Introduction
셀 전류의 애플리케이션 프로세스라고 일렉트로, 세포막에 구멍을 형성시킨다. 기공이 막을 통한 분자의 nonpermeant 다양한 통로를 허용한다. 전기장이 형성된 기공은 매우 작고 휴대 생리학 방해를 최소화하여, 급속 리 클로즈되도록 정확하게 제어 할 수있다. 흥미롭게도, 부착 세포는 현탁액에 전기 천공 할 분리되지 않고, 그들이 성장 표면에 도전성 투명 인듐 - 주석 산화물 (ITO)로 코팅하고, 반응계에서 electroporation하여 유리 슬라이드 상에 성장 될 수있다. 세포는이 표면 상에 잘 성장할 수 있으며, 이들이 결합하고 확장 한, 상세한 현미경 관찰이 가능하다. 이 기술을 사용하여, 소형 분자 nonpermeant 즉시 도입하고 미리보기의 활성화에 대한 연구를 위해 적합하게이 기술을 세포의 본질적으로 100 %로 할 수있다(1 검토) 수용체의 리간드 자극 다음과 같은 경로의의 onents.
일렉트로는 DNA의 도입 (또한 electrotransfection)에 주로 사용되어왔다. 그러나 현장에서 일렉트로는 전사 인자 바인딩, 또는 siRNA를 3,5 억제하는 등의 안티센스 RNA, 이중 가닥 DNA 미끼 올리고 뉴클레오티드 등의 펩티드 2-4, 올리고 뉴클레오티드 분자의 큰 다양성의 도입을 위해 도움이 될 수 있습니다, 6, 방사성 뉴클레오티드 7-10, 단백질 11 (12) 또는 전구 약물 13. 일렉트로 후, 세포는 생화학 적 분석을 위해 용해 또는 고정 및 항체로 염색 할 수 있습니다.
셀이 전도성 코팅의 가장자리에 걸쳐 증가함에 따라 세포의 성장이,이 표면의 높이 차이에 의해 방해되지 않도록 도전성 ITO 코팅은 800-1,000Å 매우 얇다. 이 장점이 아닌 electrop을 제공합니다orated 세포는 제어 역할을하는, electroporation하여 사람과 나란히 성장시킬 수있다. 비디오에서 설명한 것과 동일한 접근은 갭 접합부, 세포 간 통신 (GJIC)의 검사를 위해 사용될 수있다.
갭 접합 인접 셀 (14)의 내부를 연결하는 채널이다. 이러한에서 Src와 같은 종양 유전자가 GJIC (15, 16)를 억제하면서 갭 접합부는, 세포 간 통신은, 종양 형성 및 전이에 중요한 역할을한다. 루시퍼 옐로우 (LY) 같은 미세 주입을 통해 배양 된 세포에 도입하거나 긁어로드 (17)와 인접 셀에 염료의 확산이 현미경 형광 조명 아래에서 관찰 등의 GJIC에게 형광 염료를 검사합니다. 그러나 이러한 기술은 변함없이 세포 손상을 야기한다. 이제 셀 (18)에 부분적으로 ITO로 코팅 된 유리 슬라이드 상에 성장되는 기법을 설명한다. 전기 펄스 LY (또는 다른 염료)의 존재 캘리포니아 도포인접 비 electroporation하여 세포에 염료 이행는 형광 현미경을 통해 관찰 조명하면서, 상기 슬라이드의 도전 부에 성장 세포로의 침투를 사용. 단일 층으로부터 분리하는 경향이있다 감수성 세포 교란을 방지하기 위해, 전극을 필요로하지 않은 설계되었다 조립체는 전류 (19)를 적용하는 셀의 상단에 배치된다. 혈청 자극 (12) 다음의 G1 단계의 길이에 대한 효과의 부재에 의해 표시된 바와 같이이 방법은 FOS의 수준 증가, 세포 대사에 어떤 검출 가능한 방해하지 않고, 다수의 셀에서 GJIC을 정량 할 수있는 능력을 구비 protooncogene 단백질 (Raptis, 미 출판) 또는 셀룰러 스트레스, P38 돼지 또는 JNK / SAPK 키나제 1과 관련이 키나아제. 종양 유전자 발현 변화와 GJ의 레벨 사이의 링크의 시험이 가능하게 접근IC (18)뿐만 아니라, 폐 종양 표본 20-23 갓 배양 된 세포를 포함하여 다양한 종류의 세포에서 GJIC시에서 Src와 STAT3의 효과. 또한, 기판에 대한 세포 부착은 그 단계에서 환원 19,24되지만, 성공적 adipocytic 분화시 갭 정션 폐쇄 시연에 이용 된 상부 전극을 결여 한 바와 셋업과 동일계에서 일렉트로.
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Protocol
1 일렉트로 챔버에서 셀 도금
- 층류 흐름 후드에서 평소와 같이 멸균 기술을 이용하여 세포를 Trypsinize.
참고 : 그들은 유리에 세포의 확산 방해 할 수 있으므로, 원심 분리하여있는 adherens와 갭 접합 따라서 형성을 트립신의 모든 흔적을 제거하는 것이 매우 중요합니다. - 피펫 1 (37)의 출력 C 시츄 electroporator에서 (도 1), 및 장소, CO 2 인큐베이터 구비 일렉트로 멸균 챔버에 세포 현탁액의 ML.
NOTE : 세포 부착은 피브로넥틴, 콜라겐, 폴리 라이신 또는 세포 및 조직 접착제 (원료 표 참조)에 도금에 의해 개선 될 수있다. - 세포가 합류 층을 형성 할 때 그들은 GJIC 시험에 대한 준비가되어 있습니다.
2 일렉트로 절차
GJIC 검사 용 전기 천공은 층류 흐름 후드 외부에서 수행 될 수있다이 걸리기 때문에 단 몇 분. 긴 배양 시간은 특정 실험에 요구된다면, 그것은 층류 흐름 후드에서 전적으로 수행 될 수있다. 모든 경우에서, 세포는 성장 챔버는 멸균해야한다.
- 5 ㎎ / ㎖ 루시퍼 노란색 솔루션을 준비 : 2 ㎖의 칼슘이없는 성장 매체 (electroporator 제공) 10 mg을 LY 분말을 녹여. 4 O C.에서 용액 저장을 필터 멸균 긴 배양 시간을 필요로 실험
- 성장 매체를 기음과 단층을 긁거나 세포를 건조하지 않도록주의, 칼슘이없는 배지로 세포를 씻어. 세포가 건조하면 그들은 일반적으로 어두운 핵을 가지고 일렉트로없이 LY를 선택합니다. 효과는 더욱 공기 드래프트 (도 4F)에 노출되는 슬라이드의 중간에 더 현저하다.
- 에펜 도르프 피펫으로, 챔버 (B)의 에지에서, 셀 (챔버 전체를 400 μL)에 염료 용액을 피펫주의 eing입니다 것은 셀 층을 만지지 않도록.
- electroporator와 함께 제공되는 홀더에 실을 배치하고 적절한 강도 (토론 참조)의 펄스를 적용합니다.
- 조심스럽게 LY 솔루션의 일부를 대기음. 덜 중요한 실험 번 재사용 될 수있다.
- 10 % 투석 혈청을 포함하는 칼슘이없는 DMEM를 추가합니다.
- 갭 정션을 통한 염료 전달을 허용하도록 배양기에서 3-5 분 동안 세포를 배양한다.
참고 :이 시점에서 투석 혈청의 포함은 기공 폐쇄를하는 데 도움이됩니다. - 라이브 세포 관찰을위한 칼슘이없는 DMEM으로 통합되지 않은 염료를 세척 할 것. 대안 적으로, 세포를 웰에 4 % 포름 알데히드의 첨가를 통해,이 단계에서 고정 될 수 있고, 그 다음 PBS (인산염 완충 식염수)로 세척 하였다. 모든 경우에 세척 모든 배경을 제거해야합니다.
주 : 예비 실험이 전압이 너무 낮은 경우, 최적의 조건을 결정하는 데있어서, 그것은 세포 incubato 회복하도록 할 수있다몇 분을위한 연구 및 슬라이드의 비용을 절약하기 위해 같은 슬라이드를 두 번 electroporate.
3 현미경 검사
- 사용되는 염료에 대한 적절한 필터를 구비 한 반전 된 현미경을 사용하여, 형광 조명 하에서 세포를 관찰한다. 노란색 루시퍼를 들어, 여자는 423nm, 방출 555nm, 니콘 IX70 현미경에 대한 WBV 필터입니다.
- 위상차 하에서 세포 형태를 조사하기 위해, 액체와 함께 상부에 충전 한 후, 잘 플라스틱 위에 유리 커버 슬립을 배치하여 메 니스 커스의 효과를 제거한다. 좋은 사진 촬영을 위해, 웰 슬라이드에서 분리 될 수 있으며, 커버 슬립은 프레임에 배치. 생균 대를 성장 배지로 채워 져야하는 동안 고정 된 세포의 경우, 웰, 현미경 관찰 용 글리세롤로 채워질 수있다.
참고 : 세포가 염료 (위의 단계 2.7)의 전송 다음 포름 알데히드로 고정하는 경우 세탁 촬영이 용이하다. 세포가있는 경우 더t는 형광 고정 세포 형광 몇 시간 동안 유지가 도입하면서 LY의 세포 유형, 전압 및 양에 따라 약 60 분 이내에 세포로부터 제거하고, 고정. 그러나, 형광 페이드 또는 고정 된 세포에서, O / N 배양 후 소산. 이러한 이유로, 사진은 일렉트로 (그림 2) 직후에주의해야합니다.
세포 간 통신의 4 정량
- 형광 및 위상 대비 (그림 3)에서 20 배 목적으로 세포를 사진.
- 비 electroporation하여 영역 (그림 2, 화살표, 일렉트로 에지)과 경계에 electroporation하여 세포를 확인하고 별표 표시합니다.
- 염료가 갭 접합을 통해 전송 한 비 electroporation하여 측면에 형광 세포를 확인하고 점으로 표시 (그림 3a 및 3b).
- 의 총 수를 나눈다에지 (도 3a 및 3b)을 따라 electroporation하여 세포의 수에 의해 비 전기 천공 영역에 세포를 형광.
NOTE 적어도 200 연속 electroporation하여 경계 셀로부터의 전송을 각각의 실험에 대해 계산된다. 얻어진 숫자는 GJIC 값이다.
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Representative Results
그림 2는 고정 및 세탁 다음과 같은 형광 (패널 A와 B)에서 LY와 전기 천공 및 촬영 쥐 간 상피 T51B 셀 (22), 또는 위상차 (C) 조명을 보여줍니다. 패널에 electroporation하여 영역의 가장자리가 빨간색으로 표시됩니다. 적색 라인의 오른쪽에 형광 구배 갭 정션을 통한 전송을 나타낸다. 염료가 전송 한 셀이 도트로 표시된 상태에서, 전기 천공 영역의 에지에서 셀 스타 식별되고 표시되었다 :도 3a 및도 3b에서, 갭 접합부 통신의 정량이 도시되어있다. 비 염료 electroporation하여 경계 셀 당에 전사 셀의 평균 개수를 나타낸다. 이 예에서, 즉 57 점과 10 개, GJIC = 5.7이 있습니다.
C 및 D, 전사 - (3)의 신호 변환기와 액티베이터 (STAT3)에서 T51B 셀 t에서 하향 조절되었다트랜스퍼 (22)의 absense 같이 hrough 안정된의 siRNA 렌티 바이러스 벡터와 발현하고 이것은, GJIC 감소시킨다.
그림 1 일렉트로 전극과 슬라이드 어셈블리. (A) 위쪽 뷰 : 세포 도전성 투명 인듐 - 주석 산화물 (ITO)로 코팅 된 유리 슬라이드 상에 성장된다. 플라스틱 챔버는 세포 및 LY위한 컨테이너를 형성하기 위해, 상기 슬라이드에 결합된다. 코팅은 레이저 식각이 본질적으로 전극을 형성하는, 중앙에 직선이다. 댐 따라서 전계 강도의 급격한 전이를 만드는 전류를 위쪽으로 전환하는데 사용된다. 비도 전성 영역을 제공하기 위해 ITO는 또한 두 사각형으로 에칭된다. 펄스 발생기로부터의 전류 (빨간 화살표는) 확산에 직접, 사각형 사이의 도전성 고속도로를 통해 다른 각 접촉점에서 흘러지역은 댐에 평행 이온 셀 electroporating 후 반대편 매체를 통해 댐 위에, 중간 배리어 평행. . 명확화를 위해, 챔버의 앞 부분 (B) 측면 뷰를 제거한다 : ITO 코팅 (밝은 녹색) 및 에칭, 맨손으로 유리 지역에 성장 세포와 슬라이드가 표시됩니다. (-), 및이 지역에서 성장하는 세포가 형성되고, LY 함유 일렉트로 매체는 다음 댐의 높이가 전극 사이에 전기적 경로 (+) 및 상기 레벨로 챔버에 첨가하는 경우. 실제 두께 (800)는 셀의 두께보다 훨씬 적다하더라도 ITO 층은 명확성을 위하여 과장 두께로 도시되어 있음을주의한다. (C) 및 비 전기 천공 전기 천공 셀의 면적을 확대하는 것이 도시된다. 농도가 여러 갭 정션 TRANSF 통해 약화로 염료는 모든 셀 및 전기 천공 전기 천공 에지에 걸쳐 페이드 된 댐 부근 치밀들. 큰 화살표는 갭 정션을 통한 염료 전사의 방향을 나타낸다. 세포의 크기와 두께는 명확성을 위해 과장되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
T51B의 그림 2 일렉트로, 쥐 간 상피 세포. LY는 T51B 쥐 간 상피 세포 (경증, 12 볼트)에 전기 천공 하였다. 5 분 후. 배양, 세포 형광 (A, B) 또는 위상차 (C) 조명 아래에서 촬영되었다. electroporation하여 영역 (화살표, 빨간색 선)의 가장자리에서 연장 형광의 기울기에 의해 표시 갭 접합을 통해 광범위한 전송을 유의하십시오. 동시에, 세포에 어떠한 손상이 없다 위상차 (C)에서 볼 수 s의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
간극 결합 전송 그림 3 정량. 전기 천공 (electroporation하여 비 세포 LY 기증자)하여 LY 태웠다 electroporation하여 영역의 에지에서 셀은 별표로 표시 하였다. LY를 통해 갭 접합에 옮겨 세포는 점으로 표시 하였다. (A) 및 (B)에서, 즉, 57 점 및 10 개, GJIC = 5.7있다. 형광의 구배의 유무에 의해 도시 된 바와 같이 (C) 및 (D)에있는 세포, 갭 정션 없다. 화살표는 전기 천공 영역의 에지를 가리. 바 = 100 μm의.ES / ftp_upload / 51,710 / 51710fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
조작 중에 긁어 손상되었을 그림 4 (A) T51B 세포. 이러한 세포는 심지어 일렉트로없이 LY를 픽업 할 수 있고 갭 접합 통하여 이웃에게 전송할 수있다. (B)과 너무 강한 펄스에 의해 손상 (C) 세포. (B) T51B 쥐 간 상피 세포를 온화 설정에 전기 천공 하였다 20 볼트. 식각 선 (화살표)의 왼쪽에있는 세포를 전기 천공에 의해 손상되었다. 이 경우 세포가 위상차 사진 (가운데 패널, 흰색 화살표)에서 그러나 자세히 살펴, 분리하지 않았다은 매우 약한 형광을하는 동안, 어두운 핵을 가지고 세포를 모두 표시합니다 (상단 패널)의 경우. 그러나 번째 전송거친 갭 정션은 전기 천공되지 않은 우측 셀에 명백하다. 아래쪽 사진은 전기 천공의 에지의 관찰을 용이하게하기 위해, UV 및 위상차 조명을 조합하여 만들어졌다. 중간 설정, 30 볼트에서 전기 천공 (C) T51B 쥐 간 상피 세포. 식각 된 라인의 왼쪽에있는 세포가 심하게 펄스에 의해 손상되었다. 세포가 벗겨하고 형광을하지 않는 방법을합니다. 가장자리의 일부 생존자들은 LY를 집어 갭 접합을 통해 오른쪽으로 이웃에 전달하기 한 것으로 나타났습니다있다. 10μg / ㎖ 요오드화 프로피 듐과 전기 천공 (D) T51B 세포를. . 핵의 강렬한 염색을 참고 상피 세포의 (E) 돔입니다. T51B 세포 온화한 설정, 15 볼트에서 전기 천공. 왼쪽에있는 셀의 경우에도 일렉트로을합니다. 컨 플루 언트 그러나, T51B 세포 조작 및 세정 중에 벗겨 질 수 돔을 형성하고, 주변 셀 TA 수도LY를 애. 광범위한 전사 염료를 참고. electroporation.The 성장 배지없이 LY을 픽업 할 수있는 건조 (F) 세포 T51B 세포 및 세포로부터 제거하고 30 분 동안 층류 유동 후드에 남았다. LY 이후 1 분 동안 세포에 첨가하고 세포를 연속적으로 고정 세척하고 형광 (상단 패널) 또는 위상차 (하단 패널) 조명 아래에서 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 GRB2-SH2 차단 펩타이드가 그대로 살아있는 세포에서 EGF 매개 ERK의 활성화를 억제한다. GJIC 및 신호 전달 연구의 조합. 리간드 결합 후, 이러한 표피 성장 인자와 같은 녹화 성장 인자 수용체의 숫자eptor (EGFR)는 특정 타이로신 잔기에 트랜스 인산화입니다. 여기에는 이렇게 막에 가져오고 라스를 활성화하는 GTP / GDP 교환 인자 SOS에 바인딩 GRB2 같은 신호 변환기의 Src에 상동 -이 도메인에 대한 도킹 사이트를 구성한다. 이것은 P TE P Y 시퀀스에서 Raf의 / 멕 / ERK 캐스케이드 ERK의 인산화의 활성화가 발생합니다. 따라서, 특정 포스 ERK 항체를 프로빙 EGF 수용체의 활성화의 척도가 될 수 있습니다. 정착 후, 세포는 갈색 (29)를 제공 비오틴 - 결합 이차 항체, 스트렙 타비 딘 - 퍼 옥시다아제 raddish 말 - 및 디아 미노 기판,이어서 항 - 특권 항체 (셀 시그널링)로 프로빙된다. 이 실험에서, GRB2-SH2 도메인 (PVPE 페이지 Y INQS)를 차단 인산 펩타이드는 현장 전기 천공 법 (electroporation)에 의해 도입 된 전일렉트로 챔버 및 성장 피하려면 NIH 3T3 세포 보냈다 매체에 성장 - 체포했다. 5 분 펄스인가 후, 세포를 5 분 동안 EGF 자극 고정, 시야 (위) 또는 위상차 (아래) 조명 아래에서 촬영 같은 분야에서 immunoperoxidase stainingand 세포에 의해 활성화 포스 ERK1 / 2 프로빙되었다. 즉, GRB2-SH2 차단 펩타이드가 극적으로 EGF 신호를 감소합니다 ERK의 인산화 (지역). 신호의 억제로 인해 갭 정션 내지 1123 다 펩티드의 이동에 비 전기 천공 영역 (물결 브라켓)에 인접하는 셀에 행 ~ 3-4, 가능성을 확장한다. 이 발견은이 지역에있는 세포가 어떤 전류를받을 수 있지만 이웃의 펩타이드를 인수하지 않았기 때문에 관찰 억제가 아니라 일렉트로의 유물보다, 때문에 펩티드해야한다는 강력한 증거를 구성한다. 동시에, 세포 형태에 따라 검출 가능한 효과 등은 없다위상차으로 도시. 전기 천공 영역의 에지 점 화살표. 배율 : 240X. 자세한 내용과 컨트롤 참조 29을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요한 단계
electroporation하여 재료
전기 천공 할 물질의 순도는 매우 중요하다. 세포가 매우 평탄한 경우 추적 염료의 다음 높은 농도 (20 mg을 LY 대 / ㎖까지)와 같은 경우에 사용되어야하며, 순도가 더욱 중요 더 구형 1 세포에서보다. LY 외에 다른 염료 또는 nonpermeant 분자의 많은 종류가 상이한 connexins 이루어진 25 채널 프로브로 사용할 알렉사 염료의 시리즈로서 사용되어왔다. 핵 염료 전송 더 어렵다 (그림 4D)의 정량을 만드는 매우 강한 형광 있도록 그러나, 에티 디움 브로마이드 또는 프로피 디움 요오드 등의 염료는 DNA에 인터된다. 추적 염료 칼슘 유입 접합부 통신을 중단뿐만 아니라, CEL을 줄일 수 있으므로, 제조 및 세척 칼슘없는 성장 배지에서 수행되어야리터 생존. 모든 솔루션은 이전의 기공 폐쇄과 생존 일을 용이하게 전기 천공 법 (electroporation), 37 O C에서 보관해야합니다.
최적의 전압과 용량의 결정
전계 강도는 세포 투과뿐만 아니라 생존위한 중요한 파라미터이다. 다중 펄스의 응용 프로그램은 단일 펄스보다 침투 및 세포 생존 능력의 측면에서 더 나은 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 마일드 (10 펄스, 떨어져 10 μs의 펄스 사이에 0.1 초), 중간 (20 펄스, 떨어져 80 μs의 0.2 펄스 사이 초)과 강 (50 펄스 : 셀 프로젝트의있는 현장 PORATOR 장치는 용량과 펄스 수에 대한 세 가지 설정이 있습니다 120 μs의 펄스들 사이의 간격, 0.5 초), 전압 미세) 독립적으로 (2-45V 제어 될 수있다. 실제로, 평면 세포 기질에 접착 작은 영역 또는 세포 덩어리의 것보다 낮은 전압 변환, 세포가 필요 (예를 들면, 곤충 세포 인 Sf9)가능성으로 인해 더 큰 도전성 영역과 접촉하는 확장 된 셀을 통해 흐르는 전류의 양에 큰. 이 주제에 대한 자세한 사항은 하나를 참조하십시오.
잠재적 인 문제 및 문제 해결
세포를 조작하는 동안 긁어 되었다면, 이들은 염료를 픽업하고 전기 천공 (도 4a)없는 형광있다. 세포로 전달되는 에너지의 양이 전기 천공 효율에 영향을 미친다. 펄스가 너무 약하면 (즉, 너무 낮은 전압 및 펄스 설정) 후 세포 위상차 하에서 정상 표시하지만 아마도 죽었거나 조작 중에 긁어 된 특정 세포를 제외한 형광하지 않는다 (도 4A) . 펄스 위상차 세포 하에서 너무 강하면 매우 어두운 핵 (도 4b)를 갖도록 나타나지만 LY 일부를 유지하고, 인접 셀에서도 일부 염료 전달을 허용 할 수있다. 이브N 높은 펄스는 세포 (그림 4C)를 파괴됩니다. 이러한 세포가 용해되고, 따라서 그들은 LY을 유지하지 않고 모든 경우에 매우 약한 형광. 이러한 매체를 변경하는 동안 빠질 수 T51B 양식 돔 구조와 같은 특정 상피 세포 라인. 염료가 갭 접합 (그림 4E)를 통해 전송 될 수 있으므로 주변 세포는 형광을 할 수 있습니다. 대표적인 라인 일렉트로 최적 조건의 예는 표 1에 나타낸다.
다른 기술과 의미를 통해 장점
DNA 소개
칼슘 포스페이트 공 침전 (26) 또는 리포좀과 같은 다른 종류의 형질 전환 프로토콜의 다수가있다. 그러나, 특히 신호 전달 연구를 위해 매우 중요 할 수있다 미묘한 방식으로 셀에 영향을 미칠 수있다. 예를 들어, 신호 변환기와 전 사체의 활성제 티르-705 인산화그 전사 활성과 연관 이온 3 (STAT3)는 극적에도 DNA의 부재 하에서 칼슘 - 포스페이트 형질 감염의 조작에 의해 증가된다. 이는 침전물을 세포 접착 및 결합 카드 헤린, 공지 STAT3 활성화 제 27 셀을 변경한다는 사실에있을 수있다. 전기 천공 또는 레트로 바이러스 감염 STAT3 수준 6에 영향을주지 않았지만 특정 리포솜은 유사하지만 덜 두드러진 효과가 있었다.
펩티드의 도입
일반적인 방법은 HIV-TAT 유전자로부터 유도 등의 세포막을 통과 서열과 융합 펩티드의 구조이다. 그러나, 세포막을 통한 전달은 비교적 느린 프로세스이며 억제 신호는 효율적이지 않다. 다음으로 리간드 수용체 활성화를 발생하는 이벤트의 시퀀스의 연구를 위해, 펩티드 즉시 도입 능력은 펩티 또는 다른 화합물은 중요한 advantag을 구비전자. FITC-결합 펩티드 (Raptis, 미공개)에 계시 된 친 유성 펩티드, 세포막에 매립되어 있기 때문에 그 흡수를 촉진하기 위해 세포 투과성 펩타이드의 전기 천공이 가능 같지 않다. 그것은 (동일한 펩타이드의 전기 천공은 신호 (29)의 완전한 억제를 달성하는 동안, 예를 들어 GRB2-SH2 도메인을 차단하고 세포 투과 펩티드의 사용을 통해 EGF 의한 ERK 활성화의 억제는, 28 만 부분이라고 흥미 롭다 그림 5). 리포좀에 기초하여 다른 기술들은 또한 존재한다. 그러나 이러한 물질은 (도 5보기, 구불 구불 한 브래킷을 도입되기 신호 억제 인해이어야 강한 가능한 데모를 제공 할 수있는, 갭 정션 연구와 관련하여, 처리 된 것들과 측면에 의해 미처리 세포 측의 검사를 허용하지 않는다 , C).
갭 접합 연구
미세 주입염료 또는 스크랩 로딩 중 일반적으로 사용하지만, 그들은 변함없이 세포 손상을 소개하고 있습니다. 광표백 후 다른 기술, 형광 복구 침습적 아니지만은 고가의 장비를 필요로하고, 광독성 물질의 형성이 문제가 될 수 있지만 몇 균체 한번에 조사 할 수있다. 낙하산 분석은 염료의 칼 세인 AM (녹색)와 프리로드 셀 이루어져, 다음 갭 정션 15 분 -3 시간 이내에 형태로서 세포, 세포 층에 부착시키는. 다수의 셀은 이러한 방식으로 치료 될 수 있지만,이 분석에서 갭 접합을 형성하는 세포의 능력은 세포 형 (30)과 거대 변한다.
제한
필요한 전압은 더 큰 크기 및 전하의 분자의 도입 높다. 큰 플라스미드의 도입에 필요한 높은 전압에서 약간의 세포사가있을 수있다. 다른 분자에 필요한 상대적인 전압이전에 9,12 설명 하였다. 우리가 특정 전기 천공 장치를 사용한 전기 천공을 설명하지만, 누군가가 19의 상세한 설명을 사용하여 만들거나, 세포 위의 상부 전극으로 간단한 설정을하고, 산 1 에칭 가전 경험 가능하다.
미래 방향
소프트웨어는 정확하게 GJIC 31 정량화하기 위해 개발되었습니다. 상기 개선은 비법 염료 세척 할 필요가 없기 때문에 그들이 셀에 한 번만 형광 양자점의 개발이다. 프로세스가 실시간으로 실시간이 아닌 고정 된 세포에서 관찰 될 수있는 동안 이것은 세정 응력 피한다. 신호 전달 경로를 방해하는 펩티드의 도입은 정제 된 컴포넌트를 사용하여 식별 된 상호 작용의 관련성의 생체 내 평가를위한 강력한 접근 방식이다. 냄비의 시험특정 경로를 억제하는 다른 펩타이드 ential은 종양의 치료를위한 합리적인 펩티 의약품의 개발 제 중요한 단계이다.
기타 의견
슬라이드는 웰 ITO 표면에 도달하는 작은 붓을 사용 Extran-1000 수용액으로 세정하고, 물로 세정 할 수있다. 세포 슬라이드 상에 고정 된 경우, 제 트립신 또는 다른 단백 분해 효소와 단백질의 흔적을 제거 할 필요가있다. 나트륨 도데 실 황산염 포함 된 세제는 피해야한다. 씻어 슬라이드는 과산화수소 가스로 멸균 할 수 있습니다. 그러나, 어떤 홀더 LY 액 누출이 단락을 일으킬 수 있기 때문에 경우에 슬라이드 웰의 시일을 파괴하지 않도록하는 것이 매우 중요하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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