הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה
Summary
אנו מדווחים על מכשיר שיטה חדשה ללמוד תאי עוברים. תאים בודדים מסודרים דווקא מערכי microcavity. כליאת 3D שלהם היא צעד לקראת סביבות 3D נתקלו בתנאים פיסיולוגיים מאפשרת התמצאות אברון. על ידי שליטת צורת תא, התקנה זו ממזערת השתנות שדווחה מבחני תקן.
Abstract
תאים ביולוגיים בדרך כלל הם נצפו על משטחים שטוחים (2D). מצב זה אינו פיסיולוגי, פנוטיפים וצורות הם משתנים מאוד. הקרנה מבוססת על תאי בסביבות כאלה ולכן יש מגבלות חמורות: אברונים בתא להראות פנוטיפים קיצוניים, מורפולוגיה תא וגדלים הם אברונים בתא הטרוגנית ו / או ספציפיים לא ניתן מדמיינים כמו שצריכים. בנוסף, תאים in vivo ממוקמים בסביבת 3D; במצב זה, תאי להראות פנוטיפים שונים בעיקר בשל האינטראקציה שלהם עם מטריקס שמסביב של הרקמה. על מנת לתקנן וליצור סדר תאים בודדים בסביבת 3D-רלוונטי מבחינה פיזיולוגית עבור מבחני מבוססי תאים, אנו מדווחים כאן את microfabrication ויישומים של מכשיר תרבית תאים במבחנה 3D. מכשיר זה מורכב מערך 2D של microcavities (בדרך כלל 10 5 חללים / 2 סנטימטר), כל אחת מהן מלא עם תאים או עובר יחידים. posi הניידtion, צורה, קוטביות וארגון תא פנימי להיות אז מנורמל מראה ארכיטקטורה 3D. השתמשנו העתק דפוס דפוס מערך של microcavities, 'eggcups', על גבי polydimethylsiloxane דק (PDMS) שכבת דבק על coverslip. חללים היו מכוסים פיברונקטין כדי להקל הידבקות. תאים הוכנסו על ידי צנטריפוגה. אחוז המילוי היה מותאם עבור כל מערכת המאפשרת עד 80%. הכדאיות תאים ועוברים אושרה. יישמנו מתודולוגיה זו ההדמיה של אברונים הסלולר, כגון מכשירים בגרעין Golgi, וכדי ללמוד תהליכים פעילים, כגון סגירת טבעת cytokinetic במהלך מיטוזה תא. מכשיר זה אפשר זיהוי של תכונות חדשות, כגון הצטברויות תקופתיות inhomogeneities של שרירן יקטין במהלך סגר טבעת cytokinetic פנוטיפים דחוסים עבור Golgi ויישור גרעין. אנחנו שאפיינו את השיטה עבור בתאי יונקים, שמרים ביקוע, שמרים ניצנים, ג elegans wההסתגלות הספציפית ה- i בכל מקרה. לבסוף, המאפיינים של המכשיר הזה ולהפוך אותו המעניין במיוחד עבור מבחני הקרנת סמים ותרופות אישיות.
Introduction
נוכח מבחנים במבחנה מבוסס תאים הם דו ממדים (2D). תצורה זו אינה טבעית עבור בתאי יונקים ולכן הוא לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 1; תאים להראות מגוון של צורות, גדלים פנוטיפים הטרוגנית. הם מציגים מגבלות חמורות נוספות כשהוא מיושם על אפליקציות הקרנה, כגון חלוקת סדר בתוך המטוס פנוטיפים הקיצוני של אברונים הסלולר (סיב מתח, בפרט). הדבר חשוב במיוחד בניסויים קליניים עבור בדיקות סמים, שם תקציבים גבוהים מושקעים מדי שנה. רוב התרופות האלה נכשלים אף כאשר מוחלים על מודלים של בעלי חיים, בשל מצבו תרבות 2D המלאכותי בשלבים מוקדמים של הקרנת סמים. בנוסף, על ידי שימוש בגישה זו, אברונים תאים ספציפיים לא ניתן דמיינו כמו שצריך, כמו טבעת actomyosin cytokinetic במהלך מיטוזה התא, ובאופן כללי מבנים מתפתחים במישור הניצב למישור של התבוננות. כמהמבחני 2D חדשות הוצעו על מנת להתגבר על החסרונות הנ"ל תובנות חשובות על ארגון cytoskeleton נצפו 2,3. עם זאת, מבחנים אלה עדיין קיימים מגבלה רצינית אחת: תאים מראים פנוטיפ מאוד התפשטות בניגוד למה שרואה in vivo, שבו תאים להציג ארכיטקטורת 3D. ממצאים אלה הקשורים שיטת התרבות עשויים לגרום לתכונות הלא פיסיולוגיות כגון סיבי מתח משופרים 1,4,5.
תלת ממד תא מבחני תרבות לספק יתרונות מרובים בהשוואת 2D סביבות 6,7. הם פיסיולוגיים רלוונטיים יותר, ותוצאות הן אפוא משמעות. כדוגמא, תאים המוטבעים הידרוג להראות מבני 3D דמוי אבל המורפולוגיות שלהם שונות מתא אחד 8,9 אחר. עם זאת, מורפולוגיות שלהם שונה מתא אחד למשנהו, אשר מסבך יישומים ההקרנה. אסטרטגיה חלופית היא להטביע יחידתאי חללי microfabricated 10,11. בעמדה תא, צורה, קוטביות וארגון תא פנימי אז יכול להיות מנורמל. מלבד מתן ארכיטקטורה דמוי 3D לתאים, microcavities גם מאפשר ללימודים גבוהים הקרנת תוכן 10,12-14; תאים בודדים ניתן להזמין אל microarrays האברונים הסלולר ההתפתחויות שלהם ניתן לצפות במקביל. סדירות זה מספקת נתונים סטטיסטיים טובים עם מספר נמוך של תאים והחלטות זמניות / מרחבית טובות יותר. תרכובות שימושיות קלות יותר לזיהוי באופן מהימן.
במחקר זה, אנו מציגים את ייצור ויישום של מערכת התרבות תאים בודדים 3D-כמו חדש עבור יישומים עתירי תוכן ההקרנה 10,12,13. המכשיר מורכב מערך של microcavities אלסטומרי (10 5 חללים / 2 ס"מ), שטבע "eggcups '(EC). מידות נפח כולל של EC בעבודה זו מותאמות להיקף הטיפוסי של תאי NIH3T3 והלה פרטבעת חלוקת התא. מורפולוגיה של החללים – גלילי – נבחרה לכוון תא צורה כראוי ההדמיה של תהליכים פעילים. דפוס העתק משמש תבנית מערך של EC גבי polydimethylsiloxane דק (PDMS) שכבת דבק על כוס coverslip 15,16. תאים הם הציגו את EC על ידי צנטריפוגה. אנו מדווחים כאן תצפית ונורמליזציה של אברונים הסלולר (סיבי אקטין מתח, מערכת גולג'י והגרעין) ב -3 D (EC) בהשוואה אותם תאים על 2D (שטוח) משטחים. כמו כן, אנו מדווחים על התצפיות של תהליכים דינמיים פעילים כגון סגירת טבעת actomyosin cytokinetic במהלך התא מיטוזה 17. לבסוף, אנו מציגים תוצאות של מתודולוגיה זו על מערכות אחרות עם קירות נוקשים, כגון שמרים ניצנים, שמרים ביקוע ו- C. עובר elegans אשר מאשרת את תחולתה של המתודולוגיה שלנו מגוון רחב של מערכות מודל.
בשלב הבא אנו מציגים p מפורט וממצהrotocol כדי לפברק ולהחיל את 'eggcups' עבור microfabrication 3D. הגישה שלנו היא פשוטה ואינו זקוק לחדר נקי. אנו צופים כי מתודולוגיה חדשה זו תהיה מעניינת במיוחד עבור מבחני הקרנת סמים ותרופות אישית, החלפה של צלחות פטרי. לבסוף, המכשיר שלנו יהיה שימושי לחקר ההפצות של תגובות תאים לגירויים חיצוניים, למשל סרטן 18 או במחקר בסיסי 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
דפוס העתק שמש כדי לפברק את 'eggcups'. תהליך הייצור לא צריך חדר נקי; זה קל ופשוט, אם כי חלק באימון ייתכן שיידרש. בפרט, משחרר את חותמת PDMS הוא השלב הקריטי ביותר כדי לייצר שטח גדול של 'eggcups' באיכות גבוהה. מסיבה זו, טיפול מיוחד יש לנקוט צעד זה. אם שלב זה הוא נכשל שוב ושוב, שקו…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים L. Brino (מתקן הקרנת תכולה גבוהה IGBMC, Illkirch, צרפת) למתן אותנו עם נוגדן אנטי Giantin, M. Labouesse מעבדה. עבור ג elegans (IGBMC) ו- B. Séraphin מעבדה. עבור נבגי שמרים (IGBMC), א פאלוך וא היימן עבור תאים פלורסנט הלה (MPI-CBG, דרזדן), ג 'מוסלי (הספר לרפואה Dartmouth) ו JQ וו (אוהיו סטייט) עבור תאי שמרים ביקוע; א Hoel ופ Evenou לעזרה ניסיוני, ג ריק (IBMC, שטרסבורג, צרפת) לעזרה טכנית, ו JC ז'אנו (Femto-st, צרפת) לעזרה microfabrication. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן CNRS, מאוניברסיטת שטרסבורג, Conectus, La Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר Medicale ואת CI-FRC של שטרסבורג.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Riveline, D., Buguin, A. . Devices and methods for observing the cell division. , (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Riveline, D. . Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , (2012).
- Riveline, D., Wollrab, V. . Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G., Hughes, M. P., Hoettges, K. F. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. 583, 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
