Summary
Nous avons modifié la levure classique double-hybride en dépistage, un outil efficace dans l'identification génétique d'interactions protéiques. Cette modification raccourcit nettement le processus, réduit la charge de travail, et surtout, réduit le nombre de faux positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable.
Abstract
Progranuline (PGRN), aussi connu comme granulin epithelin précurseurs (GEP), est un facteur de croissance 593 acides aminés autocrine. PGRN est connue pour jouer un rôle critique dans une variété de processus physiologiques et les maladies, y compris l'embryogenèse précoce, une cicatrisation, l'inflammation 2, 3 et 4 défense de l'hôte. PGRN fonctionne également comme un facteur neurotrophique 5, et des mutations dans le gène PGRN résultant en une perte partielle de la démence frontotemporale PGRN provoquer des protéines 6, 7. Nos études récentes ont conduit à l'isolement du PGRN comme un régulateur important du développement du cartilage et de la dégradation 8-11. Bien PGRN, découvert près de deux décennies auparavant, joue un rôle crucial dans de multiples conditions physiologiques et pathologiques, les efforts pour exploiter les actions du PGRN et de comprendre les mécanismes impliqués ont été considérablement entravés par notre incapacité à identifier ses liaison au récepteur (s). Pour répondre à cette question, nous avons développé une modiFied deux hybrides de levure (MY2H) approche fondée sur le plus couramment utilisé GAL4 base 2-hybride. Comparé avec les deux hybrides de levure écran conventionnel, MY2H raccourcit considérablement le processus de l'écran et réduit le nombre de faux clones positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable, et nous avons utilisé avec succès ce système à isoler les protéines de liaison d'appâts différents, y compris les canaux ioniques 12, protéine de la matrice extracellulaire 10, 13 et 14 du facteur de croissance. Dans cet article, nous décrivons cette procédure expérimentale MY2H en détail en utilisant PGRN comme un exemple qui a conduit à l'identification de TNFR2 que le premier connu PGRN-récepteur associé 14, 15.
Protocol
1. Informations générales
Les deux hybrides de levure système est une technique puissante génétique utilisé pour découvrir interactions protéine-protéine 16, 17. Plusieurs types de deux systèmes hybrides, tels que les systèmes basés sur lexA, le système de recrutement Sos, et de bactéries ou de mammifères basés sur les cellules 2-hybrides, sont disponibles dans le commerce, ce document se concentre spécifiquement sur les modifications de la plus couramment utilisée basée GAL4 levure 2-hybride. Brièvement, la méthode est basée sur les propriétés de la protéine GAL4 de la levure qui se compose des domaines séparables responsable de l'activation liaison à l'ADN et la transcription. La protéine appât est exprimé comme une fusion de la liaison à l'ADN GAL4 de domaine (ADN-BD), tandis que les protéines proies sont exprimés sous forme fusionnée avec le domaine d'activation GAL4 (AD). L'interaction entre l'appât et la proie des protéines de fusion conduit à des activations de la transcription de GAL4 sites de liaison contenant des gènes rapporteurs qui sont intégrés dans le g de levureenome. Le principe de Y2H est illustré dans la Fig. 1 et la procédure expérimentale est résumée dans la Fig. 2.
2. Matières obligatoires et des solutions
- Milieu de croissance YPD (un mélange de peptone, extrait de levure et dextrose dans des proportions optimales pour la culture la plupart des souches de Saccharomyces cerevisiae).
- Minimal Bases SD (Minimal synthétiques définis (SD) des bases comprennent une base azotée de levure, sulfate d'ammonium, et une source de carbone, le dextrose. Dropout (DO) des suppléments peuvent être ajoutés à la base minimale SD pour faire une synthèse, un milieu défini manquent l'spécifiée nutriments).
- Leu /-Trp Dropout (DO) supplément (contenant tous les acides aminés essentiels, sauf pour la leucine et de tryptophane)
- Dropout -His/-Leu/-Trp/-Ura (NE) Supplément (contenant tous les acides aminés essentiels, sauf pour la leucine, le tryptophane, l'histidine et uracile)
- Luria Broth (LB) (tryptone 10 g / L, extrait de levure 5 g / L, NaCl 5 g / L)
- X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) solution: préparer un 20 mg / ml de solution concentrée dans le N, N-Diméthylformamide
- 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 10 mM, à l'autoclave)
- Hareng soniqué ou de l'ADN de sperme de saumon, cuit (10 mg / ml)
- LiAc 10X (1 M d'acétate de lithium, à l'autoclave)
- 50% de PEG-3350 solution, stérilisée par filtration
- 3-amino-1, 2, 4-triazole (3AT)
- Kanamycine
- Ampicilline
- ElectroMax cellules DH5a
- Z buffer: 16,1 g de Na2HPO4 7H2O (ou 8,52 g anhydre), 5,5 g de NaH2PO4 H2O (ou 4,8 ganhydrous), 0,75 g de KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (ou 0,12 g anhydre), dissous dans 1 L autoclave, l'eau distillée et ajustée à pH 7,0.
3. La génération d'appâts (pDBLeu-PGRN)
Un fragment d'ADNc codant PGRN manque peptide signal (aa21-588) a été cloné dans le directionnellement Sal I-Non, je les sites du vecteur pDBLeu (le ProQuest système double-hybride, Invitrogen),garder la frame même traduction lecture comme domaine liant l'ADN GAL4 pour générer pDBLeu-PGRN.
- Amplifier le fragment d'ADNc de PGRN décrit ci-dessus par PCR utilisant des amorces oligonucléotidiques conçues pour contenir des sites de restriction (Sal I à l'extrémité 5 et Not I à l'extrémité 3) pour permettre au châssis de fusion.
- Gel purifier le produit de PCR, digestion avec des endonucléases de restriction Sal I et Not I.
Préparer la DB vectorielle pDBLeu par digestion de restriction double avec les endonucléases de restriction même. - Ligaturer les fragments de restriction dans PGRN le vecteur linéarisé pDBLeu et se transforment en DH5a avec sélection pour LB + kanamycine à 25 pg / ml.
- Vérifiez la correction de la construction par séquençage d'ADN.
4. La transformation à petite échelle de l'appât plasmidique
- Inoculer 5 ml de YPD avec une colonie de Mav203 (Invitrogen), agiter une nuit à 30 ° C.
- Diluer la culture durant la nuit dans 50 ml de YPD. Cultivez un complémentitional 2-4 heures.
- Pellet les cellules à 3000 rpm pendant 5 min à température ambiante. Reprendre le culot dans 40 ml d'autoclave, de l'eau distillée.
- Re-culot cellulaire. Remettre en suspension dans 2 ml de solution I, incuber à température ambiante 10 min.
Solution I: 0,5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml de H 2 O - Distribuer de l'ADN à des tubes: 2-3 pl d'pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) et 10 pi de dénaturé, d'ADN de sperme de saumon cisaillé (10μg/μl). Ajouter 100 ul de cellules de levure, bien mélanger.
- Ajouter la solution 700μl II, bien mélanger. Incuber à 30 ° C pendant 30 min. Solution II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml de 50% PEG3350.
- Choc thermique à 42 ° C pendant 15 min.
- Pellet pendant 2 min. Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 200 pi autoclave, l'eau distillée.
- Plaque de la suspension sur SD-Leu plaques avec des dilutions successives. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 2-3 jours.
5. Validation des appâts
Avant d'effectuer yeal'écran er de double-hybride, le test pDBLeu-PGRN pour l'auto-activation et de déterminer les niveaux d'expression basale du gène HIS3 journaliste. Ce test détermine si appâts activer la transcription et si l'auto-activation peut être neutralisé par des inhibiteurs. 3-amino-1, 2, 4-triazole (3-AT) est un inhibiteur compétitif du produit HIS3-gène et peut être utilisé pour titrer le niveau minimum de HIS3 d'expression nécessaires à la croissance sur l'histidine déficientes médias.
- Transformer le pDBLeu-PGRN dans la levure Mav203 souche, plaque de la transformation sur SD-Leu plaques et incuber pendant 48-72 h à 30 ° C.
- Patch colonies de chaque transformation à l'aide de cure-dents autoclavés sur SD-Leu-His plaques contenant 3-AT à des concentrations de 10 mm, 25 mm, 50 mm, 75 mm et 100 mm. 3-AT est un inhibiteur compétitif de l'enzyme HIS3 et appâts qui présentent uniquement l'auto-activation sera capable de croître dans la présence du 3-AT.
- Souches appât qui poussent sur des plaques containing 100 mM 3-AT ne sont pas adaptés pour une utilisation dans l'écran du double hybride. Pour appâts qui peuvent être utilisées, l'utilisation la plus faible concentration en 3-AT qui inhibe la croissance cellulaire. Dans de nombreux cas, 25 mM de 3-AT est utilisé pour le dépistage.
6. criblage de banques d'ADNc
Le plasmide pDBLeu-PGRN est introduit dans MaV203 utilisant une transformation à petite échelle comme décrit ci-dessus. Pour introduire pPC86-bibliothèque (Invitrogen) dans MaV203 (pDBLeu-PGRN), la procédure décrite ci-dessous donne généralement ~ 4 x 10 4 colonies avec 0,5 pg d'ADN plasmidique bibliothèque. Ainsi, 2,5 x 10 6 transformants de levure, il faudra ~ 30,0 mg pPC86-ADNc ADN plasmidique bibliothèque, 25 transformations, et cinquante plaques de 10 cm (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT).
- Préparer le nombre approprié de 10 cm de SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT plaques (50 pour la procédure ci-dessous). Également préparer au moins quatre de 10 cm SD-Leu-Trp plaques pour estimer le nombre de transformants.
- Transformez la bibliothèque dansl'MaV203 contenant pDBLeu-PGRN selon la procédure décrite ci-dessous.
- Suspendre plusieurs colonies isolées de MaV203 (pDBLeu-PGRN) dans ~ 100 ul autoclave, l'eau distillée et de les étaler sur une période de 10 cm SD-Leu assiette. Répétez la procédure pour un deuxième DD-Leu assiette. Incuber les deux plaques pendant 18-24 h à 30 ° C.
- Grattez et complètement cellules en suspension dans 10 ml autoclave, l'eau distillée. Ajouter un volume suffisant de cellules en suspension dans 500 ml de milieu YPD liquide dans un flacon de donner une DO 600 de 0,1 ~.
- Vérifiez que la DO est ~ 0,1 après l'inoculation.
- Agiter à 30 ° C jusqu'à une DO 600 atteigne environ 0,4.
- Préparer une solution fraîche:
- 110 ml 1X TE / LiAc en combinant 11 ml 10X TE, 11 ml LiAc 10X, et 88 ml d'eau en autoclave.
- 16 ml de PEG / LiAc en combinant 1,6 ml 10X TE, 1,6 ml LiAc 10X, et de 12,8 ml à 50% de PEG-3350.
- Pellet les cellules à 3000g pendant 5 min à température ambiante.
- Jeter tIl surnageants et doucement resuspendre le culot par pipetage haut et en bas de 100 ml en autoclave, de l'eau distillée à température ambiante.
- Centrifuger à 3000 g pendant 5 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant des cellules centrifugé et remettre le culot cellulaire dans 50 ml 1X TE / LiAc solution.
- Centrifuger à 3000 g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer les surnageants et remettre le culot dans un volume final de 2,5 ml 1X TE / LiAc solution.
- Effectuer 25 transformations. Combinez 2,5 ml de cellules, 125 pi (10μg/μl) dénaturé, cisaillé d'ADN de sperme de saumon, et 30 mg de bibliothèques d'ADNc. Mélanger doucement par aspiration et refoulement. Ajouter 15 ml de PEG / LiAc solution et mélanger doucement. Aliquoter en 25 autoclave microtubes de 1,5 ml de 700 ul chacun.
- Incuber pendant 30 min dans un bain d'eau à 30 ° C.
- Choc thermique pendant 15 min dans un bain d'eau à 42 ° C.
- Centrifuger à 6000 g pendant 1 min à température ambiante. Retirez délicatement le supersurnageant. Doucement resuspendre chaque culot dans 400 pi autoclave, l'eau distillée par aspiration et refoulement.
- Plaque de transformation du mélange 200 pi de chaque transformation sur simple de 10 cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT (3AT de concentration: 25 mm) des plaques en utilisant une barre de propagation, donc 25 autoclave de 1,5 ml microtubes peut faire 50 plaques (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT).
- Incuber les boîtes pendant 5-10 jours à 30 ° C.
- Pour estimer l'efficacité de transformation de la réaction, des dilutions en série d'une réaction (1:40; 1:400 et 1:4000) sont plaquées sur le DD-Leu-Trp assiette. Après une incubation de 3 jours à 30 ° C, le nombre de colonies est compté et le nombre total de transformants calculé.
7. X-gal test
- Transfert des colonies sur la plaque YPD; incuber à 30 ° C pendant la nuit.
- Placez arrondis membrane de nitrocellulose sur la plaque YPD; s'assurer qu'il n'y ait pas de bulles entre la membrane et la plaque YPD. Après 1-2 min, MAke vous que toutes les colonies sont transférées sur des membranes (papier de nitrocellulose).
- Placez le côté colonie de la membrane dans l'embarcation faite avec du papier aluminium.
- Mettre la membrane dans l'azote liquide, attendre vingt secondes, et plonger dans l'azote liquide pour un couple de minutes.
- Sortez la membrane à dégeler.
- Pendant ce temps mélanger les réactifs suivants:
1.5ml de tampon Z
20 pi X-gal (20 mg / ml) - Déposer Z buffer / X-gal dans une boîte de Pétri, placer du papier Whatman sur le dessus de cela.
- Placez délicatement le papier de nitrocellulose sur du papier Whatman.
- Incuber à 37 ° jusqu'à ce que les colonies bleues apparaissent.
8. Dosage de retransformation
Protéines de fusion Prey (AD-Y) isolée de criblage de la banque devrait conserver l'interaction avec la protéine de fusion d'appât (DB-X) pour induire les gènes rapport, et la retransformation des clones proie et l'appât de construire dans la levure peut encore éliminer les faux positifs et de faciliter ajoutezAnalyse itional.
- Isoler l'ADN plasmidique à partir de souches de levures contenant potentiellement des protéines qui interagissent.
- Transformez l'ADN dans E. coli DH5a cellules, plaque les transformations sur LB 100 pg / ml d'ampicilline plaques pour isoler sélectivement la bibliothèque pPC86-ADNc, et incuber une nuit à 37 ° C.
- Choisissez plusieurs colonies de la plaque pour mettre en LB 100 pg / ml d'ampicilline bouillon.
- Préparer l'ADN miniprep et examiner par analyse de restriction doubles avec Sal I et Not I.
- Co-transformer les proies plasmide et appâts plasmide dans MaV203, plaque les mélanges de transformation sur SC-Leu-Trp plaques et incuber pendant 2-3 jours à 30 ° C.
- Choisissez trois différentes colonies de la plaque SC-Leu-Trp, exécuter X-gal Assay.
9. Séquençage et analyse bioinformatique
Séquence de l'ADN plasmidique a été isolé à partir probablement vrai clones positifs, comparer ces séquences à celles de la GenBank en utilisant la BLAProgramme ST, et d'identifier les clones à deux hybrides qui correspondent à des gènes connus. Les données de séquençage a montré que deux des 12 positifs obtenus ci-dessus ont été la surface des cellules TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; Adhésion # NM_130426). En outre, l'interaction entre PGRN et TNFR a été vérifiée à l'aide de divers tests d'interaction protéine-protéine, y compris in vitro, en phase solide test de liaison, de co-immunoprécipitation, résonance plasmonique de surface d'analyse et de test de cytométrie en flux 14.
10. Les résultats représentatifs
L'organigramme du dépistage est indiqué dans la Fig. 3. Typiquement 50-100 candidats clone positif sera obtenu à cette étape. Nous avons d'abord isolées 54 candidats clone positif parmi les 2,5 millions de transformants sélectionnés avec l'appât PGRN. Candidats clone positif ont ensuite été vérifiés en effectuant X-gal dosage. Typiquement, environ 50% de faux clones positifs sont éliminés par X-gal dosage. Nous avons obtenu 23 clones positifs candides Ates à cette étape pour l'appât PGRN (fig. 4). Retransformation des clones proies et de construire des appâts dans la levure encore éliminer les faux positifs et les clones qui continuent d'activer les gènes rapporteurs susceptibles de représenter l'vrais positifs. Typiquement, environ 50% des candidats clone positif sera supprimé. Nous avons finalement isolé 12 clones positifs qui interagissent avec PGRN dans la levure.
Figure 1. Principe de la levure système double-hybride
Figure 2. Pipeline d'identifier des partenaires de liaison aux protéines en utilisant des levures système double-hybride
Figure 3. Organigramme de la levure de dépistage double-hybride en bibliothèque.rge.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour voir une version pleine grandeur de cette image.
Figure 4. Bêta-galactosidase dosage des candidats clone positif. Un des clones, obtenus à partir de Positive écran de la bibliothèque ont été transférés à la plaque YPD et incubées à 30 ° C pendant la nuit; B, toutes les colonies sur la plaque YPD ont été transférés à des membranes de nitrocellulose et de la bêta-galactosidase essai effectué.
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Discussion
Deux hybrides de levure de dépistage s'est avéré être un outil efficace dans l'identification des interactions protéine 16, 17. Comparé à d'autres approches pour identifier les protéines liant les partenaires, tels que biochimiques co-purification de protéines et de puces, deux hybrides de levure système est une approche sensible génétiques qui peuvent être utilisés pour le dépistage très grand nombre de séquences codantes dans une expérience relativement simple, dans De plus, il détecte les en interaction in vivo et n'a pas besoin de purification des protéines complexes. De levure de cours de deux hybrides système a ses limites, par exemple, l'absence du nombre requis modifications post-traductionnelles, le pliage insuffisante et / ou la stabilité d'une protéine de fusion, et l'emplacement modifié subcellulaire (protéines sont amenés vers le noyau, ce qui peut pas être l'état physiologique réel). En outre, les protéines qui présentent le déclenchement injustifié des gènes rapporteurs, les activateurs de soi, par exemple, ne peuvent être directement utilisés comme appâts pour le dépistage du CD proiesBibliothèques NA. Afin de pallier cet inconvénient, les domaines fonctionnels individuels plutôt que des protéines intactes, sont généralement utilisés comme appâts suivie par les validations des interactions en utilisant des approches différentes avec les protéines intactes. Par exemple, nous avons réussi à isoler ADAMTS-7 métalloprotéinase et facteur de croissance progranuline que les partenaires de liaison de COMP utilisant le domaine EGF-like du COMP comme un appât 10, 13.
La procédure de dépistage conventionnels prend du temps, puisque les transformants de levure sont étalées sur le premier minus-trois plaques (SD-Leu-Trp-His 3 AT) pour sélectionner ses clones +, qui sont ensuite transférés vers le second moins-trois plaques (SD -Leu-Trp-Ura 3 AT) pour la sélection Ura. En outre, la réplication de milliers de clones positifs a besoin d'outils spéciaux, et ce processus entraîne souvent l'écran dans un grand nombre de faux positifs. Nous plaquées directement les transformants de levure sur-moins quatre plaques (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT) plutôt que deux minus-trois plaques, parce que les clones véritable interaction devrait être en mesure pour activer simultanément l'ensemble des constructions rapporteurs (histidine-dire la production, et l'uracile) intégré dans le génome de la levure et devrait survivre sur moins-quatre plaques (SD-Leu-Trp-His- Ura 3 AT). Cette modification raccourcit nettement le processus (par exemple la procédure de dépistage conventionnels prend habituellement 10-20 jours, alors que la procédure d'écran modifiée doit seulement 5-10 jours), réduit la charge de travail, et, surtout, réduit le nombre de faux positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable, et nous avons utilisé avec succès ce système modifié à isoler les protéines de liaison d'appâts différents, dont 12 canaux sodiques et des protéines de la matrice extracellulaire 10, 13. Récemment, nous avons identifié comme un ligand PGRN roman de récepteurs du TNF en utilisant cette approche 14, 15, fournissant une base solide pour de futures découvertes liées à ce facteur de croissance.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions de recherche des NIH K01AR053210, R01AR061484 et une subvention du National Psoriasis Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 | |
| YPD Growth Medium | Clontech Laboratories | 630409 | |
| YPD Agar Medium | Clontech Laboratories | 630410 | |
| Minimal SD agar Base | Clontech Laboratories | 630412 | |
| -Leu DO Supplement | Clontech Laboratories | 630414 | |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech Laboratories | 630417 | |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech Laboratories | 630425 | |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene, Agilent Technologies | 201190 | |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 | |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 | |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 | |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
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