Summary
Abstract
Metagenomic bibliotheken archief grote fragmenten van aaneengesloten genomische sequenties van micro-organismen zonder voorafgaande teelt. Het genereren van een gestroomlijnde procedure voor het maken en screening metagenomic bibliotheken is dus nuttig voor een efficiënte high-throughput onderzoek naar de genetische en metabolische eigenschappen van onbeschaafde microbiële assemblages. Hier zijn de belangrijkste protocollen gepresenteerd op video, die we voorstellen is de meest bruikbare indeling voor het nauwkeurig beschrijven van een lang proces dat afwisselend afhankelijk van de robotica instrumentatie en (menselijke) handmatige interventies. Eerst hebben we in dienst robotica in de bibliotheek van klonen op high-density macroarray membranen, die elk kunnen dupliceren kolonies bevatten twintig-vier 384-wells platen bibliotheek plaats. Automatisering is van essentieel belang voor deze procedure niet alleen voor de nauwkeurigheid en snelheid, maar ook als gevolg van de miniaturisering van voldoende omvang om het grote aantal van de bibliotheek klonen passen in zeer dichte ruimtelijke arrangementen. Eenmaal gegenereerd, hebben we naast gedemonstreerd hoe de macroarray membranen kunnen worden gescreend op genen van belang met behulp van aangepaste versies van standaard protocollen voor probe etikettering, membraan hybridisatie, en signaal detectie. We aanvulling op de visuele demonstratie van deze procedures met gedetailleerde beschrijvingen van de betrokken stappen en de benodigde materialen, die allemaal zijn online beschikbaar naast de video.
Protocol
1. Hybridisatie procedure
Een hybridisatie buis duurt een of twee membranen (formaat 22 bij 22 cm). Gebruik 50 ml van hybridisatie mengsel en 0,5 mg van DNA-probe (10 ng / ml uiteindelijke concentratie) per hybridisatie buis. Voor de beste resultaten, gebruik van gel-gezuiverd DNA als probe. Als het opschalen van probe voorbereiding, toename aantal buizen in plaats van verhoging van het bedrag van de reagentia per buis.
Sonde voorbereiding (0,5 mg DNA):
- Verdun 15 ul van cross-linker-oplossing met 60 ul van het water.
- Verdunnen DNA tot 10 ng / ul met water tot 50 ui totaal volume in een schroef-bedekte microbuisjes.
- Denatureren DNA gedurende 5 minuten in kokend water.
- Snel naar ijs en laat afkoelen gedurende 5 minuten. Spin kort.
- Voeg 50 ul van de reactie buffer toe en meng voorzichtig.
- Voeg 10 ul van de etikettering reagens en meng voorzichtig.
- Voeg 50 ul van de verdunde cross-linker-oplossing uit stap 1 en meng voorzichtig. Vortex zacht en spin kort.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Te houden op ijs gedurende maximaal 2 uur of voeg een gelijk volume van 100% glycerol en bewaar bij -20 ° C.
Opmerking: Gebruik het water die bij de kit. Houd alle reagentia op ijs, tenzij anders vermeld.
Membraan voorbereiding en hybridisatie
- Verwarm 50 ml hybridisatiebuffer en hybridisatie buis tot 60 ° C.
- Voeg de hybridisatie buffer om de hybridisatie buis. Roll up membraan (s) en toevoegen aan hybridisatie buis. (Als toevoeging van 2 membranen per tube, eerste worp tot een membraan volledig, dan rollen de andere membraan op de top in dezelfde richting.)
- Incubeer hybridisatie buis bij 60 ° C gedurende ten minste ½ uur (Zorg ervoor dat membraan (s) te krijgen grondig doorweekt.)
- Breng ongeveer 1 ml van hybridisatie buffer met een lange pipet uit de hybridisatie buis op de buis met daarin de gelabelde probe. Vortex zacht en spin kort. Transfer terug mengsel hybridisatie buis.
- Incubeer bij 60 ° C gedurende de nacht.
Opmerking: Gebruik tang en handschoenen bij het hanteren van membranen. Meng de inhoud van hybridisatie buizen voorzichtig omdat er te veel onrust zal leiden tot een permanente vorming van ongewenste schuim. Membranen moet worden toegevoegd in natte toestand; weken in hybridisatiebuffer of water, indien nodig en afvoer overtollige vloeistof voor het toevoegen.
2. Detectie procedure
Wassen van membranen
- Verwarm de primaire wasbuffer tot 60 ° C. (Gebruik magnetron en / of verwarming plaat.)
- Als er twee membranen in een hybridisatie buis, overdracht een membraan naar een schone, voorverwarmde, lege hybridisatie buis.
- Kort spoelen hybridisatie buis met ongeveer 50 ml van de primaire wasbuffer.
- Voeg ongeveer 100 ml van de primaire wasbuffer tot hybridisatie buis en incubeer bij 60 ° C gedurende 10 minuten.
- Herhaal stap 3 en 4.
- Transfer membraan te wassen container en incubeer met ten minste 250 ml van het voortgezet wasbuffer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Herhaal stap 6.
Opmerking: Membranen kunnen worden bewaard in de secundaire wasbuffer bij kamertemperatuur maximaal ½ uur voordat het signaal generatie.
Signaal generatie en detectie (procedure voor een membraan)
- Tape twee stukken SaranWrap plat op het tafelblad (een voor stap 2 en een voor stap 4).
- Zorgvuldig afvoer van overtollige buffer van het membraan door het aanraken van de hoeken van het membraan tegen de zijkant van de container en breng het membraan onto de SaranWrap (sample kant naar boven).
- Giet 6-7 ml van ECF reagens meer dan membraan en vouw Saran wrap op membraan. Zorgvuldig verdelen ECF reagens op membraan door voorzichtig het verplaatsen van een Kimwipe over de SaranWrap. Incubeer gedurende 5 minuten.
- Afvoer van overtollig ECF reagens van het membraan en breng deze op nieuwe SaranWrap, vouw wrap meer dan membraan, en verzegel de randen met tape. Bedek het membraan met aluminiumfolie. Incubeer 1-2 uur.
- Bereid de glasplaat plaat door het verspreiden van 1-2 ml van ECF reagens op de glasplaat. Vervolgens overbrengen van het membraan op de glazen plaat (staal naar beneden) en distribueren nog 1-2 ml van ECF reagens over het membraan. Overlay met SaranWrap en zorgvuldig duw alle luchtbellen uit de buurt van het membraan. (Je kan een stijve plaat op de top van de SaranWrap om membraan gedrukt tegen de glazen plaat te houden.)
- Gebruik maken van de Fuji FLA-5100 fluorescentie scanner ("een laser een afbeelding" modus) met de volgende instellingen: excitatie 473 nm, detectie filter LPB (510 nm), de resolutie 50 micrometer, 16-bit signaal afstuderen, CH1 400 V. (Scan duurt ongeveer 15-20 minuten per membraan van de grootte van 22 bij 22 cm.)
Optioneel: - Laten we gaan zitten voor 2-4 uur (of langer).
- Herhaal scan als in stap 6.
3. Strippen en opslaan procedure (nuf versie)
- Transfer membraan tot 100% ethanol en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten onder zacht schudden.
- Vervangen met verse 100% ethanol en incubeer overnacht bij kamertemperatuur. (Membrane kunnen blijven in ethanol voor meerdere dagen.)
- Vervangen door ethanol met gedestilleerd water en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Voeg 100 ml water en 5 ml van 10% SDS (laatste 0,5% SDS) om een hybridisatie buis en meng voorzichtig. Toe te voegen membraan.
- Incubeer bij 80 ° C gedurende 1 uur
- Transfer membraan tot een schone, lege container.
- Voeg 500 ml water en 5 ml van 10% SDS (laatste 0,1% SDS), een beker en warmte aan een krachtige kook in de magnetron.
- Giet de bijna kokende 0,1% SDS oplossing over het membraan en schud er voorzichtig gedurende enkele minuten. Laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Spoel in ten minste 250 ml van een steriele 100 mM Tris pH 8 gedurende minstens 10 minuten.
- Wikkel membraan in SaranWrap en zorgvuldig nauwe randen met tapes. Bewaren bij 4 ° C. (Membranen mag nooit uitdrogen.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De strippen procedure is nog niet geoptimaliseerd. Echter, de strippen procedure in opdracht van de fabrikant (2 wasbeurten per stuk, 10 min in 100% ethanol, een wash van 1 uur bij 60 ° C in 0,5% SDS) is onvoldoende. In ieder geval overnacht incubatie in 100% ethanol nodig is om de ECF reactieproduct te ontbinden; enkele dagen incubatie in 100% ethanol lijkt te hebben geen nadelige effecten op het vermogen om het membraan reprobe. De door de fabrikant SDS behandeling lijkt ook onvoldoende. Nuf heeft geprobeerd een uur bij 80 ° C met 0,5% SDS gevolgd door een behandeling met bijna kokend 0,1% SDS met succes. Tracy heeft aangetoond dat een keer gieten-over met bijna kokend 0,1% SDS voldoende is.
Handige tips:
De hybridisatie buffer, hybridisatie buis, en primaire wasbuffer moet worden voorverwarmd tot 60 ° C vóór gebruik, en moet op deze temperatuur gehouden worden gedurende het experiment. Bijvoorbeeld, houd de buffers op een verwarmingsplaat met een ondergedompeld thermometer, op een Corning verwarmingsplaat, een instelling van ongeveer 3 resultaten in 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur | |||
| Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685 | ||||
