Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit
Summary
Nous rapportons un dispositif et une nouvelle méthode pour étudier les cellules et les embryons. Les cellules individuelles sont précisément commandées dans des tableaux de microcavité. Leur confinement 3D est une étape vers des environnements 3D rencontrés dans des conditions physiologiques et permet l'orientation des organites. En contrôlant la forme des cellules, cette configuration réduit la variabilité signalée dans des essais standard.
Abstract
cellules biologiques sont habituellement observées sur (2D) des surfaces planes. Cette condition est non physiologique et les phénotypes et les formes sont très variables. Le dépistage à base de cellules dans de tels environnements ont des limitations donc graves: organites cellulaires présentent des phénotypes extrêmes, morphologies cellulaires et tailles sont des organites cellulaires hétérogènes et / ou spécifiques ne peuvent pas être correctement visualisés. En outre, des cellules in vivo sont situées dans un environnement 3D; Dans cette situation, les cellules présentent des phénotypes différents principalement en raison de leur interaction avec la matrice extracellulaire autour du tissu. Afin de normaliser et de générer l' ordre de cellules individuelles dans un environnement 3D physiologiquement pertinents pour des essais à base de cellules, nous rapportons ici la microfabrication et les applications d'un dispositif de culture in vitro de cellules 3D. Ce dispositif se compose d'un tableau 2D de microcavités (typiquement 5 à 10 alvéoles / cm 2), chacun rempli avec les cellules ou les embryons isolés. cellule position, la forme, la polarité et l'organisation interne de la cellule deviennent alors normalisée montrant une architecture 3D. Nous avons utilisé réplique moulage pour motif un tableau de microcavités, «coquetiers», sur un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche collée sur une lamelle. Caries étaient recouverts de fibronectine pour faciliter l'adhérence. Les cellules ont été insérées par centrifugation. le pourcentage de remplissage a été optimisé pour chaque système permettant jusqu'à 80%. Les cellules et les embryons viabilité a été confirmée. Nous avons appliqué cette méthode pour la visualisation des organites cellulaires, comme noyau et appareil de Golgi, et d'étudier les processus actifs, tels que la fermeture de l'anneau cytokinétique lors de la mitose cellulaire. Ce dispositif a permis l'identification de nouvelles fonctionnalités, telles que des accumulations et des inhomogénéités de la myosine et l'actine périodiques lors de la fermeture du cycle cytokinétique et phénotypes compactés pour Golgi et l'alignement noyau. Nous avons caractérisé la méthode pour les cellules de mammifères, levure de fission, la levure bourgeonnante, C. elegans wième adaptation spécifique dans chaque cas. Enfin, les caractéristiques de ce dispositif, il est particulièrement intéressant pour les tests de dépistage des drogues et de la médecine personnalisée.
Introduction
Courant dans des essais à base de cellules in vitro sont deux dimensions (2D). Cette configuration est pas naturelle pour les cellules de mammifère et donc pas physiologiquement pertinente 1; cellules présentent une grande diversité de formes, de tailles et de phénotypes hétérogènes. Ils présentent de sérieuses limitations supplémentaires lorsqu'il est appliqué à des applications de dépistage, comme une distribution désordonnée dans le plan et les phénotypes extrêmes de organites cellulaires (fibres de stress, en particulier). Ceci est particulièrement important dans les essais cliniques pour le dépistage des drogues, où les hautes budgets sont dépensés chaque année. La plupart de ces médicaments ne parviennent que lorsqu'ils sont appliqués à des modèles animaux en raison de la condition de culture 2D artificiel dans les stades précoces du criblage des médicaments. En outre, en utilisant cette approche, des organites cellulaires spécifiques ne peut pas être visualisée correctement, comme la bague de actomyosine cytokinétique pendant la mitose cellulaire et, en général des structures qui évoluent dans le plan perpendiculaire au plan d'observation. Certainsnouveaux tests 2D ont été proposées afin de remédier aux inconvénients mentionnés ci-dessus et des informations importantes sur l' organisation du cytosquelette ont été observées 2,3. Cependant, ces tests présentent encore une limitation sérieuse: les cellules présentent un phénotype très propagation contrairement à ce qui est observé in vivo, où les cellules présentent une architecture 3D. Ces artefacts associés à la méthode de culture peut déclencher des caractéristiques non physiologiques , telles que le renforcement de fibres de stress 1,4,5.
Tridimensionnelles des analyses de culture cellulaire fournissent de nombreux avantages par rapport aux environnements 2D 6,7. Ils sont physiologiquement plus pertinent, et les résultats sont donc significatifs. A titre d'exemple, les cellules incorporées dans les hydrogels présentent des structures 3D-like mais leurs morphologies diffèrent d'une cellule à l' autre 8,9. Cependant, leurs morphologies diffèrent d'une cellule à une autre, ce qui complique les applications de criblage. Une autre stratégie consiste à intégrer uniqueles cellules dans des cavités microfabriqués 10,11. position de cellules, la forme, la polarité et l'organisation interne de la cellule peuvent alors devenir normalisée. En plus de fournir une architecture 3D ressemblant à des cellules, microcavités permet également de haute contenu des études de dépistage 10,12-14; des cellules individuelles peuvent être commandées en microréseaux et des organites cellulaires et leurs évolutions peuvent être observées en parallèle. Cette régularité fournit de bonnes statistiques à faible nombre de cellules et de meilleures résolutions temporelles / spatiales. Des composés utiles sont plus faciles à identifier de manière fiable.
Dans cette étude, nous montrons la fabrication et l' application d'un nouveau système de culture de cellules unique 3D-like pour les applications à haut contenu de dépistage 10,12,13. Le dispositif est constitué d'un réseau de microcuves élastomères (10 5 cavités / cm 2), inventé '' coquetiers (CE). Dimensions et volume total des CE dans ce travail sont optimisés pour le volume typique des cellules NIH3T3 et HeLa individuelsau cours de la division cellulaire. Morphologie des cavités cylindriques – – est sélectionné pour la forme des cellules correctement orient pour la visualisation des processus actifs. Replica moulage est utilisé pour modèle un tableau de la CE sur un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche collée sur un verre lamelle 15,16. Les cellules sont introduites dans les CE par centrifugation. Nous rapportons ici l'observation et la normalisation des organites cellulaires (fibres de stress d'actine, appareil de Golgi et noyau) en 3D (CE) en comparaison avec les mêmes cellules sur 2D (plat) surfaces. Nous présentons également l'observation des processus dynamiques actifs tels que la fermeture de l'anneau de actomyosine cytokinétique lors de la mitose des cellules 17. Enfin, nous montrons les résultats de cette méthodologie sur d' autres systèmes avec des parois rigides, tels que la levure bourgeonnante, levure de fission et C. embryons elegans qui confirme l'applicabilité de notre méthodologie à une large gamme de systèmes modèles.
Nous présentons ensuite une p détaillée et exhaustiverotocol afin de fabriquer et d'appliquer les «coquetiers» pour microfabrication 3D. Notre approche est simple et n'a pas besoin d'une chambre propre. Nous prévoyons que cette nouvelle méthodologie sera particulièrement intéressante pour les essais de criblage de médicaments et de la médecine personnalisée, en remplacement de boîtes de Pétri. Enfin, notre dispositif sera utile pour étudier les distributions des réponses des cellules à des stimuli externes, par exemple dans le cancer 18 ou dans la recherche fondamentale 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Replica moulage a été utilisé pour fabriquer les «coquetiers». Le procédé de fabrication n'a pas besoin d'une chambre propre; il est facile et simple, même si une certaine pratique peut être nécessaire. En particulier, la libération du timbre de PDMS est l'étape la plus critique afin de produire une grande surface de «coquetiers» de haute qualité. Pour cette raison, une attention particulière doit être prise lors de cette étape. Si cette étape échoue à plusieurs reprises, envisager pour …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons L. Brino (IGBMC haute installation de filtrage du contenu, Illkirch, France) pour nous fournir avec l'anticorps anti-Giantin, M. Labouesse Lab. pour C. elegans (IGBMC) et B. Séraphin Lab. pour la levure bourgeonnante (IGBMC), E. Paluch et A. Hyman pour les cellules HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresde), J. Moseley (Dartmouth Medical School) et Wu (Université Ohio State) JQ pour les cellules de levure de fission; A. Hoël et F. Evenou aide expérimentale, C. Rick (IBMC, Strasbourg, France) pour l'aide technique et JC Jeannot (Femto-st, France) pour les aider à microfabrication. Ce travail a été soutenu par des fonds du CNRS, de l'Université de Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale et ci-FRC de Strasbourg.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
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