Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain
Summary
Les vaisseaux sanguins à l'intérieur du squelette port musculaire plusieurs populations de précurseurs multi-lignée humaine qui sont idéales pour les applications de régénération. Cette méthode permet l'isolement de purification simultanée de trois populations de cellules précurseurs pluripotentes respectivement à partir de trois couches de structure des vaisseaux sanguins: les cellules myogéniques endotheliales de l'intima, média de péricytes et les cellules de l'adventice de l'adventice.
Abstract
Depuis la découverte de cellules souches stromales / mésenchymateuses (CSM), l'identité d'origine et la localisation des cellules souches mésenchymateuses ont été obscurcies par leur isolement rétrospective en culture. Récemment, en utilisant le tri de cellules activé par fluorescence (FACS), nous et d'autres chercheurs ont identifié et purifié de façon prospective les trois sous-populations de cellules précurseurs pluripotentes associées à la vascularisation du muscle squelettique humain. Ces trois populations de cellules: les cellules endothéliales myogéniques (CEM), les péricytes (PC), et les cellules de l'adventice (ACS), sont localisés respectivement aux trois couches structurelles des vaisseaux sanguins: intima, les médias, et l'adventice. Tous ces cellules souches humaines vaisseaux sanguins dérivés (hBVSC) les populations non seulement expriment des marqueurs de MSC classiques mais possèdent également des potentiels de développement du mésoderme similaires à MSC typiques. Auparavant, CEM, PC, et les CA ont été isolés au moyen de protocoles distincts et caractérisé par la suite dans des études séparées. La prot d'isolement courantocol, grâce à des modifications au processus d'isolement et des ajustements dans les marqueurs de surface cellulaire sélectifs, nous permet de purifier simultanément les trois sous-populations hBVSC par FACS à partir d'une seule biopsie musculaire humaine. Cette nouvelle méthode permettra non seulement de simplifier l'isolement de plusieurs sous-populations de BVSC mais aussi faciliter futures applications cliniques de hBVSCs à des fins thérapeutiques distincts.
Introduction
Muscle squelettique humain a été considéré comme une source cliniquement intéressante de cellules souches / progénitrices. Le muscle squelettique contient pas seulement commis progéniteurs myogéniques myoblastes squelettiques, mais aussi des cellules souches myogéniques primitives, y compris les cellules satellites et les cellules souches dérivées du muscle (MDSC) 1. L'utilisation de cellules humaines dérivées du muscle souches / progénitrices, autologues ou allogéniques, en médecine régénérative a été étudiée dans des modèles animaux précliniques et des essais cliniques. Les applications de régénération des cellules souches / progénitrices musculaires vont de la régénération du muscle dystrophique dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) pour la réparation de patients blessés dans le cœur des patients avec crise cardiaque.
Depuis la découverte de souches de cellules mésenchymateuses / stromales (CSM) et d'autres populations de cellules précurseurs pluripotentes, comprenant des cellules de moelle osseuse dérivées multipotentes progénitrices adultes (PCMA) et les cellules souches du tissu adipeux (ADSCs), souches adultes /cellules souches ont été étudiées à ce jour 1-9. Néanmoins, leur identité et à la localisation native in situ ont été obscurcies par les méthodes d'isolement rétrospective. Récemment, en utilisant la cellule activé par fluorescence (FACS), nous et d'autres groupes avons prospectivement identifiés et trois populations de cellules précurseur multipotentes purifiés à partir de vaisseaux sanguins dans le muscle squelettique humain et plusieurs autres organes: les cellules endothéliales myogéniques (CEM), les péricytes (PC), et les cellules de l'adventice (AC) 10. Ces trois sous-populations de cellules souches vaisseaux sanguins humaines dérivées (hBVSCs) se retrouvent respectivement dans les trois couches de structure des vaisseaux sanguins: intima, la média et adventice. Plus précisément, les CEM et les PC sont détectés dans les microvaisseaux capillaires et tout AC sont localisés dans la couche de l'adventice des artères et des veines plus larges. Chaque sous-ensemble de cellules précurseurs exprime une combinaison unique d'antigènes de surface cellulaire CEM: (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), et AC (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
Une caractérisation supplémentaire de ces sous-ensembles de hBVSC a révélé que les trois populations de cellules précurseurs possèdent des potentiels de développement de cellules souches mésenchymateuses mésodermiques similaires typiques, y compris la myogenèse squelettique, l'ostéogenèse, la chondrogenèse, et l'adipogenèse. Tous les sous-ensembles hBVSC présentent également des marqueurs de MSC classiques, y compris CD44, CD73, CD90, CD105 et, fraîchement et dans la culture. Ensemble, ces éléments de preuve faveur de l'origine vasculaire des cellules souches mésenchymateuses. En outre, les capacités thérapeutiques de CEM, les PC, et les CA ont récemment été démontré dans des études séparées. CEM triés à partir de biopsies musculaires humaines adultes ont été présentés pour régénérer les muscles blessés et dystrophiques squelettiques et la réparation blessés myocarde plus efficacement que les myoblastes squelettiques et vasculaire endocellules épithélial (ECS). Ont également été montré PC purifiés provenant de différents organes humains pour réparer / régénérer les muscles squelettiques blessés et dystrophiques et de contribuer à la piscine des cellules satellites 13-16. Très récemment, nous avons démontré que les PC issus de muscle squelettique humain réparer efficacement le myocarde infarctus par effet paracrine indirecte et interactions cellulaires directes 17. CA, d'autre part, ont été directement isolé à partir de vaisseaux sanguins ou explantées purifié par FACS de tissu adipeux et le muscle squelettique humain. Un effet pro-angiogénique notable de CA a été démontrée chez la souris des membres postérieurs modèle d'ischémie 19. En outre, les CA ont également été montré pour réparer le myocarde infarci plus efficacement que les cellules souches mésenchymateuses classiques, indiquant le potentiel thérapeutique solide de CA dans la réparation de tissu ischémique 20.
Les subventions du protocole de purification courants simultanés, purification prospective de CEM, les PC, etCA de la vascularisation d'un seul squelette biopsie musculaire humaine. Cela nous permet d'étudier et / ou choisir la sous-population de hBVSC optimale à des fins thérapeutiques distincts. En outre, cette nouvelle technique élargit encore le répertoire de cellules souches / progénitrices qui peuvent être dérivées à partir de muscle squelettique humain, ce qui en fait une source de cellules précurseurs pluripotentes idéal pour la médecine régénératrice.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identification et la purification des sous-populations hBVSC représentent une avancée majeure dans la compréhension de MSC ontogenèse. Il ya des preuves croissantes indiquant l'origine périvasculaire des cellules souches mésenchymateuses et l'association entre les cellules précurseurs spécifiques de tissus et les vaisseaux sanguins 22-25. En outre, la capacité d'isoler des sous-populations homogènes de hBVSCs sida davantage la compréhension de MSC hétérogénéité et la biologie vascu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Alison Logar pour son excellente assistance technique avec la cytométrie de flux. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de la Défense (JH), la chaire J. Mankin Henry (JH), et le ministère de l'Éducation et de la Science de la République du Kazakhstan (AS). CWC a été financé en partie par la bourse pré-doctorale de l'American Heart Association (11PRE7490001). M.Corselli a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine bourse de formation (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
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