Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle
Summary
Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.
Abstract
Sinds de ontdekking van mesenchymale stam / stromale cellen (MSC's) zijn de inheemse identiteit en lokalisatie van MSCs overschaduwd door hun retrospectieve isolatie in kweek. Onlangs, met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), wij en andere onderzoekers prospectief geïdentificeerd en gezuiverd drie subpopulaties van multipotente precursorcellen geassocieerd met het vaatstelsel van de menselijke skeletspier. Deze drie celpopulaties: myogene endotheelcellen (MEC), pericyten (PC) en adventitia-cellen (ACS), respectievelijk gelokaliseerd op de drie structurele lagen van bloedvaten: intima, media en adventitia. Al deze menselijk bloed-schip-afgeleide stamcellen (hBVSC) populaties niet alleen uiten klassieke MSC markers, maar ook beschikken over mesodermaal ontwikkelings mogelijkheden vergelijkbaar met typische MSC's. Eerder hebben MEC's, pc's, en ACS zijn geïsoleerd door middel van verschillende protocollen en vervolgens gekarakteriseerd in afzonderlijke studies. De huidige isolatie protocol, door wijzigingen van het isolatieproces en aanpassingen in het selectieve celoppervlak markers, kunnen we gelijktijdig zuiveren drie hBVSC subpopulaties door FACS uit een enkel menselijk spierbiopsie. Deze nieuwe methode zal niet alleen de isolatie van meerdere BVSC subpopulaties te stroomlijnen, maar ook toekomstige klinische toepassingen van hBVSCs voor verschillende therapeutische doeleinden te vergemakkelijken.
Introduction
Menselijke skeletspieren wordt beschouwd als een klinisch aantrekkelijke bron van stam / progenitorcellen. Skeletspieren bevat niet alleen gepleegd myogene voorouders, skeletmyoblasten, maar ook primitieve myogene stamcellen, met inbegrip van satelliet-cellen en-spier-afgeleide stamcellen (MDSCs) 1. Het gebruik van menselijke spier afgeleide stam / progenitorcellen, autologe of allogene, in regeneratieve geneesmiddel is uitgebreid onderzocht in preklinische diermodellen en klinische proeven. De regeneratieve toepassingen spier stam / progenitorcellen variëren van regenereren dystrofische spier in Duchenne spierdystrofie (DMD) patiënten herstel van de gewonde hart bij patiënten met een hartaanval.
Sinds de ontdekking van mesenchymale stam / stromale cellen (MSC's) en andere multipotente precursor celpopulaties, waaronder beenmerg afgeleide multipotente adulte progenitorcellen (MAPCs) en adipose afgeleide stamcellen (ADSCs), volwassen stamcellen /voorlopercellen cellen zijn uitgebreid onderzocht date 1-9. Niettemin hebben hun eigen identiteit en vestiging in situ overschaduwd door de retrospectieve isolatiewerkwijzen. Onlangs, met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), wij en andere groepen prospectief geïdentificeerd en gezuiverd drie multipotent precursor celpopulaties van bloedvaten in menselijke skeletspier en diverse andere organen: myogene endotheelcellen (MEC), pericyten (PC), en adventitia cellen (AC's) 10. Deze drie subpopulaties van humane bloedvatgeassocieerde afgeleide stamcellen (hBVSCs) respectievelijk worden in de drie structurele lagen van bloedvaten: tunica intima, tunica media en de tunica adventitia. Meer specifiek, MEC's en pc's zijn gedetecteerd in bloedvaten en haarvaten en ACS zijn gelokaliseerd in de adventitia laag van grotere slagaders en aders. Elke precursor cel subsets drukt een unieke combinatie van celoppervlak antigenen: MEC (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), en de ACS (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
Verdere karakterisatie van deze hBVSC subsets bleek dat alle drie precursor celpopulaties bezitten mesodermale ontwikkelingsstoornissen potentialen Soortgelijke typische MSCs, zoals skelet myogenesis, osteogenese, chondrogenese en adipogenese. Alle hBVSC subsets vertonen ook klassieke MSC markers, zoals CD44, CD73, CD90 en CD105, vers en in de cultuur. Gezamenlijk deze bewijsstukken ondersteunde de vasculaire oorsprong van MSC's. Bovendien is de therapeutische mogelijkheden van MEC's, PC's en ACs onlangs aangetoond in afzonderlijke studies. MEC's gesorteerd van de volwassen menselijke spier biopsieën werden getoond van de benadeelden en dystrofische skeletspieren en reparatie gewond hartspier efficiënter dan skeletmyoblasten en vasculaire endo regenererenthelial cellen (EC's). Gezuiverde PCs van verschillende menselijke organen bleken ook te repareren / regenereren gewonde en dystrofische skeletspieren en tot de satelliet celpool 13-16. Zeer recent hebben we aangetoond dat de pc's zijn afgeleid van de menselijke skeletspier effectief repareren het infarct hartspier via indirecte paracrien effect en directe cellulaire interacties 17. ACs, anderzijds, zijn hetzij rechtstreeks geïsoleerd uit geëxplanteerde bloedvaten of gezuiverd door FACS uit menselijk vetweefsel en skeletspier. Een opvallende pro-angiogene werking van ACS werd aangetoond in een muis achterpoot ischemie model 19. Bovendien zijn ACs ook aangetoond infarct myocardium bij conventionele MSCs herstellen en geeft de robuuste therapeutisch potentieel van ACS in ischemisch weefselherstel 20.
De huidige zuivering protocol subsidies gelijktijdige, prospectieve zuivering van MEC's, pc's, enACs van de vasculatuur van een menselijke skeletspier biopsie. Dit stelt ons in staat om te studeren en / of kies de optimale hBVSC subpopulatie voor verschillende therapeutische doeleinden. Bovendien, deze nieuwe techniek breidt het repertoire van stam / progenitorcellen die kunnen worden afgeleid uit humane skeletspier, waardoor het een ideale bron van multipotente precursorcellen regeneratieve geneeskunde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificatie en zuivering van hBVSC subpopulaties vertegenwoordigen een belangrijke stap vooruit in het begrijpen van MSC ontogenie. Er is steeds meer bewijs met vermelding van het perivasculaire herkomst van MSC en de associatie tussen weefsel-specifieke voorloper cellen en bloedvaten 22-25. Bovendien, het vermogen om homogene subpopulaties hBVSCs verder helpt het begrip van MSC heterogeniteit en vasculaire celbiologie 26 isoleren.
In de afgelopen jaren hebben MEC'…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Alison Logar bedanken voor haar uitstekende technische bijstand met flowcytometrie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (JH), de Henry J. Mankin leerstoel (JH), en het ministerie van Onderwijs en Wetenschappen van de Republiek Kazachstan (AS). CWC werd mede ondersteund door de American Heart Association predoctorale fellowship (11PRE7490001). M.Corselli werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine training subsidie (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
