Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening
Summary
Wir berichten über eine Vorrichtung und ein neues Verfahren Zellen und Embryonen zu untersuchen. Einzelne Zellen werden in Mikroresonator-Arrays genau bestellt. Ihre 3D Haft ist ein Schritt in Richtung 3D-Umgebungen unter physiologischen Bedingungen auf und lässt zu Organell Orientierung. Durch die Steuerung der Zellform, minimiert diese Setup-Variabilität in Standardtests berichtet.
Abstract
Biologische Zellen sind in der Regel auf ebenen (2D) Oberflächen beobachtet. Dieser Zustand ist nicht physiologisch, und Phänotypen und Formen sind sehr variabel. Screening auf Basis von Zellen in solchen Umgebungen haben daher gravierende Einschränkungen: Zellorganellen zeigen extreme Phänotypen, Zelle Morphologien und Größen sind heterogene und / oder spezifische Zellorganellen nicht richtig sichtbar gemacht werden kann. Darüber hinaus werden in vivo Zellen in einer 3D – Umgebung angeordnet ist ; In dieser Situation zeigen Zellen unterschiedliche Phänotypen vor allem wegen ihrer Wechselwirkung mit der umgebenden extrazellulären Matrix des Gewebes. Um Reihenfolge der einzelnen Zellen in einem physiologisch relevanten 3D – Umgebung für zellbasierte Assays zu standardisieren und zu erzeugen, berichten wir hier die Mikrofertigung und Anwendungen einer Vorrichtung zur In – vitro – 3D – Zellkultur. Diese Vorrichtung besteht aus einer 2D – Anordnung von Mikrokavitäten (typischerweise 10 5 Kavitäten / cm 2), die jeweils mit einzelnen Zellen oder Embryonen gefüllt. Zell position, Form, Polarität und interne Zellorganisation dann normalisiert werden eine 3D-Architektur zeigt. Wir verwendeten Replik Formens Muster eine Reihe von Mikrokavitäten, 'eggcups', auf eine dünne Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht auf einem Deckglas geklebt. Hohlräume wurden mit Fibronectin bedeckt Haftung zu erleichtern. Zellen wurden durch Zentrifugation eingesetzt. Füllprozentsatz wurde für jedes System optimiert, um 80% ermöglicht werden. Die Zellen und Embryonen Lebensfähigkeit wurde bestätigt. Wir wendeten diese Methode zur Visualisierung von Zellorganellen wie Nukleus und Golgi-Apparat, und aktive Verfahren, wie das Schließen des Rings während zytokinetischen Zellmitose zu studieren. Dieses Gerät erlaubt die Identifizierung von neuen Features, wie zB periodische Ansammlungen und Inhomogenitäten von Myosin und Aktin während der zytokinetischen Ringschluss und verdichtet Phänotypen für Golgi und Kern-Ausrichtung. Wir gekennzeichnet , das Verfahren für Säugetierzellen, Spalthefe, Bäckerhefe, C. elegans with spezifische Anpassung in jedem Fall. Schließlich machen die Eigenschaften dieses Gerät interessant besonders für Arzneimittel-Screening-Assays und personalisierte Medizin.
Introduction
Strom in vitro zellbasierten Assays , sind zweidimensionale (2D). Diese Konfiguration ist nicht natürlich für Säugerzellen und ist daher nicht physiologisch relevant 1; Zellen zeigen eine Vielfalt von Formen, Größen und heterogenen Phänotypen. Sie stellen zusätzliche ernsthafte Einschränkungen bei dem Screening-Anwendungen angewandt, wie beispielsweise eine ungeordnete Verteilung innerhalb der Ebene und extreme Phenotypen von Zellorganellen (Stressfasern, insbesondere). Dies ist besonders wichtig in klinischen Studien für Drogentests, bei denen eine hohe Budgets jedes Jahr ausgegeben. Die meisten dieser Medikamente versagen jedoch, wenn die Tiermodelle angewandt wegen der künstlichen 2D-Kulturbedingungen in frühen Phasen der Wirkstoffscreening. Zusätzlich kann durch diesen Ansatz verwenden, bestimmte Zellorganellen nicht richtig dargestellt werden kann, wie beispielsweise die zytokinetischen Actomyosin Ring während Mitose und allgemein Strukturen, die in der Ebene senkrecht zur Ebene des Beobachtungs entwickeln sich. Etwasneue 2D – Assays wurden zu überwinden , um die oben erwähnten Nachteile und wichtige Erkenntnisse über Zytoskelettorganisation wurden 2,3 beobachtet vorgeschlagen. Allerdings sind diese Tests noch vorhanden eine ernsthafte Einschränkung: zeigen Zellen , die einen sehr Ausbreitung Phänotyp im Gegensatz zu dem, was in vivo beobachtet wird, wo Zellen , die eine 3D – Architektur präsentieren. Diese Artefakte mit dem Kulturverfahren verbunden sind, können auslösen nichtphysiologischen Eigenschaften wie verbesserte Stressfasern 1,4,5.
Dreidimensionale Zellkultur – Assays bieten mehrere Vorteile im Vergleich zu den 2D – Umgebungen 6,7. Sie sind physiologisch relevanter, und die Ergebnisse sind daher sinnvoll. Als Beispiel zeigen in Hydrogelen eingebetteten Zellen 3D-ähnliche Strukturen , aber ihre Morphologien unterscheiden sich von einer Zelle in eine andere 8,9. Jedoch ihre Morphologien unterscheiden sich von einer Zelle zur anderen, die Screening-Anwendungen erschwert. Eine alternative Strategie ist Single einzubettenZellen in mikrostrukturierten Hohlräumen 10,11. Zell Position, Form, Polarität und interne Zellorganisation kann dann normalisiert werden. Neben der Bereitstellung von 3D-like Architektur an Zellen, Mikrokavitäten ermöglicht auch für High-Content – Screening – Studien 10,12-14; Einzelzellen können in Microarrays und Zellorganellen und ihre Entwicklungen bestellt werden können parallel beobachtet werden. Diese Regelmäßigkeit liefert gute Statistiken mit geringen Anzahl von Zellen und eine bessere zeitliche / räumliche Auflösungen. Nützliche Verbindungen sind leichter zuverlässig zu identifizieren.
In dieser Studie zeigen wir die Herstellung und Anwendung einer neuen 3D-like Kultursystem einzelne Zellen für die High-Content-Screening – Anwendungen 10,12,13. Die Vorrichtung besteht aus einer Anordnung von elastomerem Mikrokavitäten (10 5 Hohlräumen / cm 2), geprägt 'eggcups' (EC). Abmessungen und das Gesamtvolumen der EG in dieser Arbeit sind mit dem typischen Volumen einzelner NIH3T3 und HeLa-Zellen optimiertwährend der Zellteilung. Morphologie der Hohlräume – zylindrisch – richtig zu orientieren Zellform zur Sichtbarmachung von aktiven Prozessen ausgewählt wird. Replica Form wird Muster eine Anordnung von EC auf einen dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht auf einem Glas geklebt verwendet 15,16 Deckglas. Die Zellen werden in der EC durch Zentrifugation eingeführt. Wir berichten hier über die Beobachtung und Normalisierung der Zellorganellen (Aktin-Stressfasern, Golgi-Apparat und Kern) in 3D (EG) im Vergleich zu den gleichen Zellen auf 2D (flach) Oberflächen. Wir berichten auch die Beobachtung der aktiven dynamische Prozesse wie die Schließung des zytokinetischen Aktomyosin Ring während Mitose 17. Schließlich zeigen wir Ergebnisse dieser Methodik auf anderen Systemen mit starren Wänden, wie Bäckerhefe, Spalthefe und C. elegans Embryonen , die die Anwendbarkeit unserer Methodik auf eine breite Palette von Modellsystemen bestätigt.
Wir präsentieren neben eine vollständige und genaue protokoll, um die 'eggcups' für 3D-Mikro herzustellen und anzuwenden. Unser Ansatz ist einfach und nicht ein sauberes Zimmer benötigen. Wir gehen davon aus, dass diese neue Methode besonders interessant für Wirkstoff-Screening werden Assays und personalisierte Medizin, in der Ersatz von Petrischalen. Schließlich wird unsere Vorrichtung zur Untersuchung der Verteilung von Zellen Reaktionen auf externe Stimuli, beispielsweise bei Krebs 18 oder in der Grundlagenforschung 19 nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Replica Formen wurde verwendet, um die "eggcups 'herzustellen. Der Herstellungsprozess muss nicht ein sauberes Zimmer; es ist leicht und einfach, auch wenn einige der Praxis erforderlich sein kann. Insbesondere die PDMS-Stempel Loslassen ist der wichtigste Schritt, um einen großen Bereich von hoher Qualität "eggcups 'zu erzeugen. Aus diesem Grund hat besondere Sorgfalt in diesem Schritt genommen werden. Wenn dieser Schritt wiederholt fehlschlägt, sollten Sie die Plasma-Reiniger Parameter an die Sila…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen an L. Brino (IGBMC High Content Screening-Anlage, Illkirch, Frankreich) für die Bereitstellung von uns mit dem Anti-Giantin Antikörper, M. Labouesse Lab. für C. elegans (IGBMC) und B. Séraphin Lab. für Bäckerhefe (IGBMC), E. Paluch und A. Hyman für fluoreszierende HeLa-Zellen (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) und JQ Wu (Ohio State University) für Spalthefezellen; A. Hoël und F. Evenou für experimentelle Hilfe, C. Rick (IBMC, Straßburg, Frankreich) für technische Hilfe und JC Jeannot (Femto-st, Frankreich) für die Hilfe in Mikrofabrikations. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem CNRS, der Universität Straßburg unterstützt wurde, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale und die ci-FRC von Straßburg.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
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