シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを
Summary
私たちは、デバイスと、細胞や胚を研究するための新しい方法を報告しています。単一細胞が正確にマイクロキャビティアレイに並べられます。その3Dの閉じ込めは、生理的条件に遭遇した3D環境への第一歩であり、細胞小器官の向きを可能にします。セル形状を制御することにより、この設定は、標準的なアッセイで報告変動を最小限に抑えることができます。
Abstract
生物細胞は、通常、平坦（2D）表面上に観察されます。この条件は、生理的ではなく、表現型と形状は非常に可変です。そのような環境下での細胞に基づくスクリーニングは、したがって、重大な制限があります細胞小器官は、異種および/または特定の細胞小器官が適切に可視化することができない極端な表現型、細胞形態とサイズを示しています。また、in vivoでの細胞は、3D環境に位置しています。このような状況では、細胞は主に組織の周囲の細胞外マトリックスとの相互作用の異なる表現型を示します。標準及び細胞ベースのアッセイのための生理学的に関連する3次元環境内の単一のセルの順序を生成するために、ここでは、インビトロの3D細胞培養のためのデバイスの微細化およびアプリケーションを報告します。このデバイスは、マイクロキャビティの2次元配列（典型的には、10 5の空洞/ cm 2）を、単一細胞または胚で満たされ、それぞれ構成されています。細胞ポジション、形状、極性および内部細胞組織は、3Dアーキテクチャを示す正規化となります。私たちは、カバーガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）層の上に、「eggcups '、パターンにマイクロキャビティの配列をレプリカ成形を使用していました。空洞は、接着を促進するために、フィブロネクチンで被覆しました。細胞を遠心分離により挿入しました。充填率は80％まで許容するシステムごとに最適化しました。細胞および胚の生存率を確認しました。私たちは、このような核やゴルジ装置などの細胞小器官の可視化のためにこの手法を適用し、このような細胞有糸分裂中の細胞質分裂のリングの閉鎖などのアクティブなプロセスを、研究します。このデバイスは、ゴルジ体や核の位置合わせのための細胞質分裂の閉環と固めの表現型の間に、このような定期的な蓄積とミオシンとアクチンの不均一性などの新機能、の同定を可能にしました。我々は、哺乳動物細胞、分裂酵母、出芽酵母、C.するための方法を特徴としますエレガンスワットそれぞれの場合の具体的な適応i番目。最後に、このデバイスの特性は、薬物スクリーニングアッセイおよびパーソナライズされた医療のために特に興味深いもの。
Introduction
インビトロでの細胞ベースのアッセイにおける電流は、（2D）二次元です。この構成では、哺乳動物細胞のための自然ではないので、1生理学的に関連はありません。細胞は形状、サイズおよび異種の表現型の多様性を示します。このような平面や細胞小器官の極端な表現型（特にストレスファイバー）内の無秩序分布として、スクリーニング用途に適用されるとき、彼らは追加の重大な制限を提示します。これは、高予算が毎年費やされている薬物検査のための臨床試験において特に重要です。薬剤スクリーニングの初期段階であるため、人工2D培養条件の動物モデルに適用した場合、これらの薬物のほとんどはいえません。また、このアプローチを使用することによって、特定の細胞小器官は、適切に、そのような細胞質分裂のアクトミオシン細胞の有糸分裂の間にリング、および観察面に垂直な面内で進化している一般的な構造として、視覚化することができません。一部新しい2Dアッセイは、細胞骨格組織の上述の欠点及び重要な洞察が2,3観察されている解決するために提案されています。しかしながら、これらのアッセイは、まだ現在のもの重大な制限：細胞は、細胞が3次元構造を提示し、インビボで観察されるものとは対照的に、非常に広がり表現型を示します。培養法に関連したこれらのアーティファクトは、強化されたストレスファイバー1,4,5などの非生理的な機能をトリガすることができます。
2D環境6,7と比較した場合、三次元細胞培養アッセイは、多数の利点を提供します。彼らは、生理的に、より関連性の高い、との結果は、したがって、意味があります。一例として、ヒドロゲルに埋め込 まれた細胞は、3Dのような構造を示すが、その形態は、他の8,9、1つのセルから異なります。しかし、その形態は、スクリーニングアプリケーションを複雑に別のセルとは異なります。別の戦略は、単一埋め込むことです微細加工キャビティ10,11内の細胞。セル位置、形状、極性および内部セル組織が正規化になることができます。細胞に3Dのようなアーキテクチャを提供するだけでなく、マイクロキャビティは、高コンテンツスクリーニング研究10,12-14を可能にします。単一細胞は、マイクロアレイおよび細胞小器官に注文することができ、それらの進化を並行して観察することができます。この規則は、細胞の数が少ない、より良い空間的/時間的解像度との良好な統計情報を提供します。有用な化合物を確実に識別しやすくなります。
本研究では、高コンテンツスクリーニングアプリケーション10,12,13のための新しい3Dのような単一細胞培養システムの製作と応用を示しています。デバイスは、エラストマーマイクロキャビティ（10 5の空洞/ cm 2）で、造語「eggcups」（EC）の配列で構成されます。この作品での寸法とECの総容積は、個々のNIH3T3およびHeLa細胞の典型的なボリュームに最適化されています細胞分裂時に。円筒 – – 空洞の形態は、アクティブなプロセスの可視化のための適切配向セルの形状に選択されています。 15,16カバースリップレプリカモールディングをガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）層上にパターンにECのアレイを使用します。遠心分離により細胞をECに導入されます。ここでは、2D（平らな）表面上の同じ細胞と比較して、3D（EC）における細胞小器官（アクチンストレスファイバー、ゴルジ装置および核）の観察および正規化を報告しています。我々はまた、このような細胞有糸分裂17の間の細胞質分裂のアクトミオシンリングの閉鎖などの活性力学過程の観察を報告しています。最後に、我々はそのような出芽酵母、分裂酵母とCのような剛性の壁、と他のシステムでこの方法論の結果を示しますモデルシステムの広い範囲に私達の方法の適用性を確認するエレガンス胚 。
私たちは、詳細かつ網羅pは次の提示します3次元微細加工のための「eggcups」を製作し、適用するためにrotocol。我々のアプローチはシンプルで、クリーンルームを必要としません。私たちは、この新しい方法論がペトリ皿の代わりに、薬物スクリーニングアッセイおよびオーダーメイド医療のために特に興味深いものになることを期待しています。最後に、私たちのデバイスは、ガン18内または基礎研究19、例えば、外部刺激に対する細胞応答の分布を研究するために有用であろう。
Protocol
Representative Results
Discussion
レプリカ成形は「eggcups」を作製するために使用しました。製造プロセスは、クリーンルームを必要としません。いくつかの練習が必要になることがありますが、それは、簡単でシンプルです。具体的には、PDMSスタンプを解放すると、高品質」eggcups 'の大きな領域を生成するための最も重要なステップです。このため、特別な注意は、このステップで注意しなければなりません。このステ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、抗Giantin抗体、M. Labouesseラボで私たちを提供するためのL. Brino（IGBMCハイコンテントスクリーニング施設、イルキルシュ、フランス）を認めます。 C.のためのエレガンス （IGBMC）とBセラフィンラボ。酵母（IGBMC）、分裂酵母細胞用の蛍光HeLa細胞（MPI-CBG、ドレスデン）、J.モーズリー（ダートマス医科大学）とJQウー（オハイオ州立大学）のためのE. PaluchとA.ハイマンを出芽するため、 A.フールと実験の助けのためのF. Evenou、技術的なヘルプのためのC.リック（IBMC、ストラスブール、フランス）、および微細加工のヘルプのためのJC Jeannot（フェムト-ST、フランス）。この作品は、CNRS、ストラスブール大学、CONECTUS、ラ財団ラRECHERCHEMédicaleとCI-FRCストラスブールのを注ぐからの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
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