Introduction
היישום של זרם חשמלי לתא גורם להיווצרות של נקבוביות על קרום התא, על ידי electroporation תהליך המכונה. הנקבוביות לאפשר המעבר של מגוון רחב של מולקולות nonpermeant דרך הממברנה. השדה החשמלי ניתן לשלוט במדויק, כך שנקבובי שנוצרו הם קטנים מאוד וreclose במהירות, עם הפרעה מינימאלית לפיסיולוגיה התאית. מעניין, ניתן לגדל תאים חסיד בשקופית זכוכית מצופה בתחמוצת מוליך ושקופה אינדיום פח (איטו) וelectroporated באתר, שעל פני השטח שבו הם גדלים, ללא ניתוק להיות electroporated בהשעיה. תאים יכולים לגדול היטב על פני השטח זה, וכפי שהם מחוברים והאריכו, התצפית מיקרוסקופית מפורטת אפשרית. שימוש בטכניקה זו, יכולה להיות הציגו מולקולות nonpermeant קטנות באופן מיידי ולמהות 100% מהתאים, מה שהופך את הטכניקה זו מתאימה במיוחד למחקרים על ההפעלה של components של מסלול בעקבות הגירוי ליגנד של קולט (שנסקר ב1).
Electroporation כבר בשימוש בעיקר עבור כניסתה של DNA (electrotransfection המכונה גם). עם זאת, electroporation באתר יכול להיות בעל ערך עבור כניסתה של מגוון רחב של מולקולות, כגון פפטידים 2-4, oligonucleotides, כגון RNA antisense, oligonucleotides פעמיים תקועים דמה DNA לעכב גורם שעתוק מחייב, או siRNA 3,5, 6 נוקלאוטידים, רדיואקטיבי 7-10, חלבוני 11 12 או בעד סמים 13. בעקבות electroporation, ניתן lysed תאים עבור ניתוחים ביוכימיים או קבוע ומוכתם עם נוגדנים.
ציפוי איטו המוליך הוא דק מאוד, 800-1,000Å, כך שצמיחת תאים אינה מופרעת על ידי ההבדל בגובה של שני משטחים, כתאים לגדול מעבר לקצה של ציפוי המוליך. זו מציעה את היתרון שאינו electropניתן לגדל תאים נאמו לצד אלה electroporated, שישמשו כבקרה. אותה הגישה יכולה לשמש לבחינת הפער junctional, תקשורת בין תאית (GJIC), כפי שמתוארת בווידאו.
צמתים פער הם ערוצים המחברים את הפנים של תאים סמוכים 14. פער junctional, תקשורת בין תאית משחקת תפקיד חשוב בהיווצרות גידולים וגרור, ואילו אונקוגנים כגון Src לדכא GJIC 15,16. כדי לבחון GJIC צבע ניאון כגון צהוב לוציפר (LY) הוא הציג לעתים קרובות לתוך תאים בתרבית באמצעות microinjection או לגרד טעינה 17 ודיפוזיה של הצבע לתוך תאים שכנים הוא ציינה מיקרוסקופי תחת תאורת פלואורסצנטי. טכניקות אלו אולם תמיד לגרום נזק לתאים. עכשיו אנו מתארים טכניקה שבה תאים גדלים בשקופית זכוכית שמצופית בחלקו עם איטו 18. דופק חשמלי היה מוחל בנוכחות LY (או צבעים אחרים) caבאמצעות החדירה שלה לתאי גידול בחלק המוליך של השקופית, ואילו הגירת צבע לתאים הסמוכים, שאינו electroporated נצפתה מיקרוסקופית באמצעות תאורת פלואורסצנטי. כדי להימנע מתאים רגישים מטרידים שעשויות נוטים להתנתק מmonolayer, הרכבה תוכננה שלא דורשת אלקטרודה שממוקמת על גבי התאים ליישם את 19 הזרם החשמלי. גישה זו מציעה את היכולת לכמת GJIC במספר גדול של תאים, ללא כל הפרעה לגילוי לחילוף חומרים תאיים, כפי שצוינה על ידי בהעדר השפעה על אורכו של שלב G1 בעקבות גירוי סרום 12, להגדיל ברמות של FOS חלבון protooncogene (Raptis, לא פורסם) או שני קינאז הקשורים ללחץ סלולארי, חזיר p38 או JNK / SAPK קינאז 1. גישה זו התאפשרה הבדיקה של הקשר בין רמות ביטוי אונקוגן, השינוי וGJ18 IC, כמו גם את ההשפעה של Src וSTAT3 על GJIC במגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאים טריים תרבותיים מדגימות גידול ריאות 20-23. בנוסף, באתרו electroporation עם ההתקנה תוארה שאין בו אלקטרודה עליונה כבר מועסק בהצלחה להפגנה של סגירת צומת פער על בידול adipocytic, למרות שקובץ מצורף סלולארי למצע מצטמצם בשלב ש19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 ציפוי התאים בלשכות Electroporation
- במינרית זרימת מכסה המנוע, trypsinize התאים באמצעות טכניקה סטרילית כרגיל.
הערה: חשוב מאוד לחסל על ידי צנטריפוגה כל העקבות של טריפסין, משום שהם עלולים לעכב התפשטות התאים על הזכוכית, ומכאן ההיווצרות של adherens וצמתים פער. - 1 פיפטה מ"ל של ההשעיה התא בתאי electroporation סטרילי מסופקים עם בelectroporator אתרו (איור 1), ומקום בC 37 o, CO 2 באינקובטור.
הערה: הידבקות תא ניתן לשפר על ידי ציפוי על פיברונקטין, קולגן, פולי ליזין או דבק תאים ורקמות (ראה לוח חומרים). - כאשר התאים יצרו שכבה ומחוברות הם מוכנים לבחינת GJIC.
.2 Electroporation נוהל
Electroporation לבדיקת GJIC יכולה להתנהל מחוץ למינרית זרימת מכסה המנוע,מאז זה לוקח רק כמה דקות. אם פעמים דגירה ארוכות יותר נדרשות לניסוי ספציפי, אז זה יכול להיות שנערך כולו בעלעלי זרימת מכסה המנוע. בכל המקרים, התאים שבו התאים גדלים חייבים להיות סטרילי.
- הכן / פתרון צהוב לוציפר 5 מ"ג מ"ל: ממיסים אבקת 10 מ"ג LY (מסופקת עם electroporator) ב2 מ"ל מדיום גידול ללא סידן. בניסויים שדורש פעמים דגירה ארוכות יותר, מסנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס
- לשאוב את מדיום הגידול ולשטוף את התאים עם מדיום ללא סידן, נזהר שלא לשרוט את monolayer או לייבש את התאים. אם התאים מיובשים יש להם בדרך כלל גרעינים כהים יותר ולהרים LY ללא electroporation. ההשפעה בולטת יותר באמצע השקופית שיותר חשופה לטיוטות אוויר (איור 4F).
- עם pipettor אפנדורף, פיפטה פתרון הצבע לתאים (400 μl לכל התא), בקצה של החדר, being נזהר שלא לגעת בשכבת התאים.
- מניחים את החדר בבעל שסופק עם electroporator ולהחיל דופק של הכוח המתאים (ראה דיון).
- זהירות לשאוב חלק מפתרון LY. זה ניתן לעשות שימוש חוזר בפעם שנייה לניסויים פחות חשובים.
- להוסיף ללא DMEM סידן המכיל סרום 10% dialysed.
- דגירה התאים עבור 3-5 דק 'בחממה על מנת לאפשר העברת צבע דרך צמתים פער.
הערה: ההכללה של סרום dialysed בשלב זה מסייעת סגירה נקבובית. - שטוף את הצבע מאוגדים עם ללא DMEM סידן להתבוננות תא חי. לחלופין, ניתן לתקן תאים בשלב זה, באמצעות התוספת של פורמלין 4% לטובים, ואז שטף עם PBS (פוספט שנאגרו מלוח). בכל המקרים הכביסה חייבת להסיר את כל הרקע.
הערה: בניסויים ראשוניים כדי לקבוע את התנאים אופטימליים, אם המתח נמוך מדי, אז זה אפשרי לתת לתאים להתאושש בincubator לכמה דקות וelectroporate אותה השקופית פעם שנייה, כדי להציל את בעלות של שקופיות.
.3 מיקרוסקופי בדיקה
- שים לב לתאים תחת תאורת הקרינה, שימוש במיקרוסקופ הפוך מצויד במסנן המתאים לצבע בשימוש. לוציפר הצהוב, עירור הוא 423nm, 555nm פליטה, מסנן WBV למיקרוסקופ Nikon IX70.
- לחסל את השפעות המניסקוס על ידי הצבת כיסוי להחליק זכוכית על גבי הפלסטיק היטב, לאחר המילוי אותו לחלק העליון עם נוזל, לבחון מורפולוגיה של תאים תחת ניגוד שלב. לתמונות טובות יותר, גם יכול להיות מנותק מהשקופית, וcoverslip מונח על המסגרת. לתאים קבועים, גם יכול להיות מלא עם גליצרול להסתכלות מיקרוסקופית, ואילו לתאים חיים הוא חייב להיות מלא במדיום גידול.
הערה: כביסה וצילום הוא קלה יותר אם התאים קבועים עם פורמלדהיד בעקבות ההעברה של הצבע (שלב 2.7 לעיל). אם התאים לאt קבוע, הקרינה מסולקת מהתאים בתוך כ 60 דקות בהתאם לסוג התא, המתח וכמות LY הציג ואילו בתאים קבועים הקרינה נשמרת למשך מספר שעות. עם זאת, הקרינה דועכת או מתפוגגת לאחר הדגירה O / N, אפילו בתאים קבועים. מסיבה זו, צילומים חייבים להיות מצולמים בקרוב לאחר electroporation (איור 2).
.4 Quantitation של תקשורת בין תאית
- לצלם את התאים עם מטרת 20x תחת הקרינה וניגוד שלב (איור 3).
- לזהות ולסמן בכוכב את תאי electroporated בגבול עם האזור-electroporated שאינו (איור 2, חץ, קצה electroporation).
- (איורים 3 א ו 3 ב) לזהות ולסמן עם נקודת תאי fluorescing בצד הלא electroporated, שבו הצבע העביר דרך צמתים פער.
- מחלקים את המספר הכולל שלfluorescing תאים באזור-electroporated שאינו במספר תאי electroporated לאורך הקצה (איורים 3 א ו 3 ב).
הערה: ההעברה מלפחות 200 תאי גבול electroporated רציפים מחושבת עבור כל ניסוי. המספר שהתקבל הוא ערך GJIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מראה תאי כבד החולדה T51B אפיתל 22, electroporated עם LY וצילמו מתחת לקרינה (פנל וארוחת בוקר), או שלב בניגוד תאורה (C), הבאים קיבעון וכביסה. בפנל, בקצה אזור electroporated מסומן באדום. השיפוע של הקרינה בצד הימין של הקו האדום מציין העברה דרך צמתים פער. באיור 3 א ו 3 ב, לכמת את תקשורת junctional הפער מוצג: התאים בקצה אזור electroporated זוהו וסומנו בכוכב, ואילו תאים שבהם הצבע העביר היו מסומנים בנקודה. היחס מציג את המספר הממוצע של תאים שהצבע הועבר ל, לכל תא גבול electroporated. בדוגמא זו יש 57 נקודות ו10 כוכבים, כלומר, GJIC = 5.7.
ב C ו D, מתמר האותות וActivator של תמלול-3 (STAT3) כבר downregulated בt תאי T51Bביטוי hrough יציב siRNA עם וקטור lentiviral, וזה גורם לירידה בGJIC, כפי שמוצג על ידי absense של העברה 22.
איור 1 אלקטרודה Electroporation והרכבת שקופיות. () יכול לצפות בלמעלה: תאים גדלים בשקופית זכוכית, מצופים בתחמוצת מוליך ושקופה אינדיום פח (איטו). תא פלסטיק הוא ערובה לשקופית, כדי ליצור מיכל לתאים וLY. הציפוי הוא בקו ישר באמצע, בעצם יוצרים שתי אלקטרודות לייזר חרוט. סכר משמש להסיט כלפי מעלה הנוכחיים, ובכך ליצור מעבר חד בעוצמת שדה חשמלית. על מנת לספק שטחים שאינם מוליכים, איטו גם חרוט בשני מלבנים. (חצים אדומים) זרם מגנרטור הדופק זורמים מכל נקודת מגע לאחר, באמצעות כביש מוליך בין המלבנים, מתפשטים בישיריון במקביל למחסום האמצעי, אז על הסכר דרך המדיום לצד השני, electroporating התאים באזורים במקביל לסכר. לשם בהירות, החלק הקדמי של התא מוסר מבט צד (B).: השקופית עם התאים גדלו על איטו (אור הירוק) מצופה ואזורי זכוכית חרוטים, חשופים מוצגת. כאשר מדיום electroporation מכיל LY מתווסף לחדר לרמה מעל הגובה של הסכר אז נתיב חשמלי בין האלקטרודות (+) ו( -), ותאי גידול באזור זה, נוצר. שים לב ששכבת איטו מוצגת עם עובי מוגזם לבהירות למרות שהעובי שלה בפועל (800) הוא הרבה פחות מהעובי של התאים. (C) השטח של תאי electroporated electroporated ולא מוצג מוגדל. הצבע הוא צפוף ליד הסכר שבו כל תאי electroporated ונמוג על פני קצה electroporated כריכוז מחליש דרך transf צומת פער מרובהERS. חצים גדולים להראות את הכיוון של העברת צבע דרך צמתים פער. שים לב שהגודל והעובי של התאים מוגזמים לבהירות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 Electroporation של T51B, תאי האפיתל כבד חולדה. LY היה electroporated לתוך תאי T51B כבד החולדה אפיתל (קל, 12 וולט). בעקבות 5 דקות. דגירה, תאים צולמו תחת הקרינה תאורה (A, B) או בניגוד שלב (C). שים לב להעברה הנרחבת דרך צמתים פער, שמוצגת על ידי השיפוע של הקרינה, המשתרעת מקצה שטח electroporated (החיצים, קו אדום ב). בה בעת, אין נזק נראה לעין לתאים, s ראה תחת שלב בניגוד (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Quantitation .3 איור של העברת צומת פער. התאים בקצה אזור electroporated שהרים LY ידי electroporation (תורמים של LY לתאי electroporated לא) סומנו בכוכב. תאים שבי LY מועבר לתוך צמתים פער באמצעות סומנו בנקודה. ב (א) ו (ב), יש 57 נקודות ו10 כוכבים, כלומר, GJIC = 5.7. תאים ב( C) ו( ד) אין לי צמתים פער, כפי שמוצגים על ידי העדר שיפוע של הקרינה. חיצים מצביעים על קצה שטח electroporated. בר = 100 מיקרומטר.es / ftp_upload / 51,710 51710fig3highres.jpg "target =" / _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תאי .4 T51B () איור שניזוקו על ידי גירוד במניפולציה. תאים אלה יכולים להרים LY גם ללא electroporation ועלולים להעביר אותו לשכנים שלהם דרך צמתים פער. (B) ותאים (C) שנפגעו בדופק כי הוא חזק מדי. תאי האפיתל כבד החולדה T51B (ב) היו electroporated בהגדרה קלה , 20 וולט. התאים בצד השמאל של הקו חרוט (חץ) ניזוקו על ידי electroporation. במקרה זה התאים לא לנתק, אך מבט מקרוב על תצלום ניגוד השלב (פנל באמצע, חץ לבן) מציג את התאים שיש גרעינים כהים, תוך שהם לזרוח מאוד חלשים, אם בכלל (הפנל העליון). עם זאת, להעביר הצמתים פער גסים ניכר, לתאים בצד ימין שאינם electroporated. התצלום התחתון נעשה על ידי שילוב של UV ותאורה בניגוד שלב, כדי להקל על צפייה של הקצה של electroporation. תאי האפיתל של כבד (C) T51B עכברוש electroporated בהגדרה בינונית, 30 וולט. התאים בצד השמאל של הקו חרוט ניזוקו קשות על ידי הדופק. שים לב איך שהתאים יורדים ולא לזרוח. חלק מהניצולים מסביב לקצה שהרימו LY ואשר נראו כי העברתו לשכניהם מימין דרך צמתים פער. תאי T51B (D) electroporated עם 10μg / מ"ל יודיד Propidium. שים לב לצביעה האינטנסיבית של הגרעינים. (E) כיפות של תאי האפיתל. תאי T51B electroporated בהגדרה עדינה, 15 וולט. שים לב גם electroporation של תאים בצד השמאל. עם זאת, כאשר מחוברות, תאי T51B ליצור כיפות שעשויות לרדת בזמן מניפולציה ושטיפה, והתאים המקיפים רשאי ת"אKe עד LY. שים לב להעברת הצבע הנרחב. תאים (F) שהתייבשו יכול להרים LY ללא electroporation.The מדיום גידול הוסר מתאי T51B ותאים נשארו במינרית זרימת מכסה המנוע ל30 דקות. LY היה שיצטרף בעתיד לתאי דקות 1 ותאים היו קבועים לאחר מכן, שטפו וצילמו מתחת לקרינה (פנל עליון) או שלב בניגוד (פנל תחתון) תאורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 פפטיד חסימת Grb2-SH2 מעכב הפעלת Erk תיווך EGF בתאים שלמים, חיים. שילוב של לימודי GJIC והעברת אותות. בעקבות יגנד המחייב, מספר הקולטנים גורם גדילה כגון עוריות Growth Factor Receptor (EGFR) הוא טרנס פוספורילציה על שאריות טירוזין ספציפיות. אלה מהווים אתרי עגינה עבור SRC-הומולוגיה-2 תחומים של מתמרים אות כגון Grb2, שהוא חייב sos הגורם חילופי GTP / התמ"ג, אשר ובכך הוא הביא לי הקרום ומפעיל ראס. התוצאה היא ההפעלה של מפל Raf / Mek / Erk וזירחון של Erk ברצף P TE P Y. לכן, חיטוט עם נוגדני phospho-Erk ספציפיים יכול להיות מדד להפעלה של הקולטן EGF. בעקבות קיבעון, תאים מששו עם נוגדן אנטי הטבה (איתות תא), ואחריו נוגדן בשילוב ביוטין המשני, לסוסים-הצנון streptavidin peroxidase ומצע diaminobenzidine, אשר נותן צבע 29 חום. בניסוי זה, phosphopeptide חסימת תחום Grb2-SH2 (PVPE p Y INQS) הוצג על ידי בelectroporation האתר iתאי n כדי NIH 3T3 גדלו בתאי electroporation וצמיחה נעצרו במדיום בילה. 5 דקות לאחר יישום דופק, תאים היו מגורה עם EGF למשך 5 דקות, קבוע, חקרו למופעל phospho-Erk1 / 2 על ידי תאי stainingand אימונו-פרוקסידאז מאותו השדה שצולם תחת brightfield (למעלה) או בניגוד שלב תאורה (בחלק תחתון). שים לב שפפטיד חסימת Grb2-SH2 דרמטי הפחית את אות EGF, כלומר, זירחון Erk (אזור). העיכוב של האות משתרע לתוך ~ 3-4 שורות של תאים סמוכים באזור שאינו electroporated (משורבט סוגר), כנראה עקב תנועה של פפטיד דה 1,123 דרך צמתים פער. ממצא זה מהווה ראיה חותכת לכך שהעיכוב שנצפה חייב להיות בגלל פפטיד, ולא תוצר של electroporation, שכן תאים באזור זה לא קיבלו שום נוכחי, אבל רכשו את הפפטיד משכניהם. בה בעת, אין כל השפעה לגילוי על מורפולוגיה של תאים כמוצג על ידי ניגוד שלב. חץ מצביע על קצה שטח electroporated. הגדלה: 240x. לפרטים ובקרות נוספים, ראו התייחסות 29. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
חומר Electroporated
טוהר של החומר המיועד לelectroporated הוא מאוד חשוב. אם התאים מאוד שטוחים, ריכוזים אז גבוהים יותר של צבע המעקב חייבים להיות בשימוש (עד 20 מ"ג / מ"ל לLY) ובמקרים כאלה, טוהר חשוב עוד יותר מאשר בתאים עם צורה כדורית יותר 1. חוץ LY מגוון גדול של צבעים אחרים או מולקולות nonpermeant להיות מועסק, כגון סדרה של צבעי Alexa להשתמש כמו בדיקות לערוצים בהיקף של connexins שונה 25. עם זאת, צבעים כגון Ethidium ברומיד או יודיד Propidium הם intercalated בDNA כדי שהגרעינים לזרוח בצורה חזקה מאוד, מה שהופך את לכמת את העברת צבע קשה יותר (איור 4D). צבעי המעקב חייבים להיות מוכנים ושוטפים שנערכו במדיום גידול ללא סידן, משום שזרם סידן עלול להפריע לתקשורת junctional, כמו גם להפחית celכדאיות l. כל הפתרונות חייבים להישמר על 37 o C לפני electroporation, המאפשר סגירה נקבובית ו1 כדאיות.
קביעת המתח והקיבול האופטימלי
עוצמת שדה חשמלית היא פרמטר קריטי לחלחול תא, כמו גם יכולת קיום. היישום של פולסים מרובים הוכח להציע תוצאות טובות יותר במונחים של חלחול וכדאיויות תא מאשר דופק יחיד. מנגנון Insitu Porator של פרויקטים תא יש שלוש הגדרות לקיבול ומספר דופק: קל (10 פעימות, 10 מלבד מייקרו-שניים, 0.1 שניות בין פולסים), בינוני (20 קטניות, 80 מלבד מייקרו-שניים, 0.2 שניות בין פולסים) וחזקות (50 פולסים , 120 מייקרו-שניות בנפרד, 0.5 שניות בין פולסים), בזמן שהמתח יכול להיות נשלט היטב באופן עצמאי (2-45V). למעשה, תאים שטוחים דורשים מתח נמוך יותר מאלה ששינו, תאים בגוש או תאים עם שטח הדבקה קטן לתשתית (למשל, תאי החרקים SF9), ככל הנראה בשל סכומים החולפים הנוכחיים הגדולים יותר דרך תא מורחב שנמצא במגע עם אזור מוליך גדול יותר. לפרטים נוספים בנושא זה, ראה 1.
בעיות ופתרון בעיות פוטנציאליות
אם התאים כבר גירדו במהלך המניפולציות, הם עשויים להרים את הצבע ולזרוח ללא electroporation (איור 4 א). כמות האנרגיה מועברת לתאים משפיעה על היעילות של electroporation. אם הדופק חלש מדי (כלומר, מתח נמוך מדי והגדרות דופק), אז התאים נראים תקינים תחת ניגוד שלב, אבל הם לא לזרוח, מלבד אולי לתאים מסוימים שעשויה להיות מתים או שגרדו במהלך המניפולציה (איור 4 א) . תופיע אם הדופק חזק מדי, תחת תאי ניגוד שלב יש גרעינים כהים מאוד (איור 4), אך היא עשויה לשמור כמה LY, ואף לאפשר לחלק מהעברת צבע לתאים שכנים. בערבn פולסים גבוהים יותר התאים נהרסים (איור 4C). תאים אלה הם lysed, ולכן הם אינם שומרים LY ולזרוח מאוד חלש, אם בכלל. קווים מסוימים אפיתל תאים כגון מבני כיפת טופס T51B אשר עשוי לרדת בזמן שינויים בינוניים. תאים המקיפים את יכולים אז לזרוח כצבע ניתן להעביר דרך צמתים פער (איור 4E). דוגמאות לתנאי electroporation אופטימליים לקווי נציג מוצגות בטבלה 1.
יתרונות על פני שיטות ומשמעות אחרות
מבוא DNA
יש מספר גדול של פרוטוקולי transfection, כגון שיתוף משקעים סידן פוספט 26 או מיני יפוזומים שונים. עם זאת, הם עשויים להשפיע על התאים בדרכים עדינות שעשויות להיות חשובים מאוד, במיוחד ללימודים הולכים אותות. לדוגמא, זירחון Tyr-705 של מתמר האות וactivator של תמליליון-3 (STAT3) אשר בקורלציה עם פעילות תעתיק שלה גדלו באופן דרמטי על ידי ההליך של transfection סידן פוספט גם בהיעדרו של DNA. זה יכול להיות בגלל העובדה שהמשקע משנה תא להידבקות תא ואירוסי cadherin, activator STAT3 ידוע 27. היו לי יפוזומים מסוימים אפקט דומה אך פחות בולט, בעוד electroporation או זיהום retroviral לא השפיע על רמות STAT3 6.
כניסתה של פפטידים
שיטה נפוצה היא הבנייה של פפטיד התמזגות עם רצפים החוצים את קרום התא, כגון נגזר מגן HIV-מידה. עם זאת, ההעברה דרך הקרום היא תהליך איטי יחסית ועיכוב אות אינו יעיל כ. לצורך המחקר של הרצף של אירועים המתרחשים הפעלת קולט הבאה על ידי ליגנד, היכולת להקדמה מיידית של פפטיד, peptidomimetic או אחר מתחם מציעה advantag חשובדואר. Electroporation של פפטיד תא חדיר כדי להאיץ את ספיגת שלו היא לא אפשרית, סביר להניח כי פפטיד lipophilic מוטבע לתוך קרום התא, כפי שנחשף בפפטידים מצמידים FITC (Raptis, לא פורסם). זה מעניין לציין כי העיכוב של הפעלת Erk ידי EGF באמצעות פפטיד החדיר תא חוסם תחום Grb2-SH2 למשל, היה חלקי בלבד 28, בעוד electroporation של אותו פפטיד השיג עיכוב של האות 29 מלא ( איור 5). טכניקות אחרות, המבוססות על יפוזומים גם הן בקיום. עם זאת, הם אינם מאפשרים הבחינה של צד תאים שלא טופל על ידי צד עם אלה שטופלו, בשיתוף עם מחקרי צומת פער, אשר יכולה להציע ההפגנה האפשרית החזקה ביותר שעיכוב האות חייב להיות בגלל שהוצגו החומר (איור 5, משורבט סוגר , ג).
מחקרי צומת גאפ
Microinjectionשל צבעים או לגרד טעינה בדרך מועסקים, אבל הם תמיד להציג את הנזק לתאים. טכניקה נוספת, התאוששות הקרינה לאחר photobleaching לא פולשנית אבל זה דורש ציוד יקר, וניתן לבחון כמה תאים בכל פעם, בעת היווצרותם של חומרי phototoxic עשויה להיות בעיה. Assay המצנח מורכב של תאים טרום טעינה עם AM calcein הצבע (הירוק), ואז לתת לתאים לדבוק על שכבת תאים, כצומת פער יוצרים בתוך 15 דקות-3 שעות. מספר גדול של תאים יכול להיות מטופלים בדרך זו, אבל היכולת של התאים ליצירת צמתים פער בassay זה משתנה מאוד בהתאם לסוג התא 30.
מגבלות
המתח הנדרש הוא גבוה יותר עבור כניסתה של מולקולות בגודל גדול יותר ומטענים חשמליים. במתחים גבוהים הנדרשים לכניסתה של פלסמידים גדולים, ייתכן שיש כמה מוות של תאים. המתח היחסי הנדרש למולקולות שונותתוארו בעבר 9,12. למרות שאנו מתארים את electroporation באמצעות מנגנון electroporation ספציפי, זה אפשרי עבור מישהו מנוסה עם מכשירי חשמל כדי לעשות את זה באמצעות התיאור מפורט ב19, או להפוך את התקנה פשוטה עם אלקטרודה עליונה מעל התאים, ולחרוט עם חומצות 1.
כיוונים עתידיים
תוכנה פותחו על מנת לכמת באופן מדויק ביום 31 בGJIC. שיפור נוסף הוא הפיתוח של נקודות קוונטיות שלזרוח רק ברגע שהם נמצאים בתא, כך שאין צורך לשטוף את הצבע שאינו מאוגד. זה ימנע את הלחץ של כביסה, ואילו ניתן לצפות בתהליך בתאים חיים, אינו קבועים בזמן אמת. כניסתה של פפטידים להפריע מסלולי איתות היא גישה רבת עוצמה להערכת vivo של הרלוונטיות של אינטראקציות שזוהו תוך שימוש ברכיבים מטוהרים. הבדיקה של הסירential של פפטידים שונים כדי לעכב מסלול ספציפי הוא הצעד הראשון חשוב בפיתוח תרופות peptidomimetic, לטיפול הרציונאלי של גידולים.
תגובות אחרות
ניתן לכבס את השקופיות עם Extran-1000 פתרון באמצעות מכחול קטן להגיע אל פני השטח איטו בבאר, ושטפה במים. אם התאים תוקנו בשקופית, זה עשוי להיות נחוץ כדי להסיר עקבות של חלבון עם טריפסין או באנזימי מפרקי חלבונים אחרים ראשונה. יש להימנע מחומרי ניקוי המכילים נתרן Dodecyl סולפט. ניתן לעקר שקופיות נשטפות עם גז חמצן. עם זאת, זה מאוד חשוב כדי למנוע שבירת החותם של היטב לשקופית, כי אם כל הדלפות פתרון LY בבעל שהוא עשויה לגרום לקצר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M.
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L.
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H.
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P.
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
