Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz
Summary
Biz hücreleri ve embriyolar incelemek için bir cihaz ve yeni bir yöntem sunulmuştur. Tek hücreler tam microcavity dizileri sıralanır. Onların 3D hapsi fizyolojik koşullarda karşılaşılan 3D ortamlarda yolunda atılmış bir adımdır ve organel yönünü verir. Hücre şekli kontrol ederek, bu kurulum standart deneylerde bildirilen değişkenlik en aza indirir.
Abstract
Biyolojik hücreler genellikle daire (2D) yüzeylerinde görülür. Bu durum fizyolojik değildir ve fenotipleri ve şekiller oldukça değişkendir. Bu tür ortamlarda hücreler dayalı tarama bu nedenle ciddi sınırlamaları vardır: hücre organelleri heterojen ve / veya belirli bir hücre organelleri düzgün görüntülenmiştir olamaz olan aşırı fenotipleri, hücre morfolojileri ve boyutları göstermektedir. Buna ek olarak, in vivo olarak hücreler, bir 3 boyutlu bir ortamda yer alır; Bu durumda, hücreler, esas olarak doku çevreleyen hücre dışı matris ile etkileşimi farklı fenotipleri göstermektedir. Standartlaştırmak ve hücre tabanlı tahlillerde için fizyolojik olarak ilgili 3 boyutlu bir ortamda tek hücre sırasını oluşturmak için, burada in vitro olarak 3D hücre kültürü için bir cihazın mikroüretim ve uygulamalar sunulmaktadır. Bu cihaz, mikro boşlukların üst 2B dizi (tipik olarak 10 5 oyuklar / cm2), tek hücreler ya da embriyolar ile doldurulmuş, her oluşur. hücre poziyon, şekil, polarite ve iç hücre organizasyonu 3D mimarisini gösteren sonra normalize olur. Biz bir lamel üzerine yapıştırılmış ince bir polidimetilsiloksan üzerine 'eggcups' (PDMS) katman deseni mikro boşlukların bir dizi çoğaltma kalıp kullanılır. Boşluklar yapışmayı kolaylaştırmak için fibronektin ile örtülmüştür. Hücreler, santrifüj ile sokulmuştur. Dolum yüzdesi% 80'e kadar izin her bir sistem için optimize edilmiştir. Hücreler ve embriyolar canlılığı teyit edildi. Biz çekirdek ve Golgi gibi hücresel organellere, görüntülenmesi için bu yöntemi uygulanır ve bu tür hücre mitoz sırasında cytokinetic halka kapatılması gibi aktif süreçleri incelemek için. Bu cihaz, Golgi ve çekirdek hizalama için cytokinetic halka kapanması ve sıkıştırılmış fenotipleri sırasında bu tür periyodik birikimleri ve miyozin ve aktin homojensizliklerin gibi yeni özellikler, belirlenmesini sağladı. Biz memeli hücrelerinin, fisyon maya, tomurcuklanan maya, C yöntemi ile karakterize elegans wher durumda i'inci özel adaptasyon. Son olarak, bu cihazın özellikleri ilaç tarama tahlillerine ve kişiselleştirilmiş ilaç için özellikle ilginç hale getirir.
Introduction
İn vitro hücre-esaslı deneyler mevcut (2B), iki boyutludur. Bu yapılandırma, memeli hücreleri için doğal olmayan ve bu nedenle 1 fizyolojik olarak ilgili değildir; Hücreler şekil, boyut ve heterojen fenotip bir çeşitlilik göstermektedir. Böyle düzlemde ve hücresel organellerin aşırı fenotipleri (özellikle stres lifleri) içinde düzensiz dağılım olarak, tarama uygulamaları uygulandığında Onlar ek ciddi sınırlamalar mevcut. Bu yüksek bütçeler her yıl harcanan uyuşturucu testi için klinik çalışmalarda özellikle önemlidir. çünkü ilaç taraması erken dönemlerinde yapay 2B kültür durumun hayvan modellerinde uygulandığında bu ilaçların pek çoğu da başarısız olur. Buna ek olarak, bu yaklaşım ile, özel hücre organelleri doğru genellikle gözlem düzlemine dik bir düzlemde gelişen yapılar, hücre mitoz sırasında cytokinetic aktomiyosin halkası gibi, görsel ve edilemez. Birazyeni 2D deneyleri hücre iskeleti organizasyonu yukarıda belirtilen sakıncaları ve önemli anlayışlar 2,3 gözlenmiştir aşmak için öne sürülmüştür. Bununla birlikte, bu deneyler, hala mevcut ciddi bir sınırlaması hücreleri hücreler 3B yapıların varlığı, in vivo olarak gözlemlenen bir tezat çok yayılmış bir fenotip göstermektedir. Kültür yöntemi ile ilişkili Bu eserler gibi gelişmiş stres lifleri 1,4,5 olmayan fizyolojik özellikleri tetikleyebilir.
2D 6,7 ortamlarda göre üç boyutlu hücre kültürü deneyleri, çok sayıda avantaj sağlar. Onlar fizyolojik daha alakalı ve sonuçlar bu nedenle anlamlıdır. Bir örnek olarak, hidrojeller gömülü hücrelerin 3D-benzeri yapılar gösterir ancak morfolojileri bir 8,9 bir hücreden diğerine farklılık göstermektedir. Bununla birlikte, bunların morfolojileri tarama uygulamaları komplike bir hücreden, farklıdır. Alternatif bir strateji tek gömmektirmicrofabricated boşlukların 10,11 hücreleri. Hücre pozisyon, şekil, polarizasyon ve hücre içi organizasyonu daha sonra normalize olabilir. Hücrelere 3D benzeri mimari sağlamanın yanı sıra, mikro boşluklara da yüksek içerik tarama çalışmaları 10,12-14 için izin verir; tek hücre mikrodiziler ve hücresel organellerine sipariş edilebilir ve değerlendirmelerin paralel gözlenebilir. Bu düzenlilik hücrelerinin sayısının az ve daha iyi uzaysal / zamansal çözünürlükte iyi istatistikler sağlar. Yararlı bileşikler güvenilir tespit etmek daha kolaydır.
Bu çalışmada, yüksek içerik tarama uygulamaları 10,12,13 için imalat ve yeni bir 3D benzeri tek hücre kültür sisteminin uygulanmasını göstermektedir. Cihaz elastomerik mikro boşluklara (10 5 boşluklar / cm 2), icat 'eggcups' (AK) bir dizi oluşur. Bu çalışmada Ölçüler ve AT toplam hacmi bireysel NIH3T3 ve HeLa hücrelerinde tipik hacmi optimize edilmiştirhücre bölünmesi sırasında. silindirik – – boşlukların Morfoloji etkin işlemlerin görüntülenmesi için gerektiği gibi yönlendirmek hücre şekli seçilir. 15,16 lamel çoğaltma kalıp bir cam üzerine yapıştırılmış ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) tabaka üzerine desen AT'nin bir dizi kullanılır. Hücreler santrifüj ile EC tanıtıldı. Biz 2D aynı hücrelerle karşılaştırıldığında burada gözlem ve 3D (EC) hücresel organellere (aktin stres lifleri, golgi aygıtı ve çekirdek) normalleşmesini rapor (düz) uygulanabilir. Biz de böyle bir hücre mitoz 17 sırasında cytokinetic actomyosin halka kapatılması gibi aktif dinamik süreçlerin gözlem raporu. Son olarak, biz böyle tomurcuklanan maya, fisyon maya ve C gibi katı duvarlar, diğer sistemlerde bu yöntemin sonuçlarını göstermek model sistemlerinde geniş bir yelpazede bizim metodoloji uygulanabilirliğini teyit elegans embriyolar.
Önümüzdeki ayrıntılı ve kapsamlı p sunmaksırayla rotocol imal ve 3D mikrofabrikasyon için 'eggcups' uygulamak. Bizim yaklaşım basittir ve bir temiz oda ihtiyacı yoktur. Biz bu yeni metodoloji Petri yerine de, ilaç tarama deneyleri ve kişiselleştirilmiş tıp için özellikle ilginç olacağını tahmin ediyoruz. Son olarak, cihaz, kanser 18 veya temel araştırma 19, örneğin, dış uyarılara karşı hücre yanıtlarının dağılımı çalışmaları için yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Replika döküm 'eggcups' imal etmek amacıyla kullanılmıştır. üretim süreci bir temiz oda ihtiyacı yoktur; Bazı uygulama gerekebilir rağmen, kolay ve basittir. Özellikle, PDMS damga serbest yüksek kalite 'eggcups' geniş bir alana üretmek için en kritik adımdır. Bu nedenle, özel bir dikkat bu adımda alınması gerekir. Bu adımı tekrar tekrar başarısız olursa, silanizasyon ve plazma bağlayıcı önce plazma temizleyici parametrelerini optimize etmek düşünün. Yetersiz silanizasy…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anti-Giantin antikoru, M. Labouesse Lab bize sağlamış L. Brino (IGBMC Yüksek İçerik Tarama tesisi, Illkirch, Fransa) kabul. C. elegans (IGBMC) ve B. Séraphin Lab. maya (IGBMC), fisyon maya hücreleri için floresan HeLa hücrelerinden (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Tıp Okulu) ve JQ Wu (The Ohio State University) E. Paluch ve A. Hyman tomurcuklanan için; A. Hoel ve deneysel yardım için F. EVENOU, teknik yardım için C. Rick (IBMC, Strazburg, Fransa), ve mikrofabrikasyon yardım için JC Jeannot (Femto-st, Fransa). Bu çalışma CNRS, Strasbourg Üniversitesi'nde, Conectus fonları tarafından desteklenen, La Fondation la Recherche MEDICALE ve Strasbourg ci-FRC dökün.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Riveline, D., Buguin, A. . Devices and methods for observing the cell division. , (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Riveline, D. . Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , (2012).
- Riveline, D., Wollrab, V. . Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G., Hughes, M. P., Hoettges, K. F. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. 583, 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
