İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu
Summary
Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.
Abstract
Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH) keşfinden beri, yerli kimliği ve MKH'lerin yerelleştirme kültürü retrospektif izolasyon örtülü durumdadır. Son zamanlarda, floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanılmasıyla, ve diğer araştırmacılar, ileriye dönük, insan iskelet kası ve damar sistemi ile bağlantılı multipotent öncü hücrelerinin üç alt-popülasyonunu tespit ve saflaştırıldı. Bu üç hücre popülasyonları: intima, media ve adventisya: Miyojenik endotel hücreleri (MECler), perisitler (PC'ler) ve adventisyal hücreleri (ACs), kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla lokalize. Bu insan kan-damar kaynaklı kök hücre (hBVSC) Tüm klasik MSC işaretleri ifade ama aynı zamanda tipik MSC'Iere benzer mezodermal gelişim potansiyelleri sahip nüfusun, sadece. Daha önce, MECler, PC'ler ve Klimalar farklı protokoller yoluyla izole edilmiştir ve daha sonra ayrı çalışmada karakterize. Geçerli izolasyon protocol, seçici hücre yüzey belirteçleri içinde izolasyon sürecine değişiklikler ve ayarlamalar yaparak, bize aynı anda tek bir insan kas biyopsisi ile FACS tarafından üç hBVSC subpopülasyonunun arındırmak için izin verir. Bu yeni yöntem, sadece birden BVSC alt popülasyonlarının izolasyonu düzene değil, aynı zamanda farklı tedavi amaçlı hBVSCs gelecekte klinik uygulamalarını kolaylaştırmak değil.
Introduction
Insan iskelet kası kök / projenitör hücrelerin klinik cazip bir kaynak olarak kabul edilmiştir. İskelet kası sadece uydu hücreleri ve kas elde edilen kök hücreler (MDSCs) 1 olmak üzere miyogenik atalarıdır, iskelet miyoblastları, aynı zamanda ilkel miyogenik kök hücreleri, taahhüt değil içerir. Rejeneratif tıpta insan kas türetilmiş kök / projenitör hücrelerinin otolog veya allojenik, geniş kullanım alanı, klinik öncesi hayvan modellerinde hem de klinik çalışmalarda araştırılmıştır. Kas kök / progenitör hücrelerin rejeneratif uygulamaları kalp krizi hastalarında yaralı kalbi tamir etmek Duchenne müsküler distrofi (DMD) hastalarda distrofik kas yenileyici arasında değişir.
Kemik iliğinden elde edilen multipotent yetişkin projenitör hücreler (MAPCs) ve yağ elde edilen kök hücreleri (ADSCs), yetişkin kök / dahil olmak üzere mezenşimal kök / stromal hücreleri (MSC'ler) ve diğer multipotent öncü hücre popülasyonlarının keşfinden beriprogenitör hücreler yoğun tarihinden 1-9 kadar incelenmiştir. Bununla birlikte, yerinde onların yerli kimliği ve yerelleştirme retrospektif izolasyon yöntemleri örtülü durumdadır. Son zamanlarda, sıralama floresan-aktive edilmiş hücre (FACS) kullanılmasıyla, ve diğer gruplar tanımlanır ve ileriye dönük olan kan, insan iskelet kası içindeki gemiler ve çok sayıda başka organlardan izole edilebilen saf hale multipotent öncü hücre popülasyonları: kas kaynaklı endotel hücreleri (MECler), perisitlerin (PC), ve adventisyal hücreleri (Klimalar) 10. Intima tabakasında, tunika medya ve tunika adventitianın: insan kan damarı türetilmiş kök hücreler (hBVSCs) Bu üç alt-popülasyonları bulunduğunu sırasıyla kan damarlarının üç yapısal tabakalar bulunabilir. Klimalar geniş arter ve venlerin adventita tabakasında lokalize ise daha spesifik, MECler ve PC'ler kılcal kılcal tespit edilir. (C MECS: Her öncül hücre alt hücre yüzey antijenleri benzersiz bir bileşimini ifadeD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC'ler (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -) ve Klimalar (CD34 + / – 31/45 – / 56 – / 146 -).
Bu hBVSC altkümenin ileri karakterizasyonu üç öncü hücre popülasyonları iskelet Miyogenesis, osteogenezi, kondrogenez ve adipogenesis dahil tipik MKH'lerin, benzer mezodermal gelişim potansiyelleri sahip olduğunu ortaya koydu. Tüm hBVSC alt kümeler CD44, CD73, CD90 ve CD105, taze ve kültür gibi klasik MSC belirteçler, sergilerler. Topluca bu kanıt parçaları MKH'lerin damar kökeni destekledi. Ayrıca, MECS, PC'ler ve komisyonlarda, terapötik kapasiteleri son zamanlarda ayrı çalışmalarda ortaya konmuştur. Yetişkin insan kas biyopsileri sıralanır MECler yaralı ve distrofik iskelet kasları ve onarım yaralı miyokardiyumu daha verimli iskelet miyoblastları ve vasküler endo yeniden gösterildiendotel hücreleri (EC). Farklı insan organlarından saflaştırılmış PC'ler de onarım / yaralı ve distrofik iskelet kasları yeniden ve uydu hücre havuzu 13-16 katkıda gösterilmiştir. Çok yakın bir zamanda, insan iskelet kasından türetilmiş PC'ler etkin dolaylı parakrin ve direkt hücresel etkileşimler 17 vasıtasıyla miyokard enfarktüsü tamir olduğunu göstermiştir. ACS, diğer taraftan, ya da olması ile doğrudan eksplante kan damarlarından izole edilebilir veya insan adipoz doku ve iskelet kası, FACS ile saflaştırılmıştır. Komisyonlarda, dikkate değer bir pro-anjiyojenik etkisi, fare arka kol veya bacak iskemisi-19 modelinde gösterilmiştir. Ayrıca, ACS iskemik doku tamirinde 20 ACS en güçlü terapötik potansiyelini gösteren daha etkin bir şekilde geleneksel bir MSC daha miyokard enfarktüsü onarmak için gösterilmiştir.
Eşzamanlı mevcut arıtma protokolü hibe, MECler, PC'ler prospektif saflaştırılması veTek bir insan iskelet kası biyopsisi vaskulatürden ACs. Bu bize çalışma ve / veya farklı terapötik amaçlar için uygun hBVSC subpopülasyonu seçim yapmanızı sağlar. Ayrıca, bu yeni teknik, ayrıca, rejeneratif tıp için multipotent öncü hücrelerin ideal bir kaynak yapma, insan iskelet kasından elde edilebilir kök / progenitör hücrelerin repertuar genişletir.
Protocol
Representative Results
Discussion
HBVSC alt popülasyonlarının belirlenmesi ve arıtma MSC ontogenezimizin anlama büyük bir ilerlemeyi temsil. MSC perivasküler kaynağını ve dokuya özel ön-madde hücreleri ve kan damarları, 22-25 arasındaki ilişkiyi gösteren gittikçe artan kanıtlar vardır. Buna ek olarak, daha fazla kapasite MSC heterojenlik ve vasküler hücre biyolojisi 26 anlaşılmasını yardımcı hBVSCs homojen bir yapıda yapıdadır izole etmek.
Son birkaç yıl içinde, MECler,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar akış sitometri ile onu mükemmel teknik yardım için Alison Logar teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Savunma Bakanlığı (JH), Henry J. Mankin Endowed Başkanı (JH), Eğitim ve Kazakistan Cumhuriyeti Bilim Bakanlığı (AS) hibe ile desteklenmiştir. CWC Amerikan Kalp Derneği predoctoral bursu (11PRE7490001) tarafından kısmen desteklenmiştir. M.Corselli Rejeneratif Tıp eğitim bursu için California Institute (TG2-01169) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
