בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם
Summary
כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.
Abstract
מאז הגילוי של תאי גזע mesenchymal / סטרומה (MSCs), הזהות והלוקליזציה של MSCs ילידים טושטשו על ידי הבידוד רטרוספקטיבית שלהם בתרבות. לאחרונה, באמצעות מיון הקרינה המופעל תא (FACS), אנחנו וחוקרים אחרים מכאן ולהבא מזוהים ומטוהרים שלוש אוכלוסיות של תאי מבשר multipotent הקשורים לכלי הדם של שריר שלד אנושי. שלוש אוכלוסיות אלה תא: תאי myogenic אנדותל (MECs), pericytes (מחשבים), ותאי adventitial (ACS), הם מקומיים בהתאמה לשלוש שכבות המבניות של כלי דם: אינטימה, מדיה, וadventitia. כל תא אלה האדם נגזר כלי דם הגזע (hBVSC) אוכלוסיות לא רק להביע את סמני MSC קלאסיים אבל גם בעלי פוטנציאל התפתחותי mesodermal דומה לMSCs הטיפוסי. בעבר, היו מבודדים MECs, מחשבים, ומזגנים באמצעות פרוטוקולים שונים ומאופיין לאחר מכן במחקרים נפרדים. Prot הבידוד הנוכחיocol, באמצעות שינויים לתהליך הבידוד והתאמות בסמנים פני תא בררניים, מאפשר לנו לטהר בו זמנית בכל שלוש hBVSC האוכלוסיות ידי FACS מביופסיה של שריר אנושי אחת. שיטה חדשה זה לא רק לייעל את הבידוד של אוכלוסיות BVSc מרובות, אלא גם להקל על יישומים קליניים עתידיים של hBVSCs למטרות טיפוליות שונות.
Introduction
שרירי שלד אנושיים כבר נחשב מקור קליני אטרקטיבי של תאי גזע / אב. שרירי שלד מכיל לא ביצעו רק אבות myogenic, myoblasts שלד, אלא גם תאי גזע myogenic פרימיטיביים, כוללים תאי לווין ותאי שמקורם בשרירי גזע (MDSCs) 1. השימוש בתאים אנושיים שמקורם בשרירי גזע / אב, אוטולוגי או אלוגנאית, ברפואת רגנרטיבית נחקר בהרחבה במודלים של בעלי חיים טרום קליניים וניסויים קליניים. יישומי ההתחדשות של תאי גזע / אב שריר נעים בין התחדשות שריר dystrophic בניוון השרירים דושן חולים (DMD) לתיקון הלב הפגוע בחולים עם התקף לב.
מאז גילויו של גזע תאי mesenchymal / סטרומה (MSCs) ואוכלוסיות תאי מבשר multipotent אחרות, כוללים תאי עצם המופק ממח multipotent אב המבוגר (MAPCs) ותאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs), גזע בוגרים /תאי אב נחקרו בהרחבה עד כה 1-9. עם זאת, זהותם ילידים ולוקליזציה באתר טושטשו על ידי שיטות בידוד למפרע. לאחרונה, באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS), אנו וקבוצות אחרות מכאן ולהבא מזוהים ושלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent מטוהרים מכלי דם בתוך שרירי שלד אנושיים וכמה איברים אחרים: תאי האנדותל myogenic (MECs), pericytes (מחשבים), ותאי adventitial (ACS) 10. ניתן למצוא שלוש תת אוכלוסיות אלו של תאים אנושיים דם המופק מכלי גזע (hBVSCs) בהתאמה בשלוש שכבות המבניות של כלי דם: אינטימה Tunica, תקשורת Tunica, וadventitia Tunica. באופן ספציפי יותר, MECs ומחשבים מזוהים בmicrovessels ונימים תוך מזגנים מותאמים לשפה מקומיים בשכבת adventitia של עורקים וורידים גדולים יותר. כל תת תא מבשר מבטא שילוב ייחודי של אנטיגנים פני תא: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), מחשבים (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), והמזגנים (CD34 + / 31 ב– / 45 – / 56 – / 146 -).
אפיון נוסף של תת hBVSC אלה גילה כי כל שלוש אוכלוסיות תאי מבשר יש פוטנציאל ההתפתחותי mesodermal דומה לMSCs הטיפוסי, כולל myogenesis שלד, osteogenesis, chondrogenesis, וadipogenesis. כל תת hBVSC גם תערוכת סמני MSC קלאסיים, כולל CD44, CD73, CD90, וCD105, טרי ובתרבות. באופן קולקטיבי חתיכות של ראיות אלה תמכו במוצא כלי הדם של MSCs. יתר על כן, היכולות הטיפוליות של MECs, מחשבים, ומזגנים לאחרונה הודגמו במחקרים נפרדים. MECs מסודרים מביופסיות שריר אדם בוגרות הוצג להתחדש שרירים פגועים וdystrophic שלד ושריר לב תיקון נפצע בצורה יעילה יותר מאשר myoblasts השלד ואנדו וסקולריתתאי thelial (EC). מחשבים מטוהרים מאיברים אנושיים שונים גם הוכחו כדי לתקן / להתחדש שרירי שלד פצועים וdystrophic ולתרום לבריכת תא לווין 13-16. ממש לאחרונה, יש לנו הראינו כי מחשבים הנגזרים משרירי שלד אדם ביעילות לתקן את שריר לב infarcted דרך השפעה אוטוקריני עקיפה ואינטראקציות הסלולר ישירות 17. מזגנים, מצד שני, היו גם מבודד ישירות מכלי דם explanted או מטוהר על ידי FACS מרקמת שומן אנושי ושרירי שלד. השפעה פרו angiogenic בולטת של מזגנים הודגמה במודל איסכמיה האחורית גפת עכבר 19. יתר על כן, מזגנים יש גם הוכחו כדי לתקן שריר לב infarcted יעילות רבה יותר מאשר MSCs הקונבנציונלי, המציין את הפוטנציאל הטיפולי החזקה של ACS בתיקון רקמות איסכמי 20.
המענקים הנוכחיים פרוטוקול טיהור בו זמנית, הטיהור פוטנציאלי של MECs, מחשבים, ומזגנים מכלי הדם של ביופסיה של שריר בודד אנושית שלד. זה מאפשר לנו ללמוד ו / או לבחור תת אוכלוסיות hBVSC אופטימליות למטרות טיפוליות שונות. בנוסף, טכניקה חדשה זו מרחיבה את הרפרטואר של תאי גזע / אב שניתן להפיק משריר שלד אנושי, מה שהופך את המקור אידיאלי של תאי מבשר multipotent לרפואת רגנרטיבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי וטיהור של אוכלוסיות hBVSC מייצגים התקדמות משמעותית בהבנה של ontogeny MSC. יש ראיות המצביעות על הגדלת מוצא perivascular של MSCs ואת הקשר בין תאי מבשר רקמות ספציפיות וכלי דם 22-25. בנוסף, היכולת לבודד אוכלוסיות הומוגניות של hBVSCs מסייעת ההבנה של ההטרוגניות MSC ותא וכלי דם ביולוג?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לאליסון Logar לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלה עם cytometry זרימה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד ההגנה (JH), הנרי ג 'מנקין נתרמו היו"ר (JH), ומשרד החינוך והמדע של הרפובליקה של קזחסטן (AS). CWC נתמך בחלקו על ידי המענק של איגוד לב האמריקאי predoctoral (11PRE7490001). M.Corselli נתמכה על ידי המכון בקליפורניה מענק הכשרת רפואת רגנרטיבית (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
