Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo's in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening
Summary
Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.
Abstract
Biologische cellen worden gewoonlijk waargenomen op vlakke (2D) oppervlakken. Deze voorwaarde is niet fysiologische en fenotypes en vormen zijn zeer variabel. Screening op basis van cellen in dergelijke omgevingen hebben dus ernstige beperkingen: celorganellen tonen extreme fenotypes cel morfologie en grootte zijn heterogeen en / of specifieke celorganellen niet goed zichtbaar is. Bovendien, cellen in vivo in een 3D-omgeving; in deze situatie cellen vertonen verschillende fenotypen vooral door hun interactie met de omringende extracellulaire matrix van het weefsel. Om standaardiseren en genereren orde van enkele cellen in een fysiologisch relevante 3D omgeving voor cel-gebaseerde testen, beschrijven we hier de microfabricage en toepassingen van een inrichting voor in vitro 3D celkweek. Deze inrichting bestaat uit een 2D reeks microcavities (gewoonlijk 10 5 holten / cm 2), elk gevuld met losse cellen of embryo's. cel positie, vorm, polariteit en de interne organisatie van de cel worden dan genormaliseerd met een 3D-architectuur. We gebruikten replica molding patroon een reeks van microcaviteiten, 'eierdopjes', op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een dekglaasje. Holtes waren bedekt met fibronectine hechting vergemakkelijken. Cellen werden ingebracht door centrifugeren. Vervullingspercentage werd geoptimaliseerd voor elk systeem waardoor tot 80%. Cellen en embryo levensvatbaarheid werd bevestigd. Wij pasten deze methode voor de visualisatie van cellulaire organellen zoals kern en Golgi apparaat en actieve processen, zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic celmitose bestuderen. Dit apparaat kon de identificatie van nieuwe functies, zoals periodieke ophopingen en inhomogeniteiten van myosine en actine tijdens de cytokinetic ring sluiting en verdicht fenotypes voor Golgi en de kern uitlijning. Wij karakteriseerden de werkwijze voor zoogdiercellen, splijtgist, gist, C. elegans wide specifieke aanpassing in elk geval. Tenslotte, de kenmerken van dit apparaat worden bijzonder interessant voor screeningstesten voor geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde.
Introduction
Huidige in vitro op cellen gebaseerde assays zijn tweedimensionale (2D). Deze configuratie is niet natuurlijk voor zoogdiercellen en dus niet fysiologisch relevant 1; cellen vertonen een diversiteit aan vormen, maten en heterogene fenotypes. Zij presenteren op ernstige beperkingen bij toepassing op screening toepassingen, zoals een wanordelijke verdeling binnen het vliegtuig en extreme fenotypes van cellulaire organellen (stress vezels, in het bijzonder). Dit is vooral belangrijk bij klinische proeven voor het testen van geneesmiddelen, waarbij hoge budgetten jaarlijks worden uitgegeven. De meeste van deze geneesmiddelen echter niet wanneer toegepast op diermodellen vanwege de kunstmatige 2D kweekomstandigheid in een vroege drug discovery. Bovendien gegevens geven specifieke celorganellen kan niet goed zichtbaar, zoals cytokinetic actomyosine ring tijdens celmitose en algemeen structuren die evolueren in het vlak loodrecht op het vlak van waarneming. sommigenieuwe 2D assays zijn om te overwinnen de bovengenoemde nadelen en belangrijke inzichten cytoskelet organisatie waargenomen 2,3 voorgesteld. Echter, deze testen nog onderhavige serieuze beperking: cellen vertonen een fenotype spreiding in tegenstelling tot wat wordt waargenomen in vivo, waarbij cellen vormen een 3D architectuur. Deze artefacten in verband met de kweekmethode kan niet-fysiologische functies te sturen, zoals verhoogde stress-vezels 1,4,5.
Driedimensionale celcultuur assays om talrijke voordelen ten opzichte van 2D omgevingen 6,7. Ze zijn fysiologisch relevanter en resultaten zijn daarom zinvol. Als voorbeeld, cellen ingebed in hydrogels tonen 3D-structuren maar hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere 8,9. Echter, hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere, waarbij het screenen bemoeilijkt. Een alternatieve strategie is om insluiten enkelcellen in microfabricated holten 10,11. Cell positie, vorm, polariteit en de interne organisatie cel kan vervolgens genormaliseerd worden. Naast het verstrekken van 3D-achtige architectuur aan cellen, microcaviteiten maakt het ook mogelijk voor high-gehalte screening studies 10,12-14; enkele cellen kunnen worden besteld in microarrays en cellulaire organellen en hun evoluties kunnen parallel worden waargenomen. Deze regelmaat biedt goede statistieken met een gering aantal cellen en betere temporele / ruimtelijke resoluties. Bruikbare verbindingen zijn gemakkelijker betrouwbaar te identificeren.
In deze studie tonen we de fabricage en toepassing van een nieuwe 3D-achtige enkele cellen kweeksysteem voor high-content-screening toepassingen 10,12,13. De inrichting bestaat uit een matrix van elastomeer microcavities (10 holten 5 / cm 2), bedacht 'eierdopjes (EC). Afmetingen en de totale omvang van de EC in dit werk zijn geoptimaliseerd om de typische volume van één NIH3T3 en HeLa-cellentijdens de celdeling. Morfologie van de holten – cilindrische – is geselecteerd goed oriënteren celvorm voor de visualisatie van actieve processen. Replica gieten wordt gebruikt voor het patroon van een array van de EG op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een glazen dekglaasje 15,16. De cellen worden in de EG geïntroduceerd door centrifugeren. Wij rapporteren hier observatie en normalisatie van cellulaire organellen (actine stressvezels, Golgi-apparaat en nucleus) in 3D (EG) in vergelijking met dezelfde cellen 2D (vlakke) oppervlakken. Wij rapporteren ook de waarneming van actieve dynamische processen zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic actomyosine celmitose 17. Tot slot laten we resultaten van deze methodologie op andere systemen met vaste wanden, zoals gist, splijtgist en C. elegans embryo's die de toepasbaarheid van onze methodologie bevestigt aan een breed scala van modelsystemen.
We naast een gedetailleerd en uitputtend pROTOCOL om te fabriceren en de 'eierdopjes "3D microfabricatie toepassing. Onze benadering is eenvoudig en vereist geen schone ruimte nodig. We verwachten dat deze nieuwe methode met name interessant voor drug screeningstesten en gepersonaliseerde geneeskunde zal zijn, ter vervanging van petrischaaltjes. Tenslotte zal ons apparaat bruikbaar voor het bestuderen van de verdelingen van cellen reacties op externe stimuli, bijvoorbeeld kanker 18 en fundamenteel onderzoek 19 zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Replica vormstuk werd gebruikt om de 'eierdopjes' fabriceren. Het fabricageproces niet een schone kamer nodig; het is eenvoudig, hoewel enige oefening vereist zijn. Vooral vrijgeven van de PDMS stempel is de meest kritische stap om een groot gebied van hoge kwaliteit "eggcups 'produceren. Daarom speciale zorg moet worden genomen in deze stap. Als deze stap herhaaldelijk faalt, overweeg dan om het plasma schoner parameters voorafgaand aan de silanisatie en plasma binding te optimaliseren. Onvoldoen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen L. Brino (IGBMC High Content Screening faciliteit, Illkirch, Frankrijk) voor het verstrekken van ons met de anti-Giantin antilichaam, M. Labouesse Lab. voor C. elegans (IGBMC) en B. Séraphin Lab. voor gist (IGBMC), E. Paluch en A. Hyman voor TL HeLa-cellen (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) en JQ Wu (Ohio State University) voor kernsplijting gistcellen; A. Hoël en F. EVENOU voor experimentele hulp, C. Rick (IBMC, Straatsburg, Frankrijk) voor technische hulp, en JC Jeannot (Femto-st, Frankrijk) voor hulp bij het microfabrication. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het CNRS, de Universiteit van Straatsburg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale en de ci-FRC van Straatsburg.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Riveline, D., Buguin, A. . Devices and methods for observing the cell division. , (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Riveline, D. . Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , (2012).
- Riveline, D., Wollrab, V. . Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G., Hughes, M. P., Hoettges, K. F. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. 583, 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
