Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel
Summary
Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.
Abstract
Seit der Entdeckung von mesenchymalen Stammzellen / Stromazellen (MSCs), haben die einheimische Identität und Lokalisation von MSCs durch ihre Retrospektive Isolation in Kultur verdeckt worden. Kürzlich wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), haben wir und andere Forscher prospektiv identifiziert und gereinigt drei Subpopulationen von multipotenten Vorläuferzellen mit dem Gefäßsystem des menschlichen Skelettmuskel verbunden. Diese drei Zellpopulationen: Intima, Media und Adventitia: myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PCs) und Adventitia-Zellen (ACS), sind jeweils mit den drei Strukturschichten von Blutgefäßen lokalisiert. Alle diese menschliche Blutgefäßstammzellen (hBVSC) Populationen nicht nur klassische MSC Marker auszudrücken, sondern auch Entwicklungspotenziale mesodermalen ähnlich typischen MSCs besitzen. Bisher haben MEC, PCs und ACs durch verschiedene Protokolle isoliert und anschließend in separaten Studien aus. Die aktuelle Isolations ProtOcol, durch Änderungen an der Isolierungsverfahren und Anpassungen in den selektiven Zelloberflächenmarker, ermöglicht es uns, gleichzeitig reinigen alle drei Subpopulationen hBVSC durch FACS aus einer menschlichen Muskelbiopsie. Dieses neue Verfahren wird nicht nur rationalisieren die Isolierung von mehreren BVSC Subpopulationen sondern erleichtern auch die zukünftige klinische Anwendungen der hBVSCs für verschiedene therapeutische Zwecke.
Introduction
Menschlichen Skelettmuskel wurde als klinisch attraktive Quelle für Stammzellen / Vorläuferzellen. Skelettmuskulatur enthält nicht nur verpflichtet myogenen Vorläuferzellen, Skelett-Myoblasten, aber auch primitive myogenen Stammzellen, einschließlich Satellitenzellen und Muskelstammzellen (MDSCs) 1. Die Verwendung von menschlichen Muskel-abgeleitete Stammzellen / Vorläuferzellen, autologen oder allogenen, in der regenerativen Medizin ist weitgehend in präklinischen Tiermodellen und klinischen Studien untersucht. Die regenerative Anwendungen von Muskelstammzellen / Vorläuferzellen reichen von Regeneration des dystrophischen Muskel in Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) Patienten auf die Reparatur des verletzten Herzens bei Patienten mit Herzinfarkt.
Seit der Entdeckung von mesenchymalen Stammzellen / Stromazellen (MSCs) und anderen multiVorläuferZellPopulationen, einschließlich Knochenmark stammenden multipotente adulte Vorläuferzellen (MAPCs) und Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), adulte Stammzellen /Vorläuferzellen sind umfassend auf den neuesten Stand 1-9 untersucht. Dennoch haben ihre Mutter Identität und Lokalisation in situ durch die Retrospektive Isolationsverfahren verdunkelt. Kürzlich wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), haben wir und andere Gruppen haben prospektiv identifiziert und gereinigt drei multiVorläuferZellPopulationen aus den Blutgefäßen im menschlichen Skelettmuskel und verschiedene andere Organe: myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PCs), und Adventitia-Zellen (ACS) 10. Intima, Tunica media und Adventitia: Diese drei Subpopulationen von menschlichen Blutgefäßstammzellen (hBVSCs) jeweils in den drei Strukturschichten der Blutgefäße gefunden werden. Genauer gesagt, MEC und PCs sind in Mikrogefäßen und Kapillaren nachgewiesen während ACS sind in der Adventitia Schicht von größeren Arterien und Venen lokalisiert. Jeder Vorläuferzellenteilsatz drückt eine einzigartige Kombination von Zelloberflächenantigenen: MEC (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), und ACS (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
Weitere Charakterisierung dieser hBVSC Untergruppen zeigte, dass alle drei Vorläuferzellpopulationen besitzen mesodermalen Entwicklungspotentiale ähnlich typischen MSCs, einschließlich Skelett myogenesis, Osteogenesis, Chondrogenese und Adipogenese. Alle hBVSC Teilmengen weisen auch klassische MSC Marker, einschließlich CD44, CD73, CD90, CD105 und frisch und in der Kultur. Gemeinsam diese Beweisstücke unterstützte die vaskulären Ursprungs von MSCs. Darüber hinaus haben die therapeutischen Kapazitäten von MEC, PCs, und ACS kürzlich in verschiedenen Studien nachgewiesen. MEC aus erwachsenen menschlichen Muskelbiopsien sortiert wurden gezeigt, um verletzte und dystrophischen Skelettmuskeln und Reparatur verletzt Myokard effizienter als Skelettmyoblasten und Gefäß endo regenerierenthelial Zellen (ECs). Gereinigten PCs aus verschiedenen menschlichen Organen haben auch gezeigt, um zu reparieren / regenerieren verletzten und dystrophischen Skelettmuskulatur und zur Satelliten-Zellpool 13-16. Erst vor kurzem haben wir gezeigt, dass PCs aus menschlichen Skelettmuskel abgeleitet das Myokard durch indirekte und direkte parakrine Wirkung zellulären Interaktionen 17 effektiv zu reparieren. ACs, auf der anderen Seite, entweder direkt aus explantierten Blutgefäße oder durch FACS isoliert aus humanem Fettgewebe und Skelettmuskel gereinigt. Eine bemerkenswerte pro-angiogene Wirkung von ACS wurde in einem Maus-Hinter Extremitäten-Ischämie-Modell 19 demonstriert. Weiterhin haben ACs auch gezeigt, Myokard effizienter als herkömmliche MSCs reparieren, was die stabile therapeutische Potenzial von ACS in ischämischen Gewebereparatur 20.
Die aktuellen Reinigungsprotokoll Zuschüsse gleichzeitige, Interessenten Reinigung von MEC, PCs undACs aus dem Gefäßsystem eines einzelnen menschlichen Skelettmuskelbiopsie. Dies ermöglicht es uns, zu studieren und / oder wählen Sie die optimale hBVSC Subpopulation für verschiedene therapeutische Zwecke. Darüber hinaus bietet diese neue Technik erweitert das Repertoire von Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus menschlichem Skelettmuskel abgeleitet werden kann, so dass es eine ideale Quelle für multipotente Vorläuferzellen für die regenerative Medizin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifizierung und Reinigung von hBVSC Subpopulationen stellen einen wesentlichen Fortschritt in das Verständnis der MSC Ontogenese. Es gibt zunehmend Hinweise, die den Ursprung der perivaskulären MSCs und die Verbindung zwischen Gewebe-spezifischen Vorläuferzellen und Blutgefäße 22-25. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, homogene Subpopulationen von hBVSCs weiter hilft dem Verständnis der MSC Heterogenität und Vaskuläre Zellbiologie 26 zu isolieren.
In den ver…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich Alison Logar für ihre hervorragende technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie bedanken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (JH), der Henry J. Mankin Stiftungslehrstuhl (JH) und des Ministeriums für Bildung und Wissenschaft der Republik Kasachstan (AS) unterstützt. CWC wurde zum Teil von der American Heart Association Promotionsstipendium (11PRE7490001) unterstützt. M.Corselli wurde von der California Institute for Regenerative Medicine Ausbildungsförderung (TG2-01169) unterstützt.
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
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