Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano
Summary
Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.
Abstract
Desde el descubrimiento de las células madre / estromales mesenquimales (MSC), la identidad nativa y la localización de las MSCs han sido oscurecida por su aislamiento retrospectiva en cultivo. Recientemente, utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), nosotros y otros investigadores identificaron prospectivamente y purificado tres subpoblaciones de células precursoras multipotentes asociados con la vasculatura del músculo esquelético humano. Estas tres poblaciones de células: células endoteliales miogénicos (MEC), pericitos (PC), y células adventicias (ACS), se localizan, respectivamente, a las tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: íntima, media y adventicia. Todas estas células madre derivadas de la sangre-vaso humano (hBVSC) poblaciones no sólo expresan marcadores MSC clásicos pero también poseen potencialidades del desarrollo mesodérmico similares a las MSC típicos. Anteriormente, MEC, PC y CCAA se han aislado a través de protocolos distintos y posteriormente caracterizado en estudios separados. El prot actual aislamientoOcol, a través de modificaciones en el proceso de aislamiento y ajustes en los marcadores de superficie celular selectiva, nos permite purificar simultáneamente las tres subpoblaciones hBVSC por FACS de una biopsia de músculo humano individual. Este nuevo método no sólo agilizará el aislamiento de varias subpoblaciones BVSC sino también facilitar futuras aplicaciones clínicas de hBVSCs con fines terapéuticos distintos.
Introduction
Músculo esquelético humano se ha considerado una fuente clínicamente atractiva de células madre / progenitoras. El músculo esquelético no sólo contiene comprometido progenitores miogénicas, mioblastos esqueléticos, sino también las células madre primitivas miogénicas, incluyendo células satélite y células madre derivadas de músculo (MDSC) 1. El uso de células humanas derivadas de músculo madre / progenitoras, autólogo o alogénico, en medicina regenerativa se ha investigado extensamente en modelos animales preclínicos y ensayos clínicos. Las aplicaciones de regeneración de músculo células madre / progenitoras van desde la regeneración del músculo distrófico en distrofia muscular de Duchenne (DMD) para reparar el corazón dañado en pacientes con ataque al corazón.
Desde el descubrimiento de las células mesenquimales / madre del estroma (MSC) y otras poblaciones de células precursoras multipotentes, incluyendo células óseas derivadas de médula progenitoras adultas multipotentes (MAPC) y células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC), madre adultas /células progenitoras han sido ampliamente investigado hasta la fecha 1-9. No obstante, su identidad y localización nativa in situ han sido oscurecida por los métodos de aislamiento retrospectivos. Recientemente, el uso de células activadas por fluorescencia (FACS), nosotros y otros grupos han identificado de forma prospectiva y tres poblaciones de células precursoras multipotentes purificados de los vasos sanguíneos dentro del músculo esquelético humano y otros órganos: células endoteliales miogénicos (MEC), los pericitos (PCs), y células adventicias (CCAA) 10. Estas tres subpoblaciones de células madre humanas de los vasos sanguíneos derivados (hBVSCs) se pueden encontrar respectivamente en las tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: túnica íntima, túnica media y adventicia. Más específicamente, MEC y PCs se detectan en los microvasos y capilares, mientras que ACS se localizan en la capa adventicia de las arterias y venas más grandes. Cada subconjunto de células precursoras expresa una combinación única de antígenos de superficie celular: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), y ACS (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
Además de la caracterización de estos subconjuntos hBVSC reveló que las tres poblaciones de células precursoras mesodérmicas poseen potenciales de desarrollo similares a las MSC típicas, incluyendo la miogénesis esquelético, osteogénesis, condrogénesis, y la adipogénesis. Todos los subgrupos hBVSC también exhiben marcadores MSC clásicos, como CD44, CD73, CD90, CD105 y, recientemente y en la cultura. En conjunto, estas piezas de evidencia apoyan el origen vascular de las CMM. Por otra parte, las capacidades terapéuticas de MEC, PC y CCAA recientemente se han demostrado en estudios separados. MEC ordenados a partir de biopsias musculares humanos adultos, se mostró a regenerar los músculos lesionados y distróficas esqueléticos y reparación heridos miocardio más eficiente que los mioblastos esqueléticos y endo vascularcélulas telial (ECS). PC purificada a partir de diferentes órganos humanos también se han demostrado para reparar / regenerar los músculos esqueléticos lesionados y distróficas y contribuir a la piscina de células satélite 13-16. Muy recientemente, hemos demostrado que los PC derivadas de músculo esquelético humano reparar eficazmente el miocardio infartado a través del efecto paracrino indirecta y las interacciones celulares directos 17. CCAA, por otro lado, han sido ya sea directamente aisladas de vasos sanguíneos explantados o purificados por FACS a partir de tejido adiposo humano y músculo esquelético. Un efecto pro-angiogénico notable de las CCAA se demostró en un miembro trasero modelo de isquemia del ratón 19. Además, ACS también se ha demostrado que la reparación del miocardio infartado más eficientemente que las MSC convencionales, lo que indica el potencial terapéutico robusta de SCA en la reparación de tejido isquémico 20.
Las actuales subvenciones del protocolo de purificación simultánea, purificación prospectivo de MEC, PCs, yCCAA de la vasculatura de una biopsia de músculo esquelético humano individual. Esto nos permite estudiar y / o elegimos la subpoblación hBVSC óptimo para fines terapéuticos distintos. Además, esta nueva técnica se expande aún más el repertorio de células madre / progenitoras que se pueden derivar a partir de músculo esquelético humano, por lo que es una fuente ideal de células precursoras multipotentes para la medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificación y purificación de subpoblaciones hBVSC representan un avance importante en la comprensión de la ontogenia MSC. Cada vez hay más pruebas que indican el origen perivascular de MSC y la asociación entre las células precursoras específicas de tejido y los vasos sanguíneos 22-25. Además, la capacidad para aislar subpoblaciones homogéneas de hBVSCs SIDA aún más la comprensión de MSC heterogeneidad y la biología celular vascular 26.
En los últimos…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Alison Logar por su excelente asistencia técnica con la citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Departamento de Defensa (JH), la Cátedra J. Mankin Henry (JH), y el Ministerio de Educación y Ciencia de la República de Kazajstán (AS). CWC fue financiada en parte por la beca predoctoral Asociación Americana del Corazón (11PRE7490001). M.Corselli fue apoyado por el Instituto de California para la beca de formación de Medicina Regenerativa (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
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