Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano
Summary
Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.
Abstract
Desde a descoberta do tronco mesenquimais / células do estroma (CTM), a identidade nativa e localização de MSCs foram obscurecidos por seu isolamento retrospectiva na cultura. Recentemente, usando classificação de células activada por fluorescência (FACS), e que outros investigadores prospectivamente identificada e purificada três subpopulações de células precursoras pluripotentes associados à vasculatura do músculo esquelético humano. Estes três populações de células: células endoteliais miogênica (SAMU), pericitos (PCs) e células adventícias (SCA), estão localizadas, respectivamente, para as três camadas estruturais dos vasos sanguíneos: íntima, média e adventícia. Todas estas células-tronco derivadas de sangue-embarcação humana (hBVSC) populações não só expressam marcadores MSC clássicos, mas também possuem potenciais de desenvolvimento mesodérmicas semelhantes a MSCs típicas. Anteriormente, SAMU, PCs e ACs foram isolados através de protocolos distintos e, posteriormente caracterizada em estudos separados. A corrente de prot isolamentoocol, através de modificações no processo de isolamento e ajustes nos marcadores de superfície celular seletivos, nos permite purificar simultaneamente todas as três subpopulações hBVSC por FACS de uma única biópsia muscular humana. Este novo método não só irá agilizar o isolamento de várias subpopulações BVSC, mas também facilitar futuras aplicações clínicas de hBVSCs para fins terapêuticos distintos.
Introduction
Músculo-esquelético humano tem sido considerada uma fonte clinicamente atraente de células tronco / progenitoras. O músculo esquelético contém não só cometeu progenitores miogênicos, mioblastos esqueléticos, mas também células-tronco miogênicas primitivos, incluindo células satélites e células-tronco derivadas de músculos (MDSCs) 1. O uso de células humanas derivadas de músculos tronco / progenitoras, autólogo ou alogênico, em medicina regenerativa tem sido extensivamente estudada em modelos animais pré-clínicos e clínicos. As aplicações de regeneração de células musculares tronco / progenitoras variam de regenerar o músculo distrófico na distrofia muscular de Duchenne (DMD) para reparar o coração ferido em pacientes com ataque cardíaco.
Desde a descoberta da estaminais mesenquimais / células do estroma (MSCs) e outras populações de células multipotentes precursora, incluindo as células de osso derivadas de medula multipotentes progenitoras adultas (MAPCs) e células estaminais derivadas de tecido adiposo (ADSCs), estaminais adultas /células progenitoras têm sido amplamente estudados até o momento 1-9. No entanto, a sua identidade nativa e localização in situ foram obscurecidos pelos métodos de isolamento retrospectivos. Recentemente, utilizando células ativadas por fluorescência (FACS), nós e outros grupos identificados prospectivamente e três populações de células multipotentes precursor purificados de vasos sanguíneos dentro do músculo esquelético humano e vários outros órgãos: células endoteliais miogênica (SAMU), pericitos (PCs), e células adventícias (ACs) 10. Estes três subpopulações de células estaminais do sangue humanas derivadas de vasos (hBVSCs) podem ser encontradas, respectivamente, nas três camadas estruturais dos vasos sanguíneos: íntima, túnica, e túnica adventícia. Mais especificamente, MECs e PCs são detectados em microvasos e capilares enquanto ACs estão localizadas na camada adventícia de artérias e veias maiores. Cada subconjunto de células precursoras expressa uma única combinação de antigénios da superfície celular: CME (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PCs (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), e ACs (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
A caracterização desses subconjuntos hBVSC revelou que as três populações de células precursor possuem potenciais de desenvolvimento mesodérmicas semelhantes a MSCs típicos, incluindo tecido muscular esquelético, osteogênese, chondrogenesis e adipogênese. Todos os subconjuntos hBVSC também exibem marcadores MSC clássicos, incluindo CD44, CD73, CD90 e CD105, na hora e na cultura. Coletivamente, esses elementos de prova apoiou a origem vascular de MSCs. Além disso, as capacidades terapêuticas de MECs, PCs e ACs recentemente têm sido demonstradas em estudos separados. MECs ordenados a partir de biópsias musculares humanos adultos foram mostrados para regenerar os músculos feridos e distróficos esqueléticos e reparação feridos miocárdio de forma mais eficiente do que os mioblastos esqueléticos e endo vascularcélulas Thelial (ECS). PCs purificada a partir de diferentes órgãos humanos também foram mostrados para reparar / regenerar músculos esqueléticos feridos e distróficos e contribuir para o pool de células satélite 13-16. Muito recentemente, demonstramos que PCs derivadas de músculo esquelético humano efetivamente reparar o miocárdio infartado por efeito parácrino indireta e interações celulares diretos 17. ACs, por outro lado, têm sido isolados, quer directamente a partir de vasos sanguíneos ou explantados purificado por FACS a partir de tecido adiposo humano e de músculo esquelético. Um efeito pró-angiogênico notável de ACs foi demonstrada em um mouse traseira de membros modelo de isquemia 19. Além disso, ACS também têm sido mostrados para reparar o miocárdio mais eficientemente do que as MSCs convencionais, indicando o potencial terapêutico de ACs robusta na reparação do tecido isquémico 20.
As atuais concessões protocolo de purificação simultâneas, purificação prospectivo de SAMU, PCs eACs a partir da vasculatura de um único biópsia do músculo esquelético humano. Isso nos permite estudar e / ou escolher a subpopulação hBVSC ideal para fins terapêuticos distintos. Além disso, esta nova técnica amplia ainda mais o repertório de células tronco / progenitoras que podem ser derivadas de músculo esquelético humano, tornando-se uma fonte ideal de células precursoras multipotentes para a medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificação e purificação de subpopulações hBVSC representam um grande avanço na compreensão da MSC ontogenia. Há evidências crescentes, indicando a origem perivascular de MSCs ea associação entre células precursoras de tecidos específicos e vasos sanguíneos 22-25. Além disso, a capacidade para isolar sub-populações homogéneas de hBVSCs auxilia ainda mais a compreensão do MSC heterogeneidade e biologia celular vascular 26.
Nos últimos anos, MECs, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Alison Logar por sua assistência técnica de excelência com a citometria de fluxo. Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Defesa (JH), a Henry J. Mankin cadeira dotada (JH), e do Ministério da Educação e Ciência da República do Cazaquistão (AS). CWC foi apoiado em parte pela irmandade predoctoral American Heart Association (11PRE7490001). M.Corselli foi apoiado pelo California Institute for Regenerative Medicine bolsa de formação (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
