العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية
Summary
الأوعية الدموية داخل الميناء الهيكل العظمي والعضلات العديد من السكان السلائف متعددة النسب البشرية التي هي مثالية لتطبيقات التجدد. هذه الطريقة العزلة يسمح تنقية وقت واحد من ثلاثة السكان الخلية متعددة القدرات السلائف على التوالي من ثلاث طبقات الهيكلية الأوعية الدموية: خلايا المنشأ العضلي من البطانية البطانية، pericytes من وسائل الإعلام، وخلايا الغلالة البرانية من البرانية.
Abstract
منذ اكتشاف الوسيطة الجذعية / خلايا انسجة (اللجان الدائمة)، تم حجب هوية الأم وتوطين اللجان الدائمة بأثر رجعي من العزلة في الثقافة. في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS)، ونحن وغيرهم من الباحثين تحديد مستقبلي وتنقيته ثلاث مجموعات سكانية فرعية من الخلايا متعددة القدرات السلائف المرتبطة الأوعية الدموية للعضلات الهيكل العظمي الإنسان. هؤلاء السكان ثلاث خلايا: الخلايا البطانية المنشأ العضلي (MECS)، pericytes (أجهزة الكمبيوتر)، وخلايا الغلالة البرانية (ACS)، يتم ترجمة على التوالي إلى ثلاث طبقات الهيكلية الأوعية الدموية: البطانية، وسائل الإعلام، والبرانية. كل هذه الأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية (hBVSC) التعبير عن المجموعات السكانية ليس فقط علامات MSC الكلاسيكية ولكن أيضا تمتلك الإمكانات التنموية أرومية متوسطة مماثلة إلى اللجان الدائمة نموذجية. سابقا، وقد تم عزل MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف من خلال بروتوكولات واضحة وتتميز لاحقا في دراسات منفصلة. والبروتوكول الاضافي العزلة الحاليocol، من خلال تعديلات على عملية العزل وتعديلات في انتقائية علامات سطح الخلية، ويسمح لنا لتنقية وقت واحد كل ثلاثة مجموعات سكانية فرعية hBVSC بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية من واحد خزعة العضلات البشري. وهذه الطريقة الجديدة لا تبسيط فقط عزل مجموعات سكانية فرعية BVSC متعددة ولكن أيضا تسهيل التطبيقات السريرية في المستقبل من hBVSCs لأغراض علاجية متميزة.
Introduction
وقد اعتبر العضلات والهيكل العظمي الإنسان مصدرا جذابا سريريا الخلايا الجذعية / السلف. يحتوي الهيكل العظمي والعضلات لا تلتزم فقط الأسلاف المنشأ العضلي، myoblasts الهيكل العظمي، ولكن أيضا خلايا جذعية بدائية المنشأ العضلي، بما في ذلك الخلايا الأقمار الصناعية والخلايا الجذعية المشتقة من العضلات (MDSCs) 1. وقد تم التحقيق في استخدام الخلايا البشرية مأخوذة من العضلات الجذعية / السلف، ذاتي أو خيفي، في الطب التجديدي على نطاق واسع في النماذج الحيوانية ما قبل السريرية والتجارب السريرية. تطبيقات التجدد من العضلات الخلايا الجذعية / السلف تتراوح بين تجديد عضلة التصنع في ضمور العضلات دوشين (DMD) من المرضى إلى إصلاح القلب بجروح في المرضى الذين يعانون من النوبات القلبية.
منذ اكتشاف الوسيطة الجذعية / خلايا انسجة (اللجان الدائمة) وغيرهم من السكان السلائف الخلية متعددة القدرات، بما في ذلك الخلايا المشتقة من نخاع العظام متعددة القدرات السلف الكبار (MAPCs) والخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (ADSCs)، الجذعية البالغة /تم التحقيق الخلايا الاولية على نطاق واسع حتى الآن 1-9. ومع ذلك، فقد تم حجب هوية الأم والتعريب في الموقع من قبل وسائل العزل بأثر رجعي. في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام الخلايا مضان تنشيط الفرز (FACS)، ونحن وجماعات أخرى قد حددت مستقبلي وتنقيته ثلاث السكان الخلية السلائف متعددة القدرات من الأوعية الدموية داخل العضلات والهيكل العظمي الإنسان والعديد من الأجهزة الأخرى: الخلايا البطانية المنشأ العضلي (MECS)، pericytes (أجهزة الكمبيوتر)، وخلايا الغلالة البرانية (ACS) 10. هذه المجموعات السكانية الفرعية الثلاثة من الخلايا الجذعية الدموية والأوعية المشتقة الإنسان (hBVSCs) يمكن العثور على التوالي في ثلاث طبقات الهيكلية الأوعية الدموية: الغلالة البطانية، وسائل الإعلام الغلالة، والغلالة البرانية. بشكل أكثر تحديدا، تم الكشف عن MECS وأجهزة الكمبيوتر في microvessels والشعيرات الدموية في حين يتم ترجمة أجهزة التكييف في الطبقة البرانية الشرايين والأوردة الكبيرة. كل خلية فرعية تمهيدا تعبر عن مزيج فريد من مستضدات سطح الخلية: MECS (CD34 + / 56 + / + 144/45 -) وأجهزة الكمبيوتر (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -)، وأجهزة التكييف (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
كشف مزيد من توصيف هذه مجموعات فرعية hBVSC أن جميع السكان الخلية السلائف ثلاثة امتلاك الإمكانات التنموية أرومية متوسطة مماثلة إلى اللجان الدائمة نموذجية، بما في ذلك الهيكل العظمي تكون العضل، تكون العظم، الغضروف، وتكون الشحم. جميع مجموعات فرعية hBVSC أيضا يحمل علامات MSC الكلاسيكية، بما في ذلك CD44، CD73، CD90، وCD105، طازجة والثقافة. بشكل جماعي هذه القطع من الأدلة تؤيد أصل الأوعية الدموية من اللجان الدائمة. وعلاوة على ذلك، تم مؤخرا أظهر قدرات علاجية من MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف في دراسات منفصلة. وقد أظهرت MECS فرزها من البالغين الخزعات العضلية الإنسان لتجديد العضلات المصابة والتصنع والهيكل العظمي وإصلاح عضلة القلب جرح أكثر كفاءة من myoblasts الهيكل العظمي والأوعية الدموية إندوخلايا thelial (ECS). وقد تبين أيضا أجهزة تنقية من مختلف الأعضاء البشرية لإصلاح / تجديد العضلات الهيكلية المصابة والتصنع والمساهمة في تجمع الخلايا الأقمار الصناعية 13-16. مؤخرا جدا، لقد أثبتنا أن أجهزة الكمبيوتر المستمدة من العضلات والهيكل العظمي الإنسان على نحو فعال إصلاح عضلة القلب محتشية من خلال تأثير غير مباشر نظير الصماوي والتفاعلات الخلوية مباشرة 17. أجهزة التكييف، من ناحية أخرى، كانت إما معزولة مباشرة من الأوعية الدموية explanted أو تنقيته بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية من الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان والعضلات والهيكل العظمي. وقد تجلى تأثير والمؤيدة للعائية ملحوظ من أجهزة التكييف في الماوس القائمة الخلفية نموذج نقص التروية 19. وعلاوة على ذلك، كما تم أظهرت أجهزة التكييف لإصلاح عضلة القلب محتشية أكثر كفاءة من اللجان الدائمة التقليدية، مما يدل على الإمكانات العلاجية قوية من أجهزة التكييف في إصلاح الأنسجة الدماغية 20.
المنح الحالية بروتوكول تنقية وقت واحد، وتنقية المحتملين من MECS، وأجهزة الكمبيوتر، وأجهزة التكييف من الأوعية الدموية من خزعة العضلات والهيكل العظمي البشري واحد. وهذا يسمح لنا لدراسة و / أو اختيار حيوانية hBVSC الأمثل لأغراض علاجية متميزة. بالإضافة إلى ذلك، توسع هذه التقنية الجديدة أيضا على ذخيرة من الخلايا الجذعية / السلف التي يمكن استخلاصها من عضلات الهيكل العظمي الإنسان، مما يجعلها مصدرا مثاليا للخلايا متعددة القدرات تمهيدا للطب التجديدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد وتنقية المجموعات السكانية الفرعية hBVSC تمثل تقدما كبيرا في فهم تطور الجنين MSC. هناك أدلة متزايدة تشير إلى أصل ماحول الأوعية من اللجان الدائمة والارتباط بين خلايا السلائف الأنسجة محددة والأوعية الدموية 22-25. بالإضافة إلى ذلك، القدرة على عزل مجموعات سكانية ف?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر أليسون وجار لها المساعدة التقنية ممتازة مع التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الدفاع (JH)، وهنري J. مانكين هبوا كرسي (JH)، ووزارة التعليم والعلوم في جمهورية كازاخستان (AS). وأيد اتفاقية حظر الأسلحة الكيميائية في جزء من الزمالة دكتوراه مسبقا جمعية القلب الأمريكية (11PRE7490001). وأيد M.Corselli بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي منحة التدريب (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
