rischio più elevato di SS e l'infezione da Candida può agire come un segno precoce di successiva SS22. La diagnosi precoce della pSS è fondamentale per il trattamento e lo studio patologico. Pertanto, è imperativo fornire metodi universali, convenienti e fattibili per identificare l'infezione orale da Candida nei pazienti con pSS.
Sebbene la disbiosi nel microbioma intestinale, orale e vaginale sia frequente nei pazienti con pSS, i campioni orali mostrano la massima estensione della variazione microbica1. In condizioni normali, il flusso medio giornaliero di saliva intera è compreso tra 1 e 1,5 L2. Fino al 99% della saliva è costituita da acqua e il restante 1% è composto da proteine e ioni. Si dice che la saliva svolga un ruolo importante nella determinazione della composizione e dell'attività del microbiota orale per molteplici ragioni3. La saliva non solo pulisce continuamente i denti, svolgendo funzioni cruciali di igiene orale in condizioni sane, ma forma anche un film condizionante sulle superfici orali. Questo film fornisce recettori per l'attaccamento dei batteri, aiuta nella crescita dei batteri fornendo loro sostanze nutritive dalle glicoproteine e mantiene un pH adatto per la crescita batterica. Inoltre, la saliva contiene fattori antimicrobici e anti-candidali che regolano e modellano il microbiota. Inoltre, la saliva contiene fattori antimicrobici e anti-candidali, come adrenomedullina, statirina, istatine, α-defensine, lisozima, istatine, lattoferrina e calprotectina, che regolano e modellano il microbiota4. La pSS è caratterizzata da deregolazione autoimmune e ipofunzione ghiandolare. L'iposalivazione, una riduzione del flusso salivare, è uno dei sintomi più diffusi della pSS. La diminuzione dei livelli di pH salivare e del flusso sono fattori di rischio significativi per le infezioni orali da Candida 5. Inoltre, le infezioni da Candida sono riportate come la seconda complicanza orofacciale più comune associata alla SS6. Gli autori suggeriscono che l'aumento delle infezioni da Candida nei pazienti con pSS può essere collegato non solo alla diminuzione della produzione di saliva, ma anche alla deregolazione immunologica inerente alla SS.
Per concludere, i metodi pratici e riproducibili per l'infezione orale da Candida e i test di suscettibilità antifungina introdotti in questo manoscritto sono promettenti per migliorare l'identificazione clinica e il trattamento delle infezioni da Candida . Inoltre, queste procedure standardizzate possono ridurre al minimo le incongruenze negli studi di ricerca relativi alla candidosi orale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (82201084), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2022M722232), dalla Beijing Postdoctoral Research Foundation (2023-ZZ-020), dal Miaopu Project del Beijing Tiantan Hospital, dalla Capital Medical University (2023MP10) e dal General Research Fund, Hong Kong Research Grants Council (27111820 e 17116521).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
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