ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Summary

ヒト骨格筋内の血管は、再生アプリケーションに最適ですいくつかの多系列前駆体集団を保有する。内膜から筋原内皮細胞、培地から周皮細胞、および外膜から外膜細胞：この分離法は、血管の三つの構造層からそれぞれ3多能性前駆細胞集団の同時精製を可能にする。

Abstract

間葉系幹/間質細胞（MSC）の発見以来、ネイティブのアイデンティティおよびMSCの局在は、培養中の彼らの回顧分離によって隠されています。最近では、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて、われわれおよび他の研究者が前向きにヒト骨格筋の血管系に関連付けられた多能性前駆細胞の三亜集団を同定および精製された。これらの3つの細胞集団：内膜、メディア、および外膜：筋原内皮細胞（のMEC）、周皮細胞（パソコン）、および外膜細胞（ACS）は、血管の3の構造層のそれぞれに局在​​している。すべてのこれらのヒト血管由来幹細胞（hBVSC）集団は古典のMSCマーカーを発現するだけでなく、典型的なのMSCに類似した中胚葉の発達ポテンシャルを有していないだけの。以前は、のMEC、PC、およびACSは別個のプロトコルを使用して単離され、その後独立した研究で特徴づけられている。現在の分離PROTocol、選択的な細胞表面マーカーの分離プロセスへの修正や調整を通じて、私たちは同時に単一のヒト筋生検からFACSによる3つのすべてのhBVSC亜集団を精製することができます。この新しい方法は、複数のBVSC亜集団の単離を効率化するだけでなく、明確な治療目的のためのhBVSCsの将来の臨床応用が容易になるだけでなく、。

Introduction

ヒト骨格筋の幹/前駆細胞の臨床的に魅力的な供給源と考えられてきた。骨格筋は、コミットされた筋原前駆細胞、骨格筋芽細胞だけでなく、衛星細胞や筋肉由来幹細胞（MDSCを^）1を含むプリミティブ筋原幹細胞だけでなく、含まれています。ヒト筋肉由来の幹/前駆細胞、自己または同種異系の使用は、再生医療において広範に前臨床動物モデルおよび臨床試験で検討されている。筋肉幹細胞/前駆細胞の再生アプリケーションは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）患者におけるジストロフィー再生筋肉から心臓発作の患者で負傷心臓を修復するまでの範囲である。

骨髄由来多能性成体前駆細胞（MAPCを）および脂肪由来幹細胞（ADSCの）、成体幹/を含む間葉系幹/間質細胞（MSC）と他の多能性前駆細胞集団の発見以来、前駆細胞は、広範囲の日付^1-9に研究されてきた。それにもかかわらず、 その場での母国のアイデンティティと局在は遡及的単離法によって隠されています。最近では、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用して、私たちは他のグループは、将来に向かって特定されてきた血液ヒト骨格筋内の血管や他のいくつかの器官から精製された3多能前駆細胞集団：筋原内皮細胞（のMEC）、周皮細胞（パソコン）、および外膜細胞^{（ACS）10。}内膜、中膜、および外膜：ヒト血液·血管由来幹細胞（hBVSCs）これらの3つの亜集団は、それぞれの血管の3の構造層で見つけることができます。 ACSは、より大きな動脈および静脈の外膜層に局在しながらより具体的には、のMECとPCは、微小血管および毛細血管で検出される。のMEC（C：各前駆細胞サブセットは、細胞表面抗原の独特な組合せを表すD34 ⁺ / 56 ⁺ / 144 ⁺ / 45 ^{– ）、}パソコン（CD146 ⁺ / 34 ^– / 45 ^– / 56 ^{– ）、}およびACS（CD34 ⁺ / 31 ^– / 45 ^– / 56 ^– / 146 ^{– ）。}

これらhBVSCサブセットのさらなる特徴付けは、すべての3つの前駆細胞集団は、骨格筋、骨、軟骨、および脂肪生成を含む典型的なMSCは、中胚葉に類似発達ポテンシャルを有することが明らかになった。すべてhBVSCサブセットはまた、CD44、CD73、CD90、およびCD105、たてや文化などの古典的なMSCのマーカーを呈する。集合的証拠のこれらの作品は、MSCの血管起源を支持した。また、のMEC、パソコン、およびACSの治療能力は、最近独立した研究で実証されている。成人の筋肉生検から選別のMECは、負傷したとジストロフィー骨格筋や修理負傷した心筋よりも効率的に骨格筋芽細胞と血管エンドを再生成することが示されたthelial細胞（EC）。異なるヒト器官から精製されたパソコンにも/修復し、損傷したとジストロフィー骨格筋を再生し、衛星細胞プール^13-16に寄与することが示されている。ごく最近、私たちはヒト骨格筋から得られたPCを効果的に間接的なパラクリン作用と直接的な細胞間相互作用¹⁷を介して梗塞心筋を修復することを実証した。 ACSは、一方で、直接外植された血管から単離されているかまたはヒト脂肪組織および骨格筋からFACSによって精製した。のACの顕著な血管新生促進効果は、マウス後肢虚血モデル¹⁹で実証された。また、ACSはまた、虚血性組織修復²⁰で、ACSの堅牢な治療の可能性を示して、より効率的に、従来のMSCより梗塞心筋を修復することが示されている。

同時現在の精製プロトコルの助成金、のMECの将来の精製、PC、および単一のヒト骨格筋生検の血管系からのAC。これは、私たちは勉強し、および/または個別の治療目的のための最適なhBVSC亜集団を選択することができます。さらに、この新しい手法は、更に、その再生医療のための多能性前駆細胞の理想的な供給源作り、ヒト骨格筋に由来することができる幹細胞/前駆細胞のレパートリーを拡大する。

Protocol

1筋生検の処理ダルベッコ改変イーグル培地、5％ウシ胎児血清（FBS）を補足し（DMEM）中で、氷上で、ヒト骨格筋生検を維持する1％ペニシリン – ストレプトマイシン輸送時（P / S）。 筋生検の受領後、輸送容器から検体を除去し、無菌条件下で、2％抗生物質 – 抗真菌溶液（A / A）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で二回洗浄する。 2％A / Aを添加したDMEM中の無菌の?…

Representative Results

FACSパラメータは、最初の未染色対照、陰性対照、及び単色陽性対照から得られたデータに基づいて補正される。死細胞を除外した後、蛍光標識された細胞懸濁液は、負および正の細胞表面マーカーの一連の選択に供される。まず、CD45 +細胞は、CD56 +前にゲートされており、CD56 -フラクション-細胞がCD45から分離される。 CD56 +画分は、さらに、CD34-CD144…

Discussion

hBVSC亜集団の同定および精製は、MSC個体発生の理解における大きな進歩を表している。 MSCの血管周囲起源および組織特異的前駆細胞および血管^22-25の間の関連性を示す証拠が増えている。また、hBVSCsの均質な亜集団を単離するための能力は、さらに、MSCの不均一性および血管細胞生物学²⁶の理解を助ける。

過去数年間で、のMEC、PC、およびACSは、個別に独…

Materials

Collagenase Type 1	Sigma	C5894	Sterile vial
Collagenase Type 2	Sigma	C1764	Sterile vial
Collagenase Type 4	Sigma	C1889	Sterile vial
Anti-human CD34 APC	BD Pharmingen	555824	Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
Anti-human CD144 PE	Beckman Coulter	A07481	Keep sterile
Anti-human CD146 FITC	AbD Serotec	MCA2141F	Keep sterile
FACSAria II Flow Cytometer	Becton-Dickinson
EGM-2 Complete Medium	Lonza	CC-3162	For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate	Invitrogen	11965	For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate	Invitrogen	11995	For culturing MECs and ACs
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated horse serum	Invitrogen	26050-088
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Invitrogen	15240-062
Trypsin-EDTA 0.5%(10X)	Invitrogen	15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium	Invitrogen	14190-250
Chick embryo extract	Accurate Chemical	CE650T-10	Filter before use