Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

Published: October 18, 2014 doi: 10.3791/51710
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

Introduction

تطبيق التيار الكهربائي إلى خلية يسبب تشكيل المسام على غشاء الخلية، من خلال عملية تسمى Electroporation لل. مسام تسمح بمرور مجموعة متنوعة من الجزيئات nonpermeant من خلال الغشاء. يمكن التحكم في المجال الكهربائي على وجه التحديد، بحيث المسام شكلت صغيرة جدا وreclose بسرعة، مع الحد الأدنى من اضطراب في الفيزيولوجيا الخلوية. ومن المثير للاهتمام، الخلايا الملتصقة يمكن زراعتها على شريحة زجاجية مغطاة موصل وشفافة أكسيد الإنديوم والقصدير (ايتو) وelectroporated في الموقع، وهذا هو على السطح حيث تنمو، دون أن يتم فصل electroporated في تعليق. خلايا يمكن أن تنمو بشكل جيد جدا على هذا السطح، وبما أنها تابعة والموسعة، الملاحظة المجهرية مفصلة ممكن. باستخدام هذه التقنية، جزيئات صغيرة nonpermeant يمكن إدخال الفور وبشكل أساسي إلى 100٪ من الخلايا، مما يجعل هذه التقنية مناسبة خاصة بالنسبة للدراسات حول تفعيل شركاتonents من مسار التالية التحفيز يجند لمستقبلات (مراجعة في 1).

وقد استخدم Electroporation للفي الغالب لإدخال الحمض النووي (وتسمى أيضا electrotransfection). ومع ذلك، يمكن Electroporation للفي الموقع أن تكون ذات قيمة لإدخال مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجزيئات، مثل الببتيدات 2-4، أليغنوكليوتيد]، مثل العقاقير RNA، المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي [أليغنوكليوتيد شرك لمنع عامل النسخ ملزمة، أو سيرنا 3،5، 6، 7-10 النيوكليوتيدات المشعة، والبروتينات 11 12 أو الموالية للمخدرات 13. بعد Electroporation لل، والخلايا هي lysed يمكن للالتحليلات الكيميائية الحيوية أو ثابتة وملطخة الأجسام المضادة.

طلاء ايتو موصل رقيقة جدا، 800-1،000Å، بحيث لا تشعر بالانزعاج نمو الخلايا بواسطة الفرق في ارتفاع السطوح اثنين، كما تنمو الخلايا عبر حافة طلاء موصل. وهذا يوفر ميزة أنه غير electrop-خلايا orated يمكن زراعتها جنبا إلى جنب مع تلك electroporated، لتكون بمثابة الضوابط. يمكن استخدام نفس النهج لفحص موصلي الفجوة والاتصال بين الخلايا (GJIC)، كما هو موضح في الفيديو.

تقاطعات الفجوة هي القنوات التي تربط الداخلية من الخلايا المجاورة 14. الفجوة موصلي والاتصال بين الخلايا تلعب دورا هاما في تشكيل الورم والانبثاث، في حين أن الجينات المسرطنة مثل SRC قمع GJIC 15،16. لدراسة GJIC صبغة الفلورسنت مثل لوسيفر الأصفر (LY) غالبا ما أدخلت الخلايا المستزرعة من خلال حقن مكروي أو كشط التحميل 17 و لوحظ انتشار الصبغة في الخلايا المجاورة مجهريا تحت إضاءة مضان. لكن هذه التقنيات دائما يسبب تلف الخلايا. وصفنا الآن تقنية حيث تزرع الخلايا على شريحة زجاجية التي وهي مغلفة جزئيا مع ايتو 18. تم تطبيق نبضة كهربائية في وجود LY (أو الأصباغ الأخرى) كاليفورنياباستخدام انتشارها في الخلايا المتزايد من جانب موصل من الشريحة، في حين صبغ الهجرة إلى الخلايا المجاورة، غير electroporated، وقد لوحظ من خلال المجهر مضان الإضاءة. لتجنب الخلايا الحساسة المزعجة التي قد تميل إلى فصل من أحادي الطبقة، جمعية صمم التي لا تتطلب إلكترود لتوضع على رأس من الخلايا لتطبيق الحالي 19 الكهربائي. يقدم هذا النهج القدرة ل quantitate GJIC في عدد كبير من الخلايا، ودون أي اضطراب يمكن كشفها لالأيض الخلوي، كما يدل على ذلك عدم وجود تأثير على طول المرحلة G1 التالية التحفيز المصل 12، وزيادة في مستويات منظمات المزارعين البروتين protooncogene (Raptis، غير منشورة) أو اثنين تحركات المرتبطة بالإجهاد الخلوي، خنزير P38 أو JNK / SAPK كيناز 1. هذا النهج جعل من الممكن فحص الارتباط بين مستويات الجين الورمي التعبير والتحول وGJIC 18، فضلا عن تأثير SRC وSTAT3 على GJIC في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما فيها الخلايا المستزرعة حديثا من عينات ورم الرئة 20-23. بالإضافة إلى ذلك، Electroporation للالموقعي مع الإعداد الذي وصفه تفتقر إلى القطب العلوي واستخدمت بنجاح لمظاهرة من إغلاق الفجوة تقاطع على التمايز adipocytic، على الرغم من التعلق الخلوي إلى الركيزة يتم تخفيض في تلك المرحلة في 19،24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. طلاء الخلايا في Electroporation للغرف

  1. في غطاء الصفحي التدفق، يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام تقنية معقمة كالمعتاد.
    ملاحظة: من المهم جدا للقضاء بواسطة الطرد المركزي كل آثار التربسين، لأنها قد تعيق انتشار الخلايا على الزجاج، وبالتالي تشكيل الملتصقة وتقاطعات الفجوة.
  2. ماصة 1 مل من تعليق خلية في غرف Electroporation للالمعقمة المتوفرة مع electroporator في الموقع (الشكل 1)، ومكان في 37 درجة مئوية، CO 2 الحاضنة.
    يمكن تحسين التصاق الخلية بواسطة طلاء على فبرونيكتين، والكولاجين، بولي يسين أو الخلية والأنسجة لاصقة (انظر الجدول المواد): ملاحظة.
  3. عندما شكلت خلايا طبقة متموجة انهم مستعدون للفحص GJIC.

2. Electroporation للإجراء

ويمكن إجراء فحص لElectroporation للGJIC خارج غطاء الصفحي التدفق،نظرا لأنه يستغرق سوى بضع دقائق. إذا كانت هناك حاجة مرات حضانة أطول لإجراء تجربة معينة، ومن ثم يمكن إجراء تماما في غطاء تدفق الصفحي. في جميع الحالات، يجب على الدوائر التي تزرع فيها الخلايا تكون عقيمة.

  1. إعداد 5 ملغ / مل حل لوسيفر الأصفر: يذاب 10 ملغ LY مسحوق (المتوفرة مع electroporator) في 2 مل خالية من الكالسيوم متوسطة النمو. للتجارب التي تتطلب مرات حضانة أطول، فلتر تعقيم الحل وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. نضح المتوسطة النمو وغسل الخلايا مع خالية من الكالسيوم المتوسطة، والحرص على عدم خدش أحادي الطبقة أو تجف الخلايا. إذا تجفف الخلايا التي عادة ما يكون نوى أكثر قتامة والتقاط LY دون Electroporation لل. وأثر هو أكثر وضوحا في منتصف الشريحة التي تتعرض أكثر إلى مسودات الهواء (الشكل 4F).
  3. مع pipettor إيبندورف، ماصة محلول الصبغة إلى الخلايا (400 ميكرولتر للغرفة بأكملها)، على حافة الغرفة، بeing الحرص على عدم لمس طبقة الخلايا.
  4. وضع غرفة في حامل المرفق مع electroporator وتطبيق نبض لقوة المناسبة (انظر مناقشة).
  5. نضح بعناية بعض من الحل LY. ويمكن إعادة استخدامها مرة ثانية للتجارب أقل أهمية.
  6. إضافة خالية من الكالسيوم DMEM تحتوي على 10٪ مصل dialysed.
  7. احتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة في الحاضنة للسماح بنقل الصبغة من خلال تقاطعات الفجوة.
    ملاحظة: إدراج مصل dialysed في هذه المرحلة تساعد إغلاق المسام.
  8. غسل الصبغة الفردية مع خالية من الكالسيوم DMEM للمراقبة الخلية الحية. بدلا من ذلك، وخلايا يمكن أن تكون ثابتة في هذه المرحلة، من خلال إضافة 4٪ فورمالدهايد إلى البئر، ثم تغسل مع PBS (الفوسفات مخزنة المالحة). في جميع الحالات يجب غسل إزالة كافة الخلفية.
    ملاحظة: في التجارب الأولية لتحديد الظروف المثلى، إذا كان الجهد منخفض جدا، فمن الممكن للسماح للخلايا التعافي في incubatoص لبضع دقائق وelectroporate نفس الشريحة للمرة الثانية، لتوفير في تكلفة الشرائح.

3. فحص مجهرية

  1. مراقبة الخلايا تحت إضاءة مضان، باستخدام مجهر مقلوب مجهزة المرشح المناسب للصبغة المستخدمة. لوسيفر الأصفر، الإثارة هو 423nm، 555nm الانبعاثات، فلتر WBV لمجهر نيكون IX70.
  2. القضاء على الآثار الغضروف المفصلي عن طريق وضع غطاء زجاجي الانزلاق على رأس البلاستيك جيدا، بعد ملئه إلى الأعلى مع السائل، لدراسة مورفولوجيا الخلايا تحت النقيض من المرحلة. لأفضل الصور، وكذلك يمكن فصل من الشريحة، وساترة وضعت على الإطار. لخلايا ثابتة، وكذلك يمكن ملء مع الجلسرين للمراقبة مجهرية، في حين أن الخلايا الحية يجب أن تكون مليئة النمو المتوسطة.
    ملاحظة: الغسل والتصوير أسهل إذا تم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد بعد نقل الصبغة (الخطوة 2.7 أعلاه). إذا كانت الخلايا لار الثابتة، ويتم القضاء على مضان من الخلايا داخل ما يقرب من 60 دقيقة وهذا يتوقف على نوع من الخلايا، والجهد وكمية LY أدخلت بينما في الخلايا الثابتة يتم الاحتفاظ مضان لعدة ساعات. ومع ذلك، يتلاشى مضان أو تبدد بعد O / N الحضانة، حتى في الخلايا الثابتة. لهذا السبب، يجب أن تؤخذ الصور قريبا بعد Electroporation لل(الشكل 2).

4. الكميات من الاتصالات بين الخلايا

  1. تصوير الخلايا مع الهدف 20X تحت مضان والنقيض من المرحلة (الشكل 3).
  2. تحديد ووضع علامة مع نجم الخلايا electroporated على الحدود مع المنطقة غير electroporated (الشكل 2، السهم، Electroporation للحافة).
  3. تحديد ووضع علامة مع نقطة خلايا الاستشعاع على الجانب غير electroporated، حيث قامت بتحويل الصبغة من خلال تقاطعات الفجوة (أرقام 3A و 3B).
  4. تقسيم العدد الكلي للالاستشعاع الخلايا على منطقة غير electroporated من قبل عدد من خلايا electroporated على طول حافة (أرقام 3A و 3B).
    ملاحظة: يتم احتساب نقل من 200 على الأقل خلايا electroporated الحدود متجاورة لكل تجربة. عدد حصل هو القيمة GJIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 كبد الفئران خلايا الظهارية T51B 22، electroporated مع LY وتصويرها تحت مضان (لوحة A و B)، أو على النقيض من المرحلة (C) الإضاءة، وبعد التثبيت والغسيل. في لوحة A، يتم وضع علامة على حافة منطقة الجزاء electroporated باللون الأحمر. التدرج من مضان على يمين الخط الأحمر يدل نقل من خلال تقاطعات الفجوة. في الشكل 3A و 3B، يظهر الكميات التواصل الفجوة موصلي: تم تحديد الخلايا عند حافة المنطقة electroporated ووضع علامة مع نجم، بينما اتسمت خلايا الصبغة حيث تحولوا مع نقطة. تظهر نسبة متوسط ​​عدد الخلايا التي الصبغة نقلها إلى، لكل خلية الحدود electroporated. في هذا المثال هناك 57 نقطة و 10 النجوم، أي GJIC = 5.7.

في C و D، ومحول الإشارات ومنشط من النسخ 3 (STAT3) تم downregulated في T51B خلايا تيhrough مستقر التعبير سيرنا مع ناقلات lentiviral، وهذا يؤدي إلى انخفاض في GJIC، كما يتضح من absense نقل 22.

الشكل 1
الرقم 1. القطب Electroporation للوالتجمع الشريحة. (A) أعلى نظرا: تزرع الخلايا على شريحة زجاجية، المغلفة مع موصل شفافة وأكسيد الإنديوم والقصدير (ايتو). والمستعبدين وغرفة بلاستيكية على الشريحة، لتشكيل وعاء للخلايا وLY. طلاء في خط مستقيم في الوسط، تشكيل أساسا قطبين محفورا بالليزر. ويستخدم السد لتحويل صعودا الحالية، وبالتالي خلق التحول الحاد في شدة المجال الكهربائي. لتوفير المناطق غير موصل، محفورا على ايتو أيضا في اثنين من المستطيلات. الحالية (الأسهم الحمراء) من مولد النبض تدفقات من كل نقطة اتصال إلى أخرى، عبر أحد الطرق السريعة الموصلة بين المستطيلات، ونشر في مباشرةأيون موازية لجدار الأوسط، ثم على السد من خلال وسيلة إلى الجانب الآخر، electroporating الخلايا في مناطق موازية لالسد. من أجل الوضوح، يتم إزالة الجزء الأمامي من الحجرة (B) الجانب الشخصي.: وتظهر الشريحة مع الخلايا المتزايد على ايتو المغلفة (الضوء الأخضر)، والمناطق العارية الزجاج محفورا. عند إضافة المتوسطة Electroporation للتحتوي LY إلى غرفة إلى مستوى أعلى من ارتفاع السد ثم مسار الكهربائي بين الأقطاب (+) و (-)، والخلايا نموا في هذا المجال، ويتم تشكيل. نلاحظ أن طبقة ايتو يظهر مع سمك مبالغ فيه من أجل الوضوح على الرغم من سماكة الفعلي (800 A) هو أقل بكثير من سمك الخلايا. (C) وتبلغ مساحة خلايا electroporated وغير electroporated يظهر الموسع. الصبغة كثيفة بالقرب من السد حيث تم electroporated جميع الخلايا ويتلاشى عبر حافة electroporated كما يضعف التركيز من خلال عدة TRANSF الفجوة مفرقالمتطلبات البيئية. وتشير السهام كبيرة اتجاه نقل صبغ من خلال تقاطعات الفجوة. لاحظ أن حجم وسمك من الخلايا مبالغ فيها عن الوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. Electroporation للمن T51B، والخلايا الظهارية كبد الفئران. تم electroporated LY T51B في كبد الفئران الخلايا الظهارية (خفيفة، 12 فولت). بعد 5 دقائق. صورت الحضانة، والخلايا تحت مضان (A، B) أو النقيض من المرحلة (C) الإضاءة. ملاحظة نقل واسعة النطاق من خلال تقاطعات الفجوة، ويتضح من التدرج من مضان، وتمتد من حافة المنطقة electroporated (الأسهم، خط أحمر في A). في نفس الوقت، لا يوجد أي ضرر مرئية للخلايا، و ق ينظر في إطار المرحلة التباين (C). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الكميات من نقل الفجوة مفرق. وتميزت الخلايا عند حافة المنطقة electroporated التي التقطت بواسطة LY Electroporation لل(المانحين LY إلى خلايا غير electroporated) مع نجم. وتميزت الخلايا حيث نقل LY في تقاطعات الفجوة من خلال بنقطة. في (A) و (B)، هناك 57 نقطة و 10 النجوم، أي GJIC = 5.7. خلايا (C) و (D) لا تملك تقاطعات الفجوة، كما يتضح من عدم وجود التدرج من مضان. تشير الأسهم إلى حافة المنطقة electroporated. بار = 100 ميكرون.ES / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم خلايا 4. (A) T51B التي تضررت خلال التلاعب عن طريق كشط. هذه الخلايا قد تلتقط LY حتى من دون Electroporation للوربما تحويلها إلى جيرانهم من خلال تقاطعات الفجوة. (B) و (C) الخلايا التالفة من قبل نبض التي هي قوية جدا. تم electroporated (B) T51B كبد الفئران الخلايا الظهارية في وضع معتدل ، 20 فولت. قد تعرضت للتلف الخلايا على يسار الخط المحفور (السهم) من قبل Electroporation لل. في هذه الحالة الخلايا لا فصل، ولكن نظرة فاحصة على الصورة النقيض من المرحلة (لوحة المتوسطة، السهم الأبيض) يدل على أن يكون نوى الخلايا المظلمة، في حين أنها يتألق ضعيفة جدا، على كل حال (اللوحة العلوية). ومع ذلك، نقل عشرتقاطعات الفجوة الخام هو واضح، إلى الخلايا على الجانب الأيمن التي لم يتم electroporated. وقدم الصورة السفلية من خلال الجمع بين الأشعة فوق البنفسجية والنقيض من المرحلة الإضاءة، لتسهيل المشاهدة من حافة Electroporation لل. الخلايا الظهارية الكبد (C) T51B الفئران electroporated في الإعداد المتوسط، 30 فولت. قد تعرضت للتلف الخلايا على يسار الخط المحفور بشدة من النبض. لاحظ كيف وصلنا الخلايا وإيقاف لا يتألق. وقد اختار بعض الناجين حول حافة تصل LY ويبدو أن تمرير فإنه إلى جيرانهم إلى اليمين عبر تقاطعات الفجوة. الخلايا (D) T51B electroporated مع 10μg / مل يوديد propidium. ملاحظة تلطيخ مكثفة من النوى. (E) القبب من الخلايا الظهارية. T51B خلايا electroporated في وضع معتدل، 15 فولت. ملاحظة حتى Electroporation للخلايا في اليسار. ومع ذلك، عندما متموجة، وخلايا T51B تشكل القباب التي قد تأتي من خلال التلاعب وغسل، ويجوز للخلايا المحيطة تاكه تصل LY. ملاحظة نقل صبغ واسعة النطاق. تمت إزالة (F) الخلايا التي قد جفت التقاط LY دون electroporation.The المتوسطة النمو من خلايا والخلايا T51B تركت في غطاء تدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة. وأضيف LY بعد ذلك إلى الخلايا لمدة 1 دقيقة وكانت ثابتة في وقت لاحق الخلايا، وغسلها وتصويرها تحت مضان (اللوحة العلوية) أو على النقيض من المرحلة (اللوحة السفلية) الإضاءة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. حجب الببتيد Grb2-SH2 يمنع تنشيط إرك EGF بوساطة في الخلايا الحية سليمة. مزيج من GJIC ونقل الإشارة الدراسات. بعد يجند ملزم، وعدد من مستقبلات عامل النمو مثل عامل نمو البشرة التوصيةeptor (EGFR) هي عبر فسفرته على بقايا التيروزين محددة. تشكل هذه المواقع لرسو السفن المجالات SRC-التماثل-2 من محولات إشارة مثل Grb2 التي منضما إلى SOS عامل الصرف GTP / الناتج المحلي الإجمالي، والذي بالتالي تقديمهم للغشاء وينشط رأس. هذه النتائج في تفعيل شلال راف / ميك / إرك والفسفرة من إرك في تسلسل P TE P Y. لذلك، تحقق مع الأجسام المضادة الفوسفات إرك محددة يمكن أن تكون مقياسا لتفعيل مستقبلات EGF. بعد التثبيت، يتم بحثها مع الأجسام المضادة الخلايا المضادة للرفع معنوياته (الإشارة خلية)، تليها الأجسام المضادة البيوتين بالإضافة الثانوية، streptavidin-فجل الخيل البيروكسيداز والركيزة Diaminobenzidine، الذي يعطي اللون البني 29. في هذه التجربة، تم إدخال phosphopeptide حجب المجال Grb2-SH2 (Y INQS PVPE ص) من خلال الموقع Electroporation للفي الاولخلايا n لNIH 3T3 المتزايد في غرف Electroporation للنمو واعتقال في المتوسط ​​قضى. 5 دقائق بعد تطبيق النبض، وحفز الخلايا مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي لمدة 5 دقائق، الثابتة وبحثها لتنشيط الفوسفات-Erk1 / 2 بواسطة الخلايا stainingand المناعي ظهور من نفس المجال تصويرها تحت brightfield (أعلى) أو النقيض من المرحلة (القاع) الإضاءة. لاحظ أن تسد الببتيد Grb2-SH2 خفضت بشكل كبير من إشارة صندوق تعديل العولمة الأوروبي، أي إرك الفسفرة (منطقة أ). تثبيط إشارة يمتد إلى ~ 3-4 صفوف من الخلايا المجاورة في منطقة غير electroporated (قوس متعرج)، على الأرجح بسبب حركة دا الببتيد 1123 من خلال تقاطعات الفجوة. هذه النتيجة تشكل أدلة دامغة على أن تثبيط المرصود يجب أن يكون راجعا إلى الببتيد، بدلا من قطعة أثرية من Electroporation لل، لأن الخلايا في هذا المجال لم يحصل أي تيار، ولكن اكتسب الببتيد من جيرانهم. في الوقت نفسه، ليس هناك أية آثار ظاهرة على مورفولوجيا الخلايا ويتضح من مرحلة التباين. السهم يشير إلى حافة المنطقة electroporated. التكبير: 240X. لمزيد من التفاصيل والضوابط أنظر المرجع 29. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

المواد Electroporated
نقاء المواد التي سيتم electroporated مهم جدا. إذا كانت الخلايا مسطحة جدا، ثم تركيزات أعلى من تتبع صبغة يجب استخدام (تصل إلى 20 ملغ / مل لLY) وفي مثل هذه الحالات، والنقاء هو أكثر أهمية مما كانت عليه في الخلايا مع شكل أكثر كروية 1. إلى جانب LY وقد استخدمت مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأصباغ الأخرى أو الجزيئات nonpermeant، مثل سلسلة من الأصباغ اليكسا لاستخدام المجسات لقنوات تتألف من 25 connexins مختلفة. ومع ذلك، مقحم الأصباغ مثل إيثيديوم بروميد أو يوديد propidium في الحمض النووي بحيث نوى يتألق بقوة، مما يجعل الكميات نقل صبغة أكثر صعوبة (الشكل 4D). يجب أن يكون مستعدا الأصباغ تتبع ويغسل أجريت في خالية من الكالسيوم متوسطة النمو، وذلك لأن تدفق الكالسيوم قد يقطع الاتصالات وصلي، وكذلك الحد من سلل جدوى. يجب أن تبقى كل الحلول عند 37 درجة مئوية قبل Electroporation لل، مما يسهل إغلاق المسام و1 قدرتها على البقاء.

تحديد الجهد الأمثل والسعة
قوة الحقل الكهربائي هي معلمة حرجة للتغلغل الخلايا، فضلا عن قدرتها على البقاء. وقد تبين أن تطبيق نبضات متعددة لتقديم نتائج أفضل من حيث تخلل وبقاء الخلية من نبضة واحدة. جهاز Insitu Porator المشاريع خلية لديه ثلاثة إعدادات السعة وعدد النبض: لطيف (10 البقول، 10 ميكرو ثانية وبصرف النظر، 0.1 ثانية بين البقول)، متوسطة (20 البقول، 80 ميكرو ثانية وبصرف النظر، 0.2 ثانية بين البقول) وقوي (50 البقول ، 120 ميكرو ثانية وبصرف النظر، 0.5 ثانية بين البقول)، في حين أن الجهد يمكن التحكم بدقة مستقل (2-45V). في الواقع، وخلايا مسطحة تتطلب جهد كهربي أقل من تلك التي تتحول الخلايا في أجمة أو الخلايا مع مساحة صغيرة للالتصاق التحتية (مثل خلايا الحشرة Sf9)وربما يرجع ذلك إلى كميات أكبر من التيار المار من خلال خلية الموسعة التي هي على اتصال مع منطقة موصل أكبر. لمزيد من التفاصيل حول هذا الموضوع، يرجى الاطلاع 1.

المشاكل المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

إذا تم كشط الخلايا خلال التلاعب، فإنها قد التقاط الصبغة ويتألق دون Electroporation لل(الشكل 4A). كمية الطاقة تسليمها إلى خلايا يؤثر على كفاءة Electroporation لل. إذا كان النبض ضعيفا جدا (أي منخفضة للغاية الجهد وضبط نبض)، ثم تظهر الخلايا العادية في إطار المرحلة المقابل لكنهم لا يتألق، ربما باستثناء بعض الخلايا التي قد يكون ميتا أو تم كشط خلال التلاعب (الشكل 4A) . إذا نبض قوي للغاية، في ظل خلايا النقيض من المرحلة يبدو أن نوى مظلمة جدا (الشكل 4B)، ولكن قد لا تزال تحتفظ ببعض LY، وحتى السماح لبعض نقل صبغ إلى الخلايا المجاورة. في عشيةن البقول أعلى يتم تدمير الخلايا (الشكل 4C). ومثل هذه الخلايا هي lysed، وبالتالي هم لا تحتفظ LY ويتألق ضعيفة جدا، على كل حال. بعض خطوط الخلايا الظهارية مثل T51B هياكل شكل القبة التي قد تأتي من خلال التغييرات المتوسطة. الخلايا المحيطة قد ثم يتألق كما يجوز نقل الصبغة من خلال تقاطعات الفجوة (الشكل 4E). وترد أمثلة على الظروف المثلى لElectroporation للخطوط تمثيلية في الجدول 1.

المزايا أكثر من غيرها من التقنيات وأهميتها

مقدمة DNA
هناك عدد كبير من البروتوكولات ترنسفكأيشن، مثل الكالسيوم الفوسفات المشترك هطول 26 أو أنواع مختلفة من الجسيمات الشحمية. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تؤثر على الخلايا بطرق خفية التي قد تكون مهمة جدا، خاصة بالنسبة للدراسات نقل الإشارة. على سبيل المثال، الفسفرة صور-705 من محول الإشارات ومنشط نسخةيتم زيادة أيون 3 (STAT3) الذي يرتبط النشاط النسخي لها بشكل كبير من قبل الإجراء من الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن حتى في حالة عدم وجود الحمض النووي. هذا يمكن أن يرجع ذلك إلى حقيقة أن يعجل يغير الخلية إلى خلية التصاق والمشاركة كادهيرين، وهو STAT3 المنشط المعروف 27. كان بعض الجسيمات الشحمية تأثير مماثل لكن أقل وضوحا، في حين Electroporation للعدوى فيروسات أو لم تؤثر على مستويات STAT3 6.

مقدمة من الببتيدات
وهناك طريقة مشترك هو بناء الببتيد الانصهار مع تسلسل التي تعبر غشاء الخلية، مثل المشتقة من الجين HIV-المتبادل. ومع ذلك، فإن نقل عبر الغشاء هو عملية بطيئة نسبيا وتثبيط إشارة ليست فعالة كما. لدراسة تسلسل الأحداث التي تحدث تنشيط مستقبلات التالي بواسطة ليجند، والقدرة على إدخال لحظة من الببتيد، مجمع peptidomimetic أو غيرها يقدم الميزه المهمه. Electroporation للمن الببتيد خلية منفذة لتسريع امتصاص لها غير ممكن، لأن جزءا لا يتجزأ من المرجح الببتيد محبة للدهون في غشاء الخلية، كما كشفت مع الببتيدات FITC جانب (Raptis، غير منشورة). ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن تثبيط تفعيل إرك بواسطة صندوق تعديل العولمة الأوروبي من خلال استخدام خلية الببتيد قابلة للاختراق حجب المجال Grb2-SH2 على سبيل المثال، كان جزئي 28 فقط، في حين Electroporation للمن نفس الببتيد تحقيق تثبيط كامل للإشارة 29 ( الشكل 5). تقنيات أخرى، على أساس الجسيمات الشحمية هي أيضا في وجود. ومع ذلك، فإنها لا تسمح فحص الخلايا غير المعالجة الجانب إلى جنب مع تلك المعالجة، بالتزامن مع دراسات تقاطع الفجوة، التي يمكن أن تقدم أقوى مظاهرة الممكنة التي تثبيط إشارة يجب أن يرجع إلى المواد التي أدخلت (الشكل 5، قوس متعرج ، ج).

دراسات الفجوة مفرق
حقن مكرويمن الأصباغ أو كشط التحميل يعملون عادة، لكنها إدخال دائما تلف الخلايا. أسلوب آخر، والانتعاش بعد مضان photobleaching من ليس الغازية ولكنها تتطلب معدات باهظة الثمن، ويمكن فحص عدد قليل من الخلايا في وقت واحد، في حين تشكيل المواد الضوئية قد تكون قضية. ويتكون الفحص المظلة الخلايا ما قبل التحميل مع الصبغة calcein AM (الأخضر)، ثم السماح للخلايا الالتزام على طبقة الخلايا، كما تشكل تقاطعات الفجوة خلال 15 دقيقة، 3 ساعات. يمكن علاج عدد كبير من الخلايا في هذا الطريق، ولكن قدرة الخلايا على تشكيل تقاطعات الفجوة في هذا الاختبار يختلف بشكل كبير مع نوع من الخلايا 30.

القيود

الجهد المطلوب أعلى لإدخال جزيئات ذات حجم أكبر والشحنات الكهربائية. في الفولتية العالية المطلوبة لإدخال البلازميدات كبيرة، قد يكون هناك بعض موت الخلايا. الفولتية النسبية المطلوبة لجزيئات مختلفةوقد وصفت سابقا 9،12. على الرغم من أننا وصف Electroporation للاستخدام Electroporation للجهاز معين، فمن الممكن لشخص من ذوي الخبرة مع الأجهزة الكهربائية لجعله باستخدام صفا مفصلا في 19، أو إجراء الإعداد أسهل مع القطب العلوي فوق خلايا، وحفر مع الأحماض 1.

التوجهات المستقبلية

وقد وضعت برامج لتحديد بالضبط GJIC 31. وهناك مزيد من التحسن هو تطوير نقاط الكم أن يتألق فقط مرة واحدة هم في الخلية، بحيث ليست هناك حاجة لغسل الصبغة الفردية. هذا يتجنب الإجهاد الغسيل، بينما يمكن ملاحظة هذه العملية في الخلايا الحية ليست ثابتة في الوقت الحقيقي. إدخال الببتيدات لقطع مسارات إشارات قوية هو نهج لتقييم المجراة من أهمية التفاعلات التي تم تحديدها باستخدام مكونات المنقى. فحص وعاءential من الببتيدات مختلفة لكبح مسار معين هو الخطوة الهامة الأولى في تطوير عقاقير peptidomimetic، لعلاج عقلانية من الأورام.

تعليقات أخرى

يمكن غسلها الشرائح مع Extran-1000 الحل باستخدام الفرشاة الصغيرة للوصول إلى سطح ايتو في البئر، وتشطف بالماء. إذا كان قد تم إصلاح الخلايا على الشريحة، فإنه قد يكون من الضروري إزالة آثار من البروتين مع التربسين أو الإنزيمات المحللة للبروتين أخرى أولا. يجب تجنب الصوديوم دوديسيل كبريتات المنظفات التي تحتوي على. يمكن تعقيمها وغسلها مع الشرائح الغاز بيروكسيد. ومع ذلك، فمن المهم جدا لتجنب كسر الختم من البئر على الشريحة لأنه إذا كان أي تسرب حل LY في حامل قد يسبب ماس كهربائى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro http://www.cellgro.com/ 50-013-PB
DMEM without Calcium Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) SH30319-01
Donor Calf Serum  PAA: http://www.paa.com/ Cat.# B15-008
Fetal Bovine Serum PAA: http://www.paa.com/ Cat.# A15-751
Electroporation apparatus Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ ACE-100
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-04-CC 4-wells
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-08-CC 8-wells
Lucifer Yellow Cell Projects Ltd UK ACE-25-LY High purity
CelTak BD Biosciences 354240 Cell and tissue adhesive
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Collagen BD Biosciences 354236
Poly-Lysine Sigma Aldrich P8920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
  2. Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
  3. Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
  4. Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
  5. Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
  6. Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
  7. Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
  8. Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
  9. Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
  10. Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
  11. Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
  12. Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
  13. Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
  14. Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  15. Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
  16. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  17. Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
  18. Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
  19. Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
  20. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
  21. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
  22. Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
  23. Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
  24. Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
  25. Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
  26. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  27. Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
  28. Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
  29. Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
  30. Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
  31. Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
  32. Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
  33. Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
  34. Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  35. Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 92، Electroporation لل، وأكسيد الإنديوم والقصدير، نقل الإشارة، الفجوة موصلي الاتصالات، الببتيدات، STAT3
مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geletu, M., Guy, S., Firth, K.,… More

Geletu, M., Guy, S., Firth, K., Raptis, L. A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide. J. Vis. Exp. (92), e51710, doi:10.3791/51710 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter