Introduction
电电流的一个小区中的应用程序会导致孔的细胞膜上形成，由一个过程被称为电穿孔。的孔允许的各种透过膜nonpermeant分子的通道。电场可以精确地控制，从而使形成的孔是非常小的和重新闭合迅速，以最小的干扰对细胞生理学。有趣的是，贴壁细胞可生长在涂有导电性和透明的铟锡氧化物（ITO）和电穿孔的原位载玻片上，即在那里生长的表面上，而不被分离的悬浮液中进行电穿孔。细胞可以生长得非常好在该表面上，并且当它们被安装并伸展，详细显微镜观察是可能的。使用这种技术，小型nonpermeant分子可即刻导入和成基本上100％的细胞，这使得该技术特别适用于研究排版的活化通路的继受体（1审查）的配体刺激onents。
电穿孔已经大多用于引入的DNA（也称为electrotransfection）。然而，电穿孔法在原位可用于引入了大量的各种分子，如肽2-4，寡核苷酸，如反义RNA，双链DNA诱饵寡核苷酸的宝贵抑制转录因子的结合，或siRNA 3,5， 6，放射性7-10个核苷酸，蛋白质11 12或前体药物13。在电穿孔之后，将细胞可被裂解为生化分析或固定和染色的抗体。
导电性ITO涂层非常薄，800-1,000Å，使细胞的生长不是由在两个表面的高度差的干扰，如在单元两端的导电涂层的边缘生长。这提供的优点是，非electroporated细胞可以生长并排电穿孔者，作为对照。同样的方法可以用于间隙连接，细胞间通讯（GJIC）的检查，如在视频中描述。
间隙连接是连接相邻的电池14的内部通道。间隙连接，细胞间通讯在肿瘤形成和转移中起重要作用，而癌基因如Src蛋白抑制GJIC 15,16。审查GJIC荧光染料如荧光黄（LY）经常被导入培养的细胞中，通过显微注射或刮除装17和染料扩散到邻近细胞下的荧光照明显微观察。这些技术不过总是导致细胞损伤。我们现在描述那里的细胞生长在其上部分涂有ITO 18载玻片的技术。电脉冲在LY（或其它染料）的存在下施加连载ca利用其渗透到细胞上滑动的导电部分越来越大，而染料迁移到相邻的，非电穿孔的细胞通过荧光照明显微观察。为了避免干扰敏感的细胞可能离开单层分离，被设计的组件，其并不需要一个电极被放置在小区的顶部施加的电流19。这种方法提供了定量GJIC在大量细胞的能力，而没有任何可检测的干扰细胞代谢，由下列血清刺激12没有在G1期的长度的影响如所示，增加在fos基因的水平原癌基因蛋白（Raptis，未发表）或两个与细胞应激时，p38的生猪或JNK / SAPK 激酶相关激酶。这种方法成为可能的癌基因的表达，转化和GJ的水平之间的关系的检查集成电路18，以及Src和Stat3的的后GJIC在多种细胞类型中，包括细胞肺肿瘤样本20-23新鲜培养的效果。此外， 原位电穿孔与所描述的设置，其中缺乏的顶电极已被成功地使用，用于在脂肪细胞分化的间隙连接闭合的示范，虽然细胞附着到基底减小在该阶段19,24。
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Protocol
1，电镀的电穿孔室中的电解槽
- 在层流罩，使用无菌技术如常trypsinize细胞。
注意：通过离心来消除胰蛋白酶的所有痕迹，因为它们可能会妨碍细胞的玻璃板上散布，粘着和间隙连接从而形成是非常重要的。 - 吸管将1ml细胞悬液中提供的原位电穿孔仪（ 图1），并将其放置在37℃， 二氧化碳培养箱无菌电室的。
注：细胞粘附可以通过电镀于纤连蛋白，胶原蛋白，多聚赖氨酸或细胞和组织粘合剂（见材料表）而得到提高。 - 当细胞已经形成了融合层，他们已经准备好细胞间隙连接通讯检查。
2，电穿孔程序
电穿孔的细胞间隙连接通讯检查可以在层流罩外进行，因为只需要几分钟的时间。如果潜伏期较长时间都需要一个特定的实验，那么就可以完全在层流罩进行。在所有情况下，当细胞生长腔室必须是无菌的。
- 制备5毫克/毫升荧光黄液：将10毫克LY粉末（设置有电穿孔仪）在2ml无钙生长培养基中。对于实验中，需要较长的培育时间，过滤消毒溶液中，并储存在4℃。
- 吸出培养基，用无钙培养基洗细胞，小心不要划伤单层或干细胞。如果细胞是干他们通常有较深的细胞核，并拿起LY没有电。的效果是在它更多地暴露于空气气流（ 图4F）滑动的中间更加明显。
- 用Eppendorf移液器，吸管的染料溶液到细胞（400μl的整个腔室），在该腔室，b的边缘eing小心不要触摸细胞层。
- 放置室与电穿孔仪附带的支架，并应用适当的强度（见讨论）的脉冲。
- 小心吸一些LY解决方案。它可以重复使用的第二时间不太重要的实验。
- 加入含10％透析血清钙的DMEM。
- 孵育的细胞为3-5分钟，在培养箱中，以允许通过间隙连接的染料转移。
注：在这一点上列入透析血清帮助毛孔关闭。 - 与钙的DMEM活细胞观察洗未掺入的染料。备选地，细胞可以固定在该阶段，通过加入4％甲醛的井，然后用PBS（磷酸盐缓冲盐水）。在所有情况下，清洗必须移除所有背景。
注：在初步实验，以确定最佳的条件下，如果电压过低，则有可能让细胞恢复在incubator表示了几分钟，电穿孔的同一张幻灯片第二次来保存幻灯片的成本。
3，显微镜检查
- 观察细胞的荧光下照射，使用倒置显微镜配备有适当的过滤器的染料被使用。对于荧光黄，激励是423nm，发射555nm处，全身振动过滤器尼康IX70显微镜。
- 消除液面效应通过放置一个玻璃盖玻片上的塑料井的顶部，它填充到液体上方后，检查下相衬细胞形态。为更好的画面，以及可从滑动被分离，并在盖玻片放置在框架上。对于固定的细胞中，以及可填充有甘油的显微镜观察，而对于活细胞就必须充满生长培养基中。
注意：洗涤和拍摄是比较容易，如果下列染料（上述步骤2.7）的转移将细胞用甲醛固定。如果细胞是无吨固定，荧光从细胞取决于LY的介绍，而在固定的细胞的荧光被保持几个小时的细胞类型，电压和量消除内约60分钟。然而，荧光消失或O 2 / N孵化后消散，即便是在固定的细胞。出于这个原因，照片必须尽快电穿孔（ 图2）后采取。
4，定量间通讯
- 拍摄的细胞在荧光下，相位相反（见图3）20倍的目标。
- 识别并用星标记电 穿孔的细胞在边界与非电穿孔的区域（ 图2中 ，箭头，电穿孔边缘）。
- 识别并以点标记的荧光细胞上的非电穿孔的一侧，其中所述染料已通过间隙连接的传输（ 图3A和3B）。
- 除以总数通过电穿孔的细胞沿着边缘（ 图3A和3B）的数量的荧光细胞上的非电穿孔区域。
请注意：从至少200个连续的电穿孔的边缘细胞的转移计算每个实验。得到的数字是GJIC值。
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Representative Results
图2显示了大鼠肝脏上皮T51B细胞22，在荧光下（图A和B），电穿孔和LY和拍照，或相差（C）的照明，以下定影和水洗。在图A中，将电穿孔的区域的边缘被标记为红色。荧光的红色线右边的梯度表示通过间隙连接的传输。在图3A和图3B中 ，间隙连接通讯的定量表示：将细胞在电穿孔的区域的边缘被确定，并用星号标记，而其中的染料转移了细胞被标记为一个点。比值表明，染料转移到，每电穿孔的边缘细胞的细胞的平均数量。在这个例子中有57点和10星， 也就是说 ，细胞间隙连接通讯= 5.7。
在C和D，信号转导和转录激活因子-3（STAT3的）已经下调T51B细胞吨hrough稳定的siRNA表达慢病毒载体，这将导致在细胞间隙连接通讯的减少，如由转让22由于缺少。
图1：电穿孔电极和滑动组件。 （A）俯视图：使细胞生长在载玻片上，涂有导电性和透明的铟锡氧化物（ITO）。的塑料腔室贴合的滑动，从而形成一容器中的细胞和LY。该涂层是激光蚀刻在中间的直线，基本上形成两个电极。水坝是用来疏导电流上升，从而造成电场强度的急剧转变。提供非导电区域，在ITO也被蚀刻在两个矩形。电流（红色箭头）从脉冲发生器从每一个接触点到另一个流动，通过矩形之间的导电性公路，在直接扩频离子平行于中间屏障，然后用通过该介质的另一侧上的坝，电穿孔的细胞中的区域平行于该坝。为清楚起见，腔室的前部被去除（B）的侧视图。： 示与细胞上的ITO镀膜（浅绿）和蚀刻，裸玻璃区域生长的幻灯片。当含有LY的电介质被添加到腔室到坝（+）的高度，然后在电极之间的电路径和上面的水平（ - ），并将细胞在此区域生长，就形成了。注意，在ITO层被示为具有夸张的厚度为清楚起见，虽然它的实际厚度（800 A）是比单元厚度小得多（C）电穿孔和非电穿孔的细胞的区域被放大显示。该染料是致密附近，所有的细胞电穿孔和横跨电穿孔的边缘消失的坝作为浓度削弱通过多种间隙连接互感器ERS。大箭头示出通过间隙连接的染料转移的方向。需要注意的是该单元的尺寸和厚度被夸大为清晰起见， 请点击这里查看该图的放大版本。
图2电穿孔T51B的，大鼠肝脏上皮细胞 。 LY电转入T51B大鼠肝脏上皮细胞（轻度，12伏）。经过5分钟。孵育后，细胞在荧光（A，B）或相位反差（C）的照明拍摄。注意，通过间隙连接的广泛转移，通过荧光的梯度所示，从电穿孔的区域（箭头所示，红色线A）的边缘延伸。同时，存在于细胞中没有明显的损伤中，为S相差（C）所示。 请点击这里查看该图的放大版本。
图3：定量缝隙连接传输的 。这些细胞在电穿孔面积的回升LY通过电（LY的捐助者，非电穿孔细胞）的边缘被标有星号。细胞，其中LY转移到通过间隙连接是标有圆点。在（A）和（B）中 ，有57点和10星，也就是说 ，细胞间隙连接通讯= 5.7。在（C）和（D）的细胞没有间隙连接，如图所示由不存在荧光的梯度。箭头指向的电穿孔的区域的边缘。巴= 100微米。ES / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
已损坏的操作过程中刮图4（A）T51B细胞 。这些细胞可以拿起LY即使没有电穿孔和可能它通过间隙连接传送到它们的邻居（B）和（C）通过一个脉冲是太强受损的细胞（B）T51B大鼠肝脏上皮细胞进行电穿孔，在温和的环境，20伏。在所蚀刻的线（箭头）的左边的细胞已被破坏的电穿孔。在这种情况下，细胞不分离，但仔细看的相差照片（中间面板中，白色箭头）表示的单元有暗核，而它们发出荧光非常弱，如果在所有（顶板）。然而，转个粗间隙连接是显而易见的，是指并非电穿孔的右侧的单元格。底部的图片是由结合UV和相衬照明，以方便观看电穿孔的边缘。电穿孔在介质设置，30伏（C）的 T51B大鼠肝脏上皮细胞。在蚀刻线的左侧的细胞已通过脉冲被严重破坏。请注意如何细胞已经脱落，不发荧光。周围的边缘部分幸存者拾起LY并可能在上经由间隙连接传递到它们的邻居到右侧。电穿孔为10μg/ ml的碘化丙啶（D）T51B细胞。注意原子核的强染色。上皮细胞（E）圆顶。 T51B的细胞的电穿孔在温和的环境，15伏特。注意左边的连电的细胞。然而，汇合时，T51B细胞形成圆顶操纵和洗涤过程中可能会脱落，与周围的细胞可た磕了LY。注意广泛染料转移（F）已干燥可以拿起LY未经electroporation.The生长培养基中的细胞是从T51B的细胞和细胞中除去留在层流罩30分钟。 LY随后向细胞中加入1分钟和细胞随后固定，洗净，在荧光下（上图）和相位对比（下图）照明拍照。 请点击这里查看该图的放大版本。
图5中的Grb2-SH2阻断肽抑制在完整的，活细胞EGF介导的ERK的活化。结合细胞间隙连接通讯和信号转导研究，在配体结合，一些生长因子受体如表皮生长因子的建议eptor（EGFR）是在特定的酪氨酸残基的反式磷酸化。这些构成对接位点为信号转导，如Grb2的，它被绑定到的GTP / GDP交换因子SOS，因而它被带到膜和激活的Ras的src-同源性-2域。这导致活化的Raf / MEK / ERK级联和ERK磷酸化的的一名P骤 Ÿ序列。因此，与特定的磷酸化的Erk抗体探测可激活EGF受体的量度。下列固定术，细胞被探测用抗PERK抗体（细胞信令）中，随后与生物素偶联的二抗，链霉亲和马-萝卜过氧化酶和二氨基联苯胺底物，它给出一种棕色的颜色29。在该实验中，磷酸化阻断的Grb2-SH2结构域（PVPE P Y [INQS）通过原位电穿孔导入ıNTO NIH 3T3细胞中的电商会和不断增长的增长被捕的花中。经过5分钟的脉冲应用中，细胞用EGF 5分钟，固定，从同一字段下明场（顶部）或相位反差（底部）照明拍摄探查活化的磷酸化ERK1 / 2通过免疫过氧化物酶stainingand细胞。请注意的Grb2-SH2封闭肽大大降低了表皮生长因子的信号， 即 ERK的磷酸化（ 区 ）。信号的抑制伸入〜3-4行相邻小区中的非电穿孔区域（弯曲的支架），可能是由于在1123沓肽通过间隙连接的移动。这一发现构成了令人信服的证据表明，所观察到的抑制应该是由于肽，而不是电的工件，因为细胞在这方面没有收到任何电流，但获得从他们的邻居的肽。同时，存在于细胞形态没有可检测的效果相差所示。箭头指向的电穿孔的区域的边缘。放大倍率：240X。欲了解更多详细信息和控制见参考文献29。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
在协议中的关键步骤
电穿孔材料
该材料的纯度被电穿孔是非常重要的。如果细胞是非常平坦的，则高浓度的示踪染料必须使用（不超过20毫克/毫升为LY），并在这种情况下，纯度，甚至比在细胞有更多的球状1更为重要。除LY大量的各种其它染料或nonpermeant分子已被采用，例如为一系列的Alexa染料作为探针的通道由不同的连接蛋白25的使用。然而，染料，如溴化乙锭或碘化丙啶被插在DNA中，使细胞核荧光非常强，这使得染料转移更困难（ 图4D）的定量分析。跟踪染料必须准备和洗涤液中的钙的无生长培养基中进行的，因为钙离子内流可能中断连接通讯，以及减少大公升生存能力。所有的解决方案必须保持在37℃之前，电穿孔，这有利于毛孔闭合和活力1。
最佳的电压和电容的测定
电场强度是对细胞的渗透，以及存活率的关键参数。多个脉冲的应用已经显示出提供了在渗透和细胞存活率比单个脉冲而言更好的结果。细胞工程的原位穿孔器装置具有三种设置电容和脉冲数：轻度（10个脉冲，10微秒间隔，脉冲间为0.1秒），中（20个脉冲，80微秒间隔，脉冲间为0.2秒）和强（50个脉冲，120微秒间隔，脉冲之间，0.5秒），而该电压可以被精细地独立地（2-45V控制）。事实上，扁平细胞需要更低的电压转换比那些细胞在一丛或细胞小粘接面积的基质（ 如昆虫Sf9细胞），可能是由于通过延长的细胞，其与一个较大的导电区域接触的较大量的电流流通的。有关此主题的详细信息，请参阅1。
可能出现的问题和故障排除
如果细胞已在该操作被刮下，它们可以拿起染料和荧光没有电穿孔（ 图4A）。能量传递到细胞的量会影响电穿孔的效率。如果脉冲过弱（ 即 ，太低的电压和脉冲设置），然后将细胞出现在相位对比正常，但他们不也许除了对某些细胞可以是死的或操纵期间被擦荧光，（ 图4A） 。如果脉冲过强，相衬细胞下出现有非常深的细胞核（ 图4B），但可能保留一些LY，甚至允许一些染料转移到相邻小区。在前夜Ñ 更高的脉冲的细胞被破坏（ 图4C）。例如细胞裂解，因此它们不保留LY和荧光非常弱，如果在所有。某些上皮细胞系如T51B形式拱顶结构，该结构可在介质的变化来关闭。然后周围的细胞可发荧光的染料可以通过间隙连接（ 图4E）被转移。的最佳电穿孔条件为代表线路的例子示于表1中 。
优于其他技术和意义
DNA导入
有大量的转染方案，如磷酸钙共沉淀26或不同类型的脂质体。然而，它们可能会影响可能是非常重要的，特别是对于信号转导研究中微妙的方式的小区。例如，信号转导子和转录激活子的TYR-705的磷酸化离子-3（Stat3的），其相关联，其转录活性，即使在不存在DNA的显着地增加了磷酸钙转染的方法。这可能是由于该沉淀改变细胞对细胞粘附和钙粘蛋白参与，公知的Stat3的活化剂27的事实。某些脂质体也有类似的，但不太明显的效果，而电或反转录病毒感染并不影响Stat3的水平6。
肽的介绍
一种常见的方法是融合肽与诸如衍生自HIV-tat基因序列，其穿过细胞膜，施工。但是，通过膜的转移是一个相对缓慢的过程，并且信号的抑制效率不高。对于由一个配位体发生以下受体激活的事件的序列的研究，能够即时介绍的肽，肽模拟物或其它化合物提供了一个重要的advantagê。细胞渗透肽，以加速其吸收的电穿孔是不可能的，可能是因为亲脂肽被嵌入到细胞膜，作为显示用FITC-偶联的肽（Raptis，未发表）。有趣的是注意到，ERK活化由EGF通过使用细胞渗透性肽阻断例如的Grb2-SH2结构域的抑制，只有部分28，而在同一肽的电穿孔所取得的信号29的完全抑制（ 图5）。其它技术，基于脂质体也存在。然而，它们不允许未经处理的细胞并排治疗者的检查，在有间隙连接的研究相结合，它可以提供最强烈的示范的信号抑制必定是由于该材料被引入（ 图5，弯弯曲曲的托架，C）。
缝隙连接的研究
显微注射染料或铲装都普遍采用，但他们都不约而同地推出细胞损伤。光漂白后的另一种技术，荧光恢复不是侵入性的，但它需要昂贵的设备，和少数细胞可以被检查的时间，而光毒性物质的形成可能是一个问题。降落伞试验包括预载细胞色素钙黄绿素AM（绿色），然后让细胞粘附到细胞层，如缝隙连接在15分钟内，3小时形成。大量的细胞可以以这种方式进行处理，但细胞以形成间隙连接在该测定中的能力的细胞类型30有很大差别。
限制
所需要的电压是为采用更大的尺寸和电荷的分子的更高。在需要引入的大质粒的高电压时，可能有一些细胞死亡。需要不同的分子的相对电压先前已经9,12描述。虽然我们使用特定的电穿孔装置，描述了电穿孔，有可能某人经历与电器，使其使用的详细描述，在19，或使一个较简单的设置与上述的电池的顶电极，并蚀刻用酸1。
未来的方向
软件已经开发了能够精确量化GJIC 31。进一步的改进是，荧光只有一旦他们在细胞内，因此，没有必要清洗未掺入的染料的量子点的发展。这避免了洗涤的应力，而这个过程可以在现场，不固定的细胞进行实时观察。肽的引入中断信号通路是一个功能强大的方法进行体内评估用纯化的成分鉴定相互作用的相关性。锅的检查不同肽无穷区间来抑制特定的途径是在肽药物发展的第一个重要步骤，为合理治疗肿瘤的。
其他意见
幻灯片可以用小画笔来达到在该井在ITO表面进行洗涤EXTRAN-1000溶液，并用水漂洗。如果细胞已被固定在滑动时，可能有必要先除去蛋白质的痕迹，用胰蛋白酶或其它蛋白酶。必须避免的十二烷基硫酸钠含有洗涤剂。洗涤载玻片进行杀菌用过氧化气体。然而，这是非常重要的，以避免破坏井的密封件上滑动，因为如果在保持器的任何LY溶液的泄漏，可能会引起短路。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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