Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l'alta Screening contenuti
Summary
Riportiamo un dispositivo ed un nuovo metodo per studiare le cellule ed embrioni. celle singole sono proprio ordinati in array microcavità. Il loro confinamento 3D è un passo verso ambienti 3D incontrate in condizioni fisiologiche e permette l'orientamento organelli. Controllando la forma delle cellule, questa configurazione riduce al minimo la variabilità riportata nei test standard.
Abstract
cellule biologiche si osservano di solito su superfici piane (2D). Questa condizione non è fisiologico, e fenotipi e le forme sono molto variabili. Lo screening basato su cellule in tali ambienti sono quindi gravi limitazioni: organelli cellulari mostrano fenotipi estremi, morfologie di cellule e le dimensioni sono organelli cellulari eterogenee e / o specifiche non possono essere adeguatamente visualizzati. Inoltre, le cellule in vivo si trovano in un ambiente 3D; in questa situazione, le cellule mostrano diversi fenotipi principalmente a causa della loro interazione con la circostante matrice extracellulare del tessuto. Al fine di standardizzare e generare ordine delle singole cellule in un ambiente 3D fisiologicamente rilevanti per saggi cellulari, riportiamo qui la microfabbricazione e le applicazioni di un dispositivo per vitro coltura cellulare 3D. Questo dispositivo è costituito da una matrice 2D di microcavità (tipicamente 10 5 cavità / cm 2), ciascuna riempita di singole cellule o embrioni. cellulare posizione, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule diventano poi normalizzato che mostra un'architettura 3D. Abbiamo usato stampaggio replica a modello una serie di microcavità, (PDMS) strato 'portauova', SU UN polidimetilsilossano sottile aderito su un vetrino. Cavità sono state coperte con fibronectina per facilitare l'adesione. Le cellule sono state inserite mediante centrifugazione. percentuale di riempimento è stato ottimizzato per ciascun sistema consentendo fino al 80%. Le cellule ed embrioni viabilità è stata confermata. Abbiamo applicato questa metodologia per la visualizzazione di organelli cellulari, quali apparati nucleo e Golgi e studiare processi attivi, come la chiusura dell'anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Questo dispositivo ha permesso l'identificazione di nuove caratteristiche, come accumuli periodici e disomogeneità di miosina e actina durante la chiusura dell'anello cytokinetic e fenotipi compattati per Golgi e l'allineamento nucleo. Abbiamo caratterizzato il metodo per cellule di mammifero, lievito di fissione, lievito in erba, C. elegans wesimo adattamento specifico per ogni caso. Infine, le caratteristiche di questo dispositivo lo rendono particolarmente interessante per saggi di screening di farmaci e medicina personalizzata.
Introduction
Di corrente de saggi cellulari in vitro sono bidimensionali (2D). Questa configurazione non è naturale per le cellule di mammifero e pertanto non è fisiologicamente rilevanti 1; cellule mostrano una varietà di forme, dimensioni e fenotipi eterogenee. Essi presentano gravi limitazioni aggiuntive quando applicato alle applicazioni di screening, come ad esempio una distribuzione disordinata all'interno del piano e fenotipi estremi di organelli cellulari (fibre di stress, in particolare). Ciò è particolarmente importante in studi clinici per i test di droga, in cui i budget elevati vengono spesi ogni anno. La maggior parte di questi farmaci se non riescono quando applicata a modelli animali a causa della condizione coltura 2D artificiale nelle prime fasi di screening di farmaci. Inoltre, utilizzando questo approccio, organelli cellulari specifici non possono essere correttamente visualizzati, ad esempio l'anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare, e in generale strutture che si stanno evolvendo nel piano perpendicolare al piano di osservazione. Alcuninuovi test 2D sono stati proposti al fine di superare gli inconvenienti suddetti e importanti informazioni sull'organizzazione citoscheletro sono stati osservati 2,3. Tuttavia, questi test ancora presenti una seria limitazione: celle mostrano un fenotipo molto diffuse a differenza di quanto si osserva in vivo, in cui le cellule presentano un'architettura 3D. Tali artefatti associati al metodo di coltura possono innescare caratteristiche non fisiologici, come fibre di stress potenziate 1,4,5.
Tridimensionali saggi di colture cellulari forniscono molteplici vantaggi rispetto ai 2D ambienti 6,7. Essi sono fisiologicamente più rilevanti, ed i risultati sono quindi significativi. Come esempio, cellule incorporati in idrogel mostrano strutture 3D-like ma le loro morfologie differiscono da una cella all'altra 8,9. Tuttavia, le loro morfologie differiscono da una cella all'altra, il che complica applicazioni di screening. Una strategia alternativa è quella di incorporare singolocellule in cavità microfabbricate 10,11. la posizione delle cellule, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule possono quindi diventare normalizzata. Oltre a fornire l'architettura 3D-come le cellule, microcavità permette anche per gli studi di screening ad alto contenuto 10,12-14; singole cellule possono essere ordinati in microarray e organelli cellulari e le loro evoluzioni possono essere osservati in parallelo. Questa regolarità fornisce buone statistiche con un basso numero di cellule e migliori risoluzioni temporali / spaziale. Composti utili sono facili da identificare in maniera affidabile.
In questo studio, dimostriamo la fabbricazione e l'applicazione di un nuovo sistema di celle singola cultura 3D come ad alto contenuto di screening applicazioni 10,12,13. Il dispositivo è costituito da una matrice di microcavità elastomerici (10 5 cavità / cm 2), coniati 'eggcups' (EC). Dimensioni e volume totale di CE in questo lavoro sono ottimizzati per il volume tipico delle singole cellule NIH3T3 e HeLadurante la divisione cellulare. Morfologia delle cavità cilindriche – – è selezionato per la forma delle cellule correttamente orientare per la visualizzazione dei processi attivi. Stampaggio replica viene utilizzato per una vasta gamma di modello CE su un (PDMS) strato sottile polidimetilsilossano aderito su un bicchiere coprivetrino 15,16. Le cellule vengono introdotti nella CE per centrifugazione. Riportiamo qui di osservazione e la normalizzazione degli organelli cellulari (stress fibers di actina, apparato del Golgi e nucleo) in 3D (CE) in confronto con le stesse celle 2D (piatta) superfici. Riportiamo anche l'osservazione dei processi dinamici attivi quali la chiusura dell'anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare 17. Infine, mostriamo risultati di questa metodologia su altri sistemi con pareti rigide, come il lievito in erba, lievito di fissione e C. embrioni elegans che conferma l'applicabilità della nostra metodologia per una vasta gamma di sistemi modello.
Abbiamo poi presentiamo una p dettagliato ed esaustivoROTOCOLLO al fine di fabbricare e applicare le "Portauova" per microfabbricazione 3D. Il nostro approccio è semplice e non richiede una camera pulita. Prevediamo che questa nuova metodologia sarà particolarmente interessante per test di screening di farmaci e medicina personalizzata, in sostituzione di piastre di Petri. Infine, il dispositivo sarà utile per studiare le distribuzioni di cellule risposte a stimoli esterni, ad esempio nel cancro 18 o nella ricerca di base 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
stampaggio replica è stato utilizzato per fabbricare i 'portauova. Il processo di fabbricazione non ha bisogno di una camera pulita; è facile e semplice, anche se una certa pratica può essere richiesto. In particolare, rilasciando il timbro PDMS è la fase più critica per produrre una vasta area di 'portauova' alta qualità. Per questo motivo, particolare attenzione deve essere presa in questo passo. Se questo passaggio è più volte fallendo, prendere in considerazione per ottimizzare i parametri del pl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo L. Brino (impianto di screening Content IGBMC alta, Illkirch, Francia) per averci fornito l'anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. per C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. per il lievito (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman per le cellule HeLa fluorescenti (MPI-CBG, Dresda), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) per le cellule di lievito di fissione; A. Hoël e F. Evenou aiuto sperimentale, C. Rick (IBMC, Strasburgo, Francia) per assistenza tecnica, e JC Jeannot (Femto-st, Francia) per un aiuto nella microfabbricazione. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del CNRS, l'Università di Strasburgo, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale e la ci-FRC di Strasburgo.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
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