Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo
Summary
Nós relatamos um dispositivo e um novo método para estudar células e embriões. células individuais são precisamente ordenados em matrizes microcavidade. Seu confinamento 3D é um passo para ambientes 3D encontrados em condições fisiológicas e permite a orientação organela. Ao controlar a forma da célula, esta configuração minimiza variabilidade relatados em ensaios convencionais.
Abstract
As células biológicas são geralmente observados em superfícies planas (2D). Esta condição não é fisiológica, e fenótipos e formas são altamente variáveis. A triagem com base em células em tais ambientes têm limitações, portanto, graves: organelas celulares mostram fenótipos extremos, morfologias celulares e tamanhos são organelos celulares heterogêneos e / ou específicos não pode ser correctamente visualizado. Além disso, as células in vivo situam-se num ambiente 3D; Nesta situação, as células mostram diferentes fenótipos principalmente por causa da sua interacção com a matriz extracelular em torno do tecido. A fim de padronizar e gerar fim de células individuais em um ambiente 3D fisiologicamente relevantes para ensaios baseados em células, relatamos aqui a microfabricação e aplicações de um dispositivo para o cultivo in vitro de células 3D. Este dispositivo é composto por uma matriz 2D de microcavidades (tipicamente 10 cavidades 5 / cm2), cada um cheio com células individuais ou embriões. posi celularção, a forma, a polaridade e organização celular interna tornar-se então normalizados mostrando uma arquitetura 3D. Usamos moldagem réplica de padrão de uma matriz de microporos, (PDMS) camada 'eggcups', em um polidimetilsiloxano fina aderiu em uma lamela. Cavidades foram cobertas com fibronectina para facilitar a aderência. As células foram inseridos por centrifugação. A porcentagem de preenchimento foi otimizado para cada sistema que permite até 80%. As células e os embriões viabilidade foi confirmada. Esta metodologia foi utilizada para a visualização dos organelos celulares, tais como aparelhos de Golgi e núcleo, e para estudar processos activos, tais como o encerramento do anel cytokinetic durante a mitose celular. Este dispositivo permitiu a identificação de novas funcionalidades, tais como acumulações periódicas e heterogeneidades de miosina e actina durante o encerramento do anel cytokinetic e fenótipos compactadas para Golgi e alinhamento núcleo. Caracterizamos o método de células de mamíferos, levedura de fissão, brotação de levedura, C. elegans wom adaptação específica em cada caso. Finalmente, as características deste dispositivo torná-lo particularmente interessante para ensaios de rastreio de drogas e medicina personalizada.
Introduction
Actual em ensaios baseados em células in vitro são bidimensional (2D). Esta configuração não é natural para células de mamíferos e, por conseguinte, não é fisiologicamente relevante 1; células mostram uma diversidade de formas, tamanhos e fenótipos heterogêneos. Eles apresentam sérias limitações adicionais quando aplicado para aplicações de rastreio, tais como uma distribuição desordenada dentro do plano e fenótipos extremos de organelos celulares (fibras de stress, em particular). Isto é particularmente importante em ensaios clínicos para o teste de drogas, onde os altos orçamentos são gastos a cada ano. A maioria destas drogas que falham quando aplicados a modelos animais por causa da condição de cultura 2D artificial nas fases iniciais de rastreio de drogas. Além disso, ao utilizar esta abordagem, organelos celulares específicos podem não ser correctamente visualizado, tal como o anel de actomiosina cytokinetic durante a mitose celular, e, geralmente, estruturas que estão a evoluir no plano perpendicular ao plano de observação. Algunsnovos ensaios 2D têm sido propostos a fim de ultrapassar os inconvenientes acima mencionados e conhecimentos importantes sobre a organização do citoesqueleto foram observados 2,3. No entanto, estes ensaios ainda apresentam uma séria limitação: células apresentam um fenótipo muito propagação em contraste com o que se observa in vivo, em que as células apresentam uma arquitectura 3D. Estes artefactos associados com o método de cultura pode desencadear características não-fisiológicos, tais como fibras de stress 1,4,5 melhoradas.
Tridimensionais ensaios de cultura celular fornecer várias vantagens quando comparados com os ambientes 2D 6,7. Eles são fisiologicamente mais relevante, e os resultados são, portanto, significativa. Como um exemplo, as células embebidas em hidrogéis mostram estruturas 3D-like, mas as suas morfologias diferem de uma célula para outra 8,9. No entanto, as suas morfologias diferem de uma célula para outra, o que complica as aplicações de rastreio. Uma estratégia alternativa é incorporar únicacélulas em cavidades microfabricados 10,11. posição da célula, forma, polaridade e organização célula interna pode, então, tornar-se normalizada. Além de fornecer a arquitetura 3D-like para as células, microcavidades também permite estudos de triagem de alto conteúdo 10,12-14; As células individuais podem ser ordenadas em microarrays e organelos celulares e suas evoluções pode ser observada em paralelo. Essa regularidade fornece boas estatísticas com baixo número de células e melhores resoluções temporais / espaciais. Os compostos úteis são mais fáceis de identificar com segurança.
Neste estudo, nós mostramos a fabricação e aplicação de um novo sistema de células única cultura 3D-like de alto conteúdo de triagem aplicações 10,12,13. O dispositivo consiste de uma matriz de microcavidades elastoméricos (10 5 cavidades / cm 2), cunhada 'eggcups »(CE). Dimensões e volume total de CE neste trabalho são otimizados para o volume típico de células NIH3T3 e HeLa individuaisdurante a divisão celular. Morfologia das cavidades cilíndricas – – é seleccionado a forma da célula orientar correctamente para a visualização de processos activos. Moldagem réplica é usado para padrão de um conjunto de CE para um (PDMS) camada fina polidimetilsiloxano aderiu em um vidro lamela 15,16. As células são introduzidas na CE por centrifugação. Relatamos aqui a observação e normalização das organelas celulares (fibras de stress de actina, aparelho de Golgi e núcleo) em 3D (CE), em comparação com as mesmas células em 2D (plana) superfícies. Nós também relatam a observação de processos dinâmicos ativos, tais como o fechamento do anel actomiosina cytokinetic durante a mitose de células 17. Por fim, mostramos resultados desta metodologia em outros sistemas com paredes rígidas, como a levedura de brotamento, levedura e C. embriões elegans, o que confirma a aplicabilidade da nossa metodologia para uma ampla gama de sistemas modelo.
A seguir, apresentamos um p detalhada e exaustivarotocolo, a fim de fabricar e aplicar as 'eggcups' para microfabricação 3D. Nossa abordagem é simples e não precisa de um quarto limpo. Nós antecipamos que essa nova metodologia será particularmente interessante para testes de rastreio de drogas e medicina personalizada, em substituição de placas de Petri. Finalmente, o nosso dispositivo irá ser útil para estudar a distribuição de respostas de células a estímulos externos, por exemplo no cancro ou 18 em pesquisa básica 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
moldagem réplica foi utilizado a fim de fabricar os Eggcups ''. O processo de fabricação não precisa de uma sala limpa; é fácil e simples, embora alguns prática pode não ser necessária. Em particular, libertando o selo PDMS é a etapa mais importante, a fim de produzir uma grande área de '' Eggcups alta qualidade. Por esta razão, um cuidado especial tem de ser tomada neste passo. Se essa etapa for repetidamente falhando, considere para otimizar os parâmetros do plasma mais limpos antes da sil…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós reconhecemos L. Brino (facilidade de Triagem conteúdo IGBMC alta, Illkirch, França) para fornecer-nos com o anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. para C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. para quem gosta de levedura (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman para as células HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) para células de levedura de fissão; A. Hoel e F. Evenou para ajudar experimental, C. Rick (IBMC, Estrasburgo, França) para obter ajuda técnica e JC Jeannot (Femto-st, França) para ajudar na microfabricação. Este trabalho foi apoiado por fundos do CNRS, da Universidade de Estrasburgo, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale ea ci-FRC de Estrasburgo.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
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