단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치
Summary
우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.
Abstract
생물 세포는 일반적으로 평면 (2D) 표면에서 관찰된다. 이 조건은 생리적없고, 표현형 및 모양이 매우 다양하다. 이러한 환경에서 세포 기반 스크리닝 따라서 심각한 한계를 가지고 : 세포 소기관은 이종 및 / 또는 특정 세포 소기관이 제대로 시각화 할 수없는 극단적 인 표현형, 세포의 형태 학적 및 크기를 표시합니다. 또한, 생체 내의 세포는 3 차원 환경에서의 위치; 이 상황에서, 세포는 주로하기 때문에 조직의 주변 세포 외 기질과의 상호 작용의 서로 다른 표현형을 보여줍니다. 표준화 및 세포 기반 검정을위한 생리 학적으로 관련 차원 환경에서 하나의 셀의 순서를 생성하기 위해, 여기에서 3D 관내 세포 배양 장치의 미세 가공 및 애플리케이션을보고한다. 이 장치는 마이크로 공동의 2 차원 배열 (일반적으로 10 5 공동 / cm 2), 단일 세포 또는 배아로 가득 각각 구성되어있다. 셀 포지기, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 3 차원 구조를 보여주는 다음 정규화된다. 우리는 커버 슬립에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 상 'eggcups'(PDMS) 층 패턴 마이크로 공동의 배열을 복제 성형을 사용했다. 캐비티가 접착을 촉진하기 피브로넥틴으로 피복 하였다. 균체를 원심 분리에 의해 삽입 하였다. 충전 비율을 80 %까지 허용하는 각 시스템에 대해 최적화되었다. 배아 세포 생존이 확인되었다. 우리는 핵 및 골지 장치와 같은 세포 소기관의 시각화를 위해이 방법을 적용, 이러한 세포 유사 분열 동안 cytokinetic 반지의 폐쇄 활성 프로세스를 연구. 이 장치는 골지체와 핵 정렬에 대한 cytokinetic 링 폐쇄 및 압축 된 표현형 중에 이러한주기적인 축적과 미오신과 액틴의 불균질성과 같은 새로운 기능의 식별을 허용했다. 우리는 포유류 세포, 분열 효모, 출아 효모, C.하는 방법을 특징으로하는 엘레 w각각의 경우에 i 번째 특정 적응. 마지막으로,이 장치의 특성은 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미합니다.
Introduction
시험 관내 세포 – 기반 검정에서의 전류 (2D) 이차원이다. 이 구성은 포유 동물 세포에 대한 자연 아니므 한 생리 관련이 없다; 세포 모양, 크기 및 이기종 표현형의 다양성을 보여줍니다. 같은 비행기 및 세포 소기관의 극단적 인 표현형 (특히 스트레스 섬유) 내에서 무질서한 분포로, 심사 응용 프로그램에 적용 할 때 그들은 추가 심각한 한계를 제시한다. 이는 높은 예산이 매년 소비되는 약물 검사에 대한 임상 시험에서 특히 중요하다. 때문에 약물 검사의 초기 단계에서 인공 2D 문화 조건의 동물 모델에 적용 할 때이 약의 대부분은 비록 실패합니다. 또한,이 방법을 이용하여 특정 세포 소기관 적절 통상 관찰의 평면에 수직 한 평면에서 진화 구조 같은 세포 분열 동안 cytokinetic 액토 마이 오신 고리로서 가시화 될 수 없다. 약간새로운 2 차원 분석은 세포 골격 조직에서 상술 한 단점 중요한 통계는 2,3- 관찰되었다 극복하기 위해 제안되었다. 그러나 이러한 분석은 여전히 존재 하나 심각한 제한 : 세포는 세포가 3 차원 구조를 제시 생체 내에서 관찰되는 것과 대조적으로 매우 확산 표현형을 나타낸다. 배양 방법과 관련이 유물은 강화 된 스트레스 섬유 1,4,5으로 비 생리적 기능을 실행할 수 있습니다.
2D는 6,7 환경에 비해 입체 세포 배양 분석은 여러 장점을 제공한다. 그들은 생리 학적 관련성, 그리고 결과에 따라서 의미가있다. 예를 들어, 히드로 겔에 포함 된 세포는 3 차원 형상의 구조를 표시하지만, 그 모폴로지는 또 다른 하나의 셀에 8,9 다르다. 그러나, 그들의 모폴로지는 심사 응용 프로그램을 복잡하게 다른 하나의 셀에서 차이가있다. 또 다른 전략은 단일 포함하는 것입니다미세 공동 10, 11 셀. 셀의 위치, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 정상화 될 수 있습니다. 세포에 3D와 같은 아키텍처를 제공하는 외에, 마이크로 공동 또한 높은 콘텐츠 스크리닝 연구 10,12-14 수 있습니다; 단셀은 마이크로 어레이 및 세포 내 소기관으로 주문할 수 및 진화가 동시에 관찰 할 수있다. 이 규칙은 세포의 낮은 수 더 나은 시간 / 공간 해상도가 좋은 통계를 제공합니다. 유용한 화합물은 안정적으로 쉽게 식별 할 수 있습니다.
본 연구에서는 높은 콘텐츠 스크리닝 응용 10,12,13 대한 제조 및 새로운 3 차원 형상의 단일 세포 배양 시스템의 애플리케이션을 보여준다. 상기 장치는 탄성 중합체 마이크로 공동 (105 공동 / cm 2), 신조어 'eggcups'(EC)의 배열로 구성된다. 이 작품의 크기 및 EC의 총 부피는 개별 NIH3T3과 헬라 세포의 전형적인 볼륨에 최적화되어 있습니다세포 분열시. 원통형 – – 공동의 형태는 활성 프로세스의 시각화를위한 제대로 동양 세포 형태에 선택됩니다. 15,16 커버 슬립 복제 성형 유리에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 층 상으로 패턴 EC의 배열을 사용한다. 세포를 원심 분리에 의해 EC에 도입된다. 우리는 2D에서 동일한 세포에 비해 여기 관찰 및 3D (EC)의 세포 소기관 (액틴 스트레스 섬유, 골지 장치 및 핵)의 정상화를보고 (평면)의 표면. 우리는 또한 세포의 유사 분열 17시 cytokinetic 액토 마이 오신 링의 폐쇄로 활동 역학 과정의 관찰을보고합니다. 마지막으로, 우리는 신진 효모, 분열 효모와 C.와 같은 단단한 벽, 다른 시스템에서이 방법의 결과를 보여 모델 시스템의 넓은 범위에가는 방법의 적용 가능성을 확인 간스 배아.
우리는 옆에 상세하고 철저한 페이지를 표시순서 rotocol는 제작 및 3D 미세에 대한 'eggcups'을 적용합니다. 우리의 접근 방식은 간단하고 클린 룸을 필요로하지 않습니다. 우리는이 새로운 방법론은 배양 접시의 교체에, 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미로운 일이 될 것으로 예상된다. 마지막으로, 우리의 장치는 암 (18) 또는 기초 연구 (19), 예를 들어, 외부 자극에 세포 응답의 분포를 연구하는데 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
복제 성형은 'eggcups'를 제조하기 위해 사용 하였다. 제조 공정은 클린 룸을 필요로하지 않는다; 연습이 필요할 수 있지만 그것은 쉽고 간단합니다. 특히, PDMS 스탬프을 떼면 고품질 'eggcups'의 넓은 영역을 생성하기 위해 가장 중요한 단계이다. 이 때문에, 특별한주의가이 단계에서 수행되어야한다. 이 단계를 반복하여 실패한 경우, 실란 화 플라즈마 결합 전에 플라즈마 클리너 파라미터…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 안티 Giantin 항체, M. Labouesse 랩으로 우리를 제공하기위한 L. Brino (IGBMC 높은 콘텐츠 상영 시설하여 Illkirch, 프랑스)을 인정합니다. C.에 대한 간스 (IGBMC)와 B Séraphin 연구소. 효모 (IGBMC), 분열 효모 세포에 대한 형광 HeLa 세포 (MPI-CBG, 드레스덴), J. 모슬리 (다트머스 의과 대학)와 JQ 우 (오하이오 주립 대학)에 대한 E. Paluch 및 A. 하이 먼 신진에 대한; A. Hoël과 실험 도움 F. Evenou, 기술 지원을위한 C. 릭 (IBMC, 스트라스부르, 프랑스), 및 미세에 도움 JC Jeannot (펨토 – 일, 프랑스). 이 작품은 CNRS, 스트라스부르 대학, Conectus에서 기금에 의해 지원되었다, 라 파운데이션 부문은 라 공들인 MEDICALE와 스트라스부르의 CI-FRC를 붓는다.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
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